Biotécnicas aplicadas a reprodução animal Cap. 10-11

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tos.Equipamentosdefotoevídeodocumen-
taçãopodemseressenciaisparaalgunstra-
balhosdepesquisa.
Capeladefluxolaminarérequeridapara
asmanipulaçõesdemeioseplacasdeculti-
vos,evitandoa contaminaçãoambiental.É
importantealertareorientarparaqueseefe-
tuem,sempreque necessário,trocasdas
membranasfiltrantesdo fluxolaminar,po-
dendoseravaliadasperiodicamenteporafe-
riçõesdonúmerodepartículas.O osmôme-
troeo medidordepH sãoaparelhosimpor-
tantesno controleda qualidadedosmeios
preparadosno laboratório.O laboratório
devepossuirrefrigeradores,congeladores
comcapacidadedetemperaturade-20°Ce
de-70°C,bemcomobotijõesdenitrogênio
líquidoquesãousadosparamantergame-
taseembriõescongelados.
Alémdessesequipamentos,sãotambém
necessáriosmateriaispararotinalaboratorial,
comorecipientesdevidroe deplástico,se-
ringas,agulhas,balançasanalíticas,pipetado-
res,centrífugas,platinasemesasaquecedo-
ras,ponteirasparapipetagem,filtrosesterili-
zantes,placasdepetridescartáveis,tubosde
centrífugadescartáveisevidrarialaboratorial.
A centrífugadeveestarinstaladaemlugarfir-
meparaqueo desempenhonãosejaafetado,
e separadadosmicroscópios,esteromicros-
cópios,balançaseoutrosequipamentosque
podemprovocarvibrações.
Protocolo para PIV em Bovinos
O protocoloparaPIV embovinosapre-
sentadiferençaspeculiaresentrelaboratóri-
os,masosprincípiosdametodologiasãoos
mesmos.As variaçõesocorremquantoaos
meiosdematuraçãodosoócitosededesen-
volvimentoembrionário,processosdesepa-
raçãodeespermatozóidesviáveis,concentra-
çãoespermática,co-cultivocelularparade-
senvolvimentoembrionário,maneirasdere-
tirarascélulasdocumulus,entreoutrosse-
guimentosdesteprocesso.Emtermosgerais,
218
todosessesmétodossãoaceitáveis,desdeque
sejamobtidosíndicesmédiosacimade30%
deblastocistos.A seguirseráapresentadoo
protocoloutilizadono laboratóriodeBiotec-
nologia€ ReproduçãoAnimal (BioRep)da
UniversidadeFederaldeSantaMaria.
DiaMenos2 emRelaçãoao Diada
Fecundação
Inicialmente,asplacasparamaturaçãode
oócitos(modelopetride6Omm)sãoprepara-
dascomquatrogotas,emvolumesde100!lI,
deTCM 199modificado,cobertascomóleo
desilicone50ctks.Asplacasparacultivoem-
brionáriosãopreparadasdemaneirasimilar,
utilizando-semeioKSOM contendo10%de
SVE ou SFB. As placasparamaturaçãode
oócitoseparacultivoembrionárioempresen-
çadecélulasepiteliaisdoovidutosãoequili-
bradasemestufaa 39°C,comatmosferade
5%deCOl emareumidadesaturada.
Parapesquisa,os CCOs são obtidosa
partirdeováriosoriundosdefrigoríficoseo
materialnecessárioparaserutilizadonesse
localdeveserorganizadonodiamenos2ou
no diamenos1,devendoconter2 garrafas
térmicas,1litrodesoluçãosalinaa0,9%de
NaCl, 1 tesouracirúrgica,1frascode25 a
50 mlcomtampaparacolocarovidutos,em
casodecultivoembrionárioemmonocama-
dadecélulasdooviduto,1pardeluvascirúr-
gicas,roupasebotasdecorbranca.
'DiaMenos1
No Frigorífico
Os ováriosdevemserretiradosnamesa
de inspeçãoe submetidosa umarápidala-
vagemcomsoluçãosalinaa 0,9%deNaCl,
devendoser,emseguida,colocadosemgar-
rafatérmicacontendosoluçãosalinaestéril
natemperaturade30°Cetransportadospara
o laboratório.Todaamanipulaçãodosová-
rioseoócitosnãodeveserrealizadaemtem-
peraturainferiora25°C.
~ No Laboratório
PreparaçãodosOváriose Punção Folicular
Os ováriosdevemserlavadosatravésde
duaspassagensemfrascoscontendosolu-
çãosalinaesubmetidosàsecagemcomgaze
oupapeltoalhaestéril,antesdapunçãofo-
licular.Os folículosovarianoscomdiâme-
troentre2 e 8 mmsãopuncionadoscom
agulhadeduaspontas,comercializadaspara
extraçãodesangueemtubosVacuntainer
(21xl"),utilizandovácuocontínuoprovo-
cadoporbombacalibradaparaaspirar1Oml
delíquidoporminuto,oquecorrespondea
umvácuoentre30a60mmdeHg.Termi-
nadaaaspiração,otubodeensaiodeveper-
maneceremposiçãoverticalpor10minu-
tosparaemseguidaserretiradoosobrena-
dantecomamu1iodeumpipetador.O sedi-
mentoé colocadoemplacadepetride
1O0x15mmpararastreamentoeisolamen-
todosCCOs,sendorecomendadoalavagem
dotubo,porduasvezes,comaproximada-
mente2mldemeioparaquenãopermane-
çamCCOsnofundodotubodecolheita.
Rastreamento,Isolamentoe Lavagemdos
CCOs
A placadepetrideveconternomáximo3I
a4mldelíquidofolicular,quantidadessupe-
rioresdificultamavisualizaçãoeo isolamen-
todosCCOs. Os CCOs sãoretiradoscomo
auxíliodemicropipetasdevidrocomdiâme-
tro ligeiramentesuperioraosCCOs. Micro-
pipetascomdiâmetroexatamentedo tama-
nhoou inferioraoCCO danificamo oócito.
Essapipetaéacopladaaodispositivodesuc-
ção,podendoserummanguitocomovácuo
epressãocontroladapelabocado operador
ou aparelhosespeciaisparamicromanipula-
ção.Assim,os CCOs sãotransferidospara
umaplacacontendo3 mldeTCM 199para
lavagemdosoócitos,aqualépreparadamo-
mentosantesdouso.Apósaseleçãofinaldos
CCOs, sãorealizadasmaisduaslavagensem
outrasplacas,aproveitando-separacontaros
CCOs e realizara estimativade quantos
CCOs serãocolocadosemcadagrupo.
MaturaçãodosOócitos
Após a ultimalavagem,os CCOs são
transferidosparaaplacadematuraçãopre-
viamentepreparada.É importantesalientar
que,emcasosdenecessidade,asplacasde
maturaçãopodemserpreparadasdemanei-
ra quepermitaum equilíbrioematmosfera
contendo5%deCO2por,nomínimo,2ho-
ras.ParacolocarosCCOs nagotadematu-
ração,retira-seumpoucodolíquidodagota
1easpira-se,porexemplo,20CCOs dapla-
cadelavagem,colocando-osnagota1,rea-
lizandoleveagitaçãodaplaca.Posteriormen-
te,osCCOs sãotransferidosparaagota2e,
apósleveagitação,sãodivididosparaasou-
trasgotas.Nesseexemplo,10CCOs paraa
gota3 e 10paraagota4, realizando-seleve
agitaçãoda placaparaquefiquemposicio-
nadosnocentroda gota,devendosermanti-
daumaproporçãoaproximadadeumCCO
para10]LIdemeiodematuração.Posterior-
mente,asplacasdematuraçãocomosCCOs
sãotransferidasparaumaestufacomtempe-
raturade39°C,atmosferade5%deCO2em
areumidadesaturada,ondesãomantidaspor
umperíodode24horas.
Isolamentoe Lavagemdas Células
Epiteliaisdo Oviduto
Em casodeutilizaçãodemonocamadade
célulasepiteliaisdo oviduto,processoem
desusonoBioRep,omaterialnecessáriopara
queascélulassejamobtidassãoagulhacom
calibre25x8,seringade20 m!,pinçadecu-
shing,tesouracirúrgicapequena,placadepe-
tri,tubocênicode15ml,25mldeTCM 199
parapreparaçãodascélulasdooviduto,4ml
deKSOM, gazeoupapeltoalhaesterilizada,
pipetadoreponteirapara10]LI.Disseca-seo
ovidutoretirando-seo mesosalpingepara
219
propiciarumalimpezaadequada,imediata-
menteapós,éefetuadaalavageminternado
ovidutocom4 rnldeTCM 199,utilizando-
seumaagulhadecalibre25x8acopladaauma
seringa.A lavagemexternadoovidutoérea-
lizadacom3 rnldeTCM 199.Apósessasla-
vagens,coloca-seoovidutosobregazeecom
a pinçadecushingpressiona-setodoo ovi-
dutoparadesprenderascélulasepiteliais.Em
seguida,lava-seo interiordoovidutocom3
a4 rnldeTCM 199erecolhe-seomeiocom
ascélulasemtubocônicode15rnl.Essetubo
deveseragitadoem"vortex"a 80%davelo-
cidade/5segundose,posteriormente,centri-
fugadoa700xgpor3segundos.O sobrena-
dantedeveserdesprezadoeascélulasepite-
liaisdevemsercolocadasem3a4rnldeTCM
199.Esseprocessodeveserrepetidopormais
2 vezesemTCM 199e,naúltimalavagem,
em3rnldeKSOM. Depoisdaúltimacentri-
fugação,suspenderascélulasemaproxima-
damente100~deKSOM.
CultivodasCélulasEpiteliaisdo Oviduto
Apósos processosdeisolamentoe lava-
gem,aspiram-se10JLIdecélulasepiteliaisdi-
retamentedopelletcontidonofundodotubo.
Colocam-seaproximadamente4JLInagota1
da placade cultivoembrionário,a qualfoi
estabilizadanaestufaporperíodomínimode
2horas.No sentidodeaumentaraindividua-
lizaçãodascélulas,realiza-sea aspiraçãoe
retomodascélulasàgota,repetidamente,com
micropipetadevidro.A seguir,realiza-sea
seleçãodosmenoresaglomeradosdecélulas
dooviduto,emquantidadesuficienteparao
cultivoemduasgotas.As célulasseleciona-
dassãolavadasnagota2,divididasetransfe-
ridasparaasgotas3 e4,emvolumedeaglo-
meradosequivalentesa 5 CCOs.
PreparaçãoparaFecundaçãodosOócitos
1.Preparare estabilizarem 5% de CO2
emar 2 placasdepetri (35mm)con-
220
tendo3 ml demeioFert-TALPsem
adição-deheparinaparalavagemdosCCOsmaturos;
2.Prepararumtubocônico(15rnl)con-
tendo3 rnldeFert-TALPsemadição
deheparinaparaasegundasuspensão
dosespermatozóides,recomendando-
sepermanecersemi-abertonaestufa
comatmosferade5%deCO2emar;
3.Preparare estabilizarem5%deCO2
emarasplacasdepetriparafecunda-
ção (60 mm)contendo4 gotasde
100~(gotas1, 2, 3 e4) de Fert-TALP,
contendo5 /lIdeheparinasoluçãoes-
toque(10/lg/rnl)sobóleo.
DiaO
~ SeparaçãodosEspermatozóidesem
GradientedePercol
Retira-se2,7rnldepercol,deumfrasco
mantidoa 5°Cecoloca-seemfrascodevi-
droestérilcomcapacidadepara5rnl.Adicio-
nam-se300JLIdemeioSp-TALPlOx,resul-
tandonogradientePercol90%.Transfere-
se1rnldoPercol90%paraoutrofrasco,adi-
cionando-se1mldeSp-TALPIx o quere-
sultanogradientePercoI45%.Pararealizar
,ascolunas,transfere-se2rnldepercol90%
paraofundodeumtubocônicode15mle,
lentamente,comotuboinclinado,adiciona-
se,sobreo Percol90%,2rnldoPercol45%
(Figura10.8).Depoisdepreparadaacolu-
)1adePercol,descongela-seumapalhetacom
0,5rnldesêmena 38°C,colocando-oem
tubodeensaio.Emseguida,aspira-se1rnl
dosêmen,comumpipetador,edeposita-se,
vagarosamente,sobrea colunadepercol
45%comotuboinclinadoemângulode45°.
O percolnãodeveseraquecido,sendone-
cessáriopermaneceràtemperaturaambiente
(aproximadamente25°C).O tubocontendo
o percole o sêmené centrifugadopor30
minutosa 700xg.
~ PreparaçãodosOócitosMaturos para
Fecundaçãoe CapacitaçãoEspermática
No intervalode30minutosparacentri-
fugaçãodosêmen,procede-sealaVagemdos
ecos paradepositá-Iosnasgotasdomeio
defecundação.Paraisso,noexemplo,os20
ecos sãoretiradosdasgotasdematuração,
10decadavez,utilizando-sepipetadorre-
guladopara50JLl.Aspira-seumpoucode
meioFert-TALPdaplacadelavageme,com
amesmapipeta,sãoretiradososecos, pro-
curandotransferir,juntocomeles,amenor
quantidadepossíveldomeiodematuração.
Inicialmente,osecos sãolavadosemduas
placasdepetride35mmcontendo3mlde
Fert-TALPsemheparinaedepoissãotrans-
feridosparaa placadefecundação.Nessa
placa,osecos sãolavados2vezeseime-
diatamentetransferidosparaagota1dapla-
cadefecundação.Seguindoumaleveagita-
çãocomapontadaponteira,osecos são
transferidosparaagota2,aqualélevemen-
teagitada.A fecundaçãodeveocorrernagota
3 e 4. Paratransferiros ecos paraessas
gotas,deve-setomarcuidadoparaqueagota
finalpermaneçacom100JLl,tendoemvista
aconcentraçãofinaldeespermatozóides.Na
gota3,aponteiraépreenchidacom25JLl,
enquantoquenagota2,solta-sequantida-
desuficientedemeioparapossibilitaraas-
piraçãodosecos enovamenteaponteiraé
preenchidacom25JLI,sendotodooconteú-
dodareferidaponteiracolocadonagota3,
aqualconterá100JLIdemeio.Repete-seo
procedimentoparaa gota4 coma metade
restantedosecos.
Os melhoresresultadossãoobservados
comacapacitaçãorealizadanamesmagota
defecundaçãocontendoo meioFert-TALP
comheparina.A concentraçãodeheparina
variaemrelaçãoao touroe ao métodode
separaçãodosespermatozóides.Quandoa
separaçãoespermáticaé realizadaemgra-
dientede percol,a maioriadosejaculados
dosdiferentestourosrespondea 10/Lgde
heparina/mldemeio,masexistemtrabalhos
utilizandoaté100JLgdeheparina/mldemeio
quandosãoseparadospor swimup.
~ Suspensãodos Espermatozóidese
Inseminação
Apósoperíododecentrifugação,retira-
seosobrenadanteeaopelletresultanteadi-
ciona-se500JLIdeFert-TALPsemheparina.
Paradeterminare ajustara concentração,
retira-seumaamostrade10JLIparaserdiluída
em90JLIdeágua(diluição1/10).Conta-seos
espermatozóidesemcâmarade Neubauere
ajusta-se,inicialmente,a concentraçãopara
1x107espermatozóides/rnl,objetivandoatin-
giraconcentraçãofinalde2x106espermato-
zóides/mlapósadicionar25JLIdeesperma-
tozóidesnagotadefecundaçãocom100/LI.
Paradeterminaronúmerodeespermatozói-
desemcadaamostra,afórmulaabaixopode
serutilizada.
Espermatozóidescontadosx fatordediluiçãox fatorde
N°d / 3 correçãodacâmara(4000)eesperm.mm =
Númerodequadradoscontadosnacâmara
Exemplo:
Nocasodecontar80quadradospeque-
nos (5quadradosgrandes)nacâmarade
Neubauere encontrar50espermatozóides
emumaamostradiluídaaI: 1O,o número
deespermatozóidespormm3éo seguinte:
221
50x 10x4oo0
N°deesperm./mm3= 80 = 25.000esp/mm3
Ouseja,25.000esp/mm3x 1.000= 2,5x
107esp./ml
Portantoéiguala1,25x 107esp.nos500p.l
desêmendiluídocomFert-TALP
Paraatingir1x 107esp./mldeveadicionar
750p.lFert-TALP,totalizando1250p.l
Chega-seaessevolumedaseguintemaneira:
2,5x 107esp./ml+-1x 107esp./ml=2,5
500p.lx2,5=1250p.l
1250p.l- 500p.l=750p.l
Demaneiramaisfácil,utilizandoomes-
moexemplocomdiluiçãoaI: 10:
50espermatozóidescontadosnos80qua-
dradospequenosx 500p.l=25.000
25.000+ 10.000=1.250p.l(deveserovo-
lumetotal)
1.250p.l- 500p.l=750p.lquedeveser
adicionadoaos500p.ldesêmen
Apesardessecálculoparecerextremamen-
tesimples,o seuentendimentoéfundamental
nocasodousodeoutrofatordediluição.A
inseminaçãodeveserrealizadacomumapon-
teiraparacadagota,evitandoquesejatransfe-
ridoóleodaponteiraparao frascocomos
espermatozóides.O períododefecundação
deveserentre18e24horas.
~ PreparaçãodasPlacaspara
DesenvolvimentoEmbrionáriosem
Monocamadade CélulasSomáticas.
No casodeutilizaçãodecultivoembrio-
nárionaausênciadecélulasepiteliaisdoovi-
duto,asplacasparao desenvolvimentodos
embriõesdevemserpreparadascomquatro
gotas,emvolumesde 100!lI,deKSOM ou
SOF,contendo10%deSVE ouSFB,4mgde
BSNrnl ou 1mgdePVNrnl demeiocobertas
comóleode silicone50 ctks.As placassão
equilibradasemestufaa39°C,comatmosfera
de5%deCOlo5%deOze90%deNzeumi-
dadesaturada.
222
Dia 1
~ RetiradadoCumuluseCultivoEmbrionário
A retiradadocumulusquecircundaospre-
sumíveiszigotospodeserrealizadautilizando
o "vortex"ouatravésdesucessivasaspirações
eliberaçõesdoszigotoscomumamicropipeta
devidro.Paraa retiradado cumuluscomo
"vortex",coloca-seoszigotosemumtubode
15ml, contendo500 !lI demeiodecultivo
embrionário,eagita-seotubono"vortex"em
100%davelocidadepor2minutos.Apósessa
agitação,lava-seo tubodeensaiocomKSOM
etransfere-seoszigotosparaplacadepetri.
O segundométodoconsisteno usodeuma
pipetadevidro com diâmetroligeiramente
superioraozigoto.Sãorealizadasaspirações
sucessivascom10zigotosdecadaveznagota
defecundaçãoatéa retiradatotaldascélulas
somáticas.É importantesalientarqueseo
diâmetrodapipetaficarmuitogrande,areti-
radadascélulastorna-sedificultada,todavia,
seodiâmetroformenordoqueozigoto,essa
célulapoderáserdanificadaapontodecom-
prometerseudesenvolvimento.Apósa reti-
radadocumulus,oszigotossãolavadosem
placacontendo3 rnldeKSOM com10%de
soroou4mgdeBSNrnl ou 1mgdePVNrnl
demeioe,posteriormente,transferidospara
umagotanaplacadecultivo.Apósumapas-
sagempelasegundagotademeiodecultivo,
os zigotossãocultivadosnapresençaou na
ausência(métodoatualmenteutilizadono
BioRep)decélulasdeovidutoemgruposde
10a 12,nasgotas3e4daplacadecultivo.É
importantemanterumaproporçãomínimade
umembriãoparacada10p.ldemeionosen-
tidodeobtercondiçõesideaisparao desen-
volvimentoembrionário.A partirdessemo-
mento,as placascontendoos zigotossão
colocadasemcultivoemumaestufaa 39°C
comatmosferade5%deCOzemareumida-
desaturada,quandoutilizadamonocamada
dascélulasepiteliaisdo oviduto,ouemuma
atmosferacontendoumamisturagasosade
5%deCOz,5%de°z e90%deNz,quando
1
I
I
I
oszigotossãocultivadosnaausênciadecé-
lulassomáticas.
Dia2
~ AvaliaçãodaClivagem.
Aavaliaçãodaclivagemérealizada48ho-
rasapósainseminação.Nesseperíodo,en-
contra-seembriõescom2,4 e8células.Os
embriõescom2 célulasapresentammenor
probabilidadedealcançaro estádiodeblas-
tocisto.Duranteaavaliaçãodaclivagem,reti-
ram-seasestruturasnãoclivadasdagota.
Dia 7 e 9
~ AvaliaçãodoDesenvolvimentoEmbrionário
O númerodemórulas,blastocistos,blas-
tocistosexpandidoseblastocistoseclodidos
sãocomputadosentreosdias7 e 10apósa
fecundação.É recomendadorealizarduas
avaliações,umanodia7eoutranodia9 pa-
raacompanharaformaçãodosblastocistose
aporcentagemdeembriõesqueatingeo es-
tádiodeeclosão.O índicedeblastocistoex-
pandidoeeclodidoé indicativofundamentalparadeterminaraeficáciadosistemadema-
turaçãodo oócito,fecundaçãoedesenvolvi-
mentoembrionário.
Preparaçãodos Meios Utilizadosna PIV
~ Solução salina para colheitade ovários
em matadouro
Preparaçãaem umbalãocomcapacidadepara2 litros:
Componente Unidade QuanTIdade
18
2
NaCl
Águoultrapuraq.S.p.
g
litro
~ Solução estoquede Antibiótico para os
meios
Componente
Penicilina
Estreptomicina
Águaultrapuraq.s.p.
Unidade
UI
mg
ml
QuanTIdade
100.000
50
1
Congelara-20°(. UTIlizar1JlI dasoluçãoestoquefmldemeio
~ Soluçãoestoquede Piruvatode Sódio
para maturaçãode oócitos
Componente Unidade
PirlNatodesódio g
Águaultrapuraq.s.p. JlI
Congelar a -2(Jo(emalíquotasde3 j.1!.
QuanTIdade
0,0075
300
~ Soluçãoestoquede Piruvatode Sódio
paradesenvolvimentoembrionário
Componente Unidade QuanTIdade
Piruvatodesódio g 0,00165
Águaultrapuraq.s.p. JlI 300
Congelar o -2Ü'C em alíquotas de3 JlI.
~ Solução estoquede heparina para
fecundação
Componente
Heparina
Fert.TALPq.S.p.
Unidade QuanTIdade
0,0010
4
g
ml
Congelara-20°C emalíquotasde50JlI.
1.Fazergotasdefecundaçãocom95JlIdemeioFert-TALP+5JlI de
heparína,totalizando100j.1!cadagota.
~ TCM 199 básico
O TCM 199é comsaisdeEARLE eL-
glutamina.
~ TCM 199 modificadopara lavagem
dosoócitose preparaçãodascélulas
do oviduto
Ajustoro pH em 7,36.lmedio1omenteantesda u111ização,adicionar10% desoro.
~ TCM 199 modificadoparamaturação
solução estoque
Componente Unidade QuanTIdade
HEPES
BicorbonatodeSódio
AnTIbióTICOsolução estoque
TCM199básicoq.S.p.
mM
mM
j.1!
ml
25,00
26,19
100,00
100,00
223
Componente Unidade QuanTIdade
HEPES mM 25,0
AnTIbióTICOsoluçãoestoque JlI 100,0
TeM199básicoq.S.p. ml 100,0
~ Preparaçãofinaldomeiodematuração
Componente Unidode Quontidode
TCM199estoquemoturaçõo ml 2,7
SorodevocoemestIo ml 0,3
LHdoNHPP J-lg 15,0
" FSHdoNHPP J.l9 1,5
PiruvotodeSódiosoluçãoestoque J-l1 3
NHPP=NationalHormoneandPituitaryProgram
~ Sp-TAlP 1Ox
Componente Unidade
ro 9
NoCI 9
NaHlO. 9
l.octotodeSódio !li
Hepes 9
Bicorbonatodesódio 9
Piruvotodesódio 9
CaC~.2~r 9
MgLlr6N20* 9
~tibióticosoluçãoestoque J-l1
Aguaultrapuraq.s.p. ml
*Adicionarporúltimo.Filtrare ormarenornageladeira.
~ Sp-TAlP1x
Quantidade
0,1150
2,9200
0,0174
924,0
1,1900
1,0500
0,0050
0,1550
0,0400
50,0
50,0
Componente
Sp-TAlP10x
Antibióticosoluçãoestoque
Águaultrapura
Filtrarearmazenarnageladeira.
Unidade
ml
!li
ml
~ Fert-TAlP
Quantidade
2
18
18
224
\
~ PHEEstoque
Componente
Penicilinamina
Hipotaurina
Epinefrina
Águaultrapuraq.S.p.
Unidade Quantidade
0,0186
0,0055
0,0009
50
9
9
9
ml
Fazeralíquotosde 1 mle congelara-2O'C.
~ KSOMsoluçãoestoque
Componente MM
NaCl 85,15
KCI 8,0
CaCI2.2H2O 2,0
MgCl2.6Hp 0,5
NaHCO3 25
l.octotodeSódio 5,0
Glucose 2,0
Glicina 4,9
Glutomina 0,1
Hepes* 25
Insulina 0,12Uljml
Antibiótico solução estoque
a.a. Essencial 50x
a.a. Não essencial 1OOx
Águaultrapuraq.S.p.
Unidade Quantidade
9 0,4976
9 0,0596
9 0,0294
9 0,0101
9 0,2100
g/!li 0,0560g/ 42,79!li
9 0,0360
9 0,0368
9 0,0014
9 0,5957
UI 12
J-l1 100
ml 2
ml 1
ml 100
Armazenaremgeladeira.*Podeserretiradodafórmula.
~ KSOM paradesenvolvimentoembrionário
Componente Unidade Quantidade
KSOMsoluçãoestoque ml 2,7
5oro* ml 0,3
Piruvatosoluçãoestoque J-l1 3
Aoutilizarmeiodefinido,substituirosoropor1mgdePVA/mldemeio.
ConsideraçõesFinaise Perspectivas
Nestecapítulo,aproduçãodeembriões
invitrofoiapresentadadeformaaoferecer
subsídiosbásicosparaoentendimentodeto-
doo processoerepassaraexperiênciados
autoresacumuladaemmaisdedezanosno
desenvolvimentodessametodologia.Noen-
tanto,o objetivodestecapítulonãofoio de
esgotartodososaspectosdasdiferenteseta-
pasdaPIV queenvolvema maturaçãode
Componente mM Unidade Quontidode
NaCI 114 9 0,6660
KCI 3,2 9 0,0238
NaHlO. 0,4 9 0,0048
l.octotodeSódio 10 !li 85,57
M9C.7HP 0,5 9 0,0101
NaHO 25 9 0,2100
caC'r2f
2,0 9 0,0294
PiruvotoeSódio 0,2 9 0,0022
PHEestoque ml 1,0
Glicose 5 9 0,0900
Cafeína 5 9 0,0971
BSA 9 0,6000
ntibióticosoluçãoestoque J-l1 100,0
Agua ultrapuraq.s.p. ml 100,0
Armazenaremgeladeira.
*60%dexaropede/actotodesódio("sodiumlactatesyrup").
** BSAlivredeácidosgraxos("Fattyacidfree"J.
oócitos,a fecundaçãoe o desenvolvimento
invitrodeembriõesporseremassuntosam-
plosecomplexos.Asregulaçõesbioquímicas
ehormonaisenvolvidasnaproduçãofinalde
embriõesnãoestãocompletamenteconheci-
das,havendoanecessidadedecomprovação
ouelucidaçãodemuitosmecanismosenvol-
vidosnoprocessofisiológicocomoumtodo.
Os métodosin vitrotêmsidoutilizadosna
tentativadefacilitaro entendimentodesses
mecanismos,porém,nemsempreseconse-
gueobtercondiçõessimilaresde atividade
celularedeseusfatoresregulatóriosencon-
trados,fisiologicamente,invivo.Apesardes-
saslimitações,osestudosin vitro têm sido
deimensurávelvalianoesclarecimentodere-
gulaçõesnamaturaçãodosgametasfemini-
nos,fecundaçãoedesenvolvimentoembrio-
nário precoce.Essesconhecimentostêm
contribuídosignificativamenteparaapesqui-
sa,aproduçãoanimaleaqualidadedevida
dohomememváriosaspectospelaimportân-
cia, tantonareproduçãohumanae animal
quantofacilitandoaimplementaçãoedesen-
volvimentodeoutrasbiotecnologias.
Aproduçãoinvitrodeembriõesparamul-
tiplicaçãodeanimaiscomproblemasrepro-
dutivosoudefêmeasdeelevadopadrãozoo-
técnicoecaracterísticasdesejáveistemcres-
cidointernacionalenacionalmente.No en-
tanto,onúmeroreduzidodeoócitoscompe-
tentesparareinícioda meiosepresenteno
ováriodeumafêmeanumdeterminadomo-
mento,limitae tornaesseprocessolaborio-
so.Por isso,essastécnicasserãoferramen-
tasmaispoderosasquandoassociadasao
crescimentodeoócitosin vitroinclusosem
folículospré-antrais(Capítulo11)eaprodu-
çãodeclones(Capítulo13)e transgênicos
(Capítulo14).
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Capítulo 11
Manipulação de Oócitos
Inclusosem FolículosOvarianos
Pré-antrais- Moifopa
JoséRicardodeFigueiredo,AnaPauloRibeiroRodrigues,
ChristianiAndradeAmorim
Introdução
A utilizaçãoeo desenvolvimentodebio-
técnicasdareproduçãoanimalsãocondições
indispensáveisparao aumentodaeficiência
produtivadosrebanhos.Nestesentido,espe-
cialmentenotocantearuminantesdomésti-
cos,biotécnicascomoainseminaçãoartificial
eatransferênciadeembriõesvêmsendouti-
lizadascomsucesso.Outrasbiotécnicaste-
rãosuaaplicabilidadepráticaemlargaescala
nofuturo.Nessegrupo,pode-seincluirafe-
cundaçãoin vitro(FIV), clonagememani-
pulaçãodeoócitosinclusosemfolículosova-
rianospré-antrais(MOIFOPA).
No intuitodefacilitara compreensãoda
importânciadestanovabiotécnica,bemco-
mo,demonstrarcomoelaseinseriránofutu-
ro, no contextoda reproduçãoanimal,este
capítuloserádivididoemduaspartes.A par-
teI serádedicadaà umabreverevisãosobre
osfolículosovarianos,enfatizandoasuafor-
mação,classificaçãoedestinonointeriordos
ovários.Na parte11seráabordadaa impor-
tânciado estudoda populaçãode folículos
ovarianospré-antrais(FOPA) isoladosin
vitro,as principaistécnicasde isolamento,
conservaçãoecultivodeFOPA,oestadoatual
daMOIFOPA e,finalmente,serãodiscutidas
asperspectivasdeutilizaçãodabiotécnicade
MOIFOPA nareproduçãodeanimaisdomés-
ticos,silvestreseemperigodeextinção.
Parte I: FolículosOvarianos: Definição,
Tipos, Origem População e Destino
DefiniçãodeFolículoOvariano
O folículoéaunidademorfofuncionaldo
ovário,sendoconstituídoporumoócitocir-
cundadoporcélulassomáticas(célulasda
granulosae tecais).Eledesempenhaduas
funçõesprincipaisquesãointerdependentes;
umaendócrina(produçãoeliberaçãodehor-
môniosesteróideseoutrospeptídios)eaou-
traexócrinaougametogênica.Nestaúltima
função,o folículoé umelementoessencial
paraamanutençãodaviabilidadeoocitária,
paraasseguraro crescimentoe maturação
deoócitosprimáriosou imaturose,final-
mente,paraliberarumoócitomadurono
processodeovulação.Aorganizaçãodoová-
riomamíferoilustrandosuasprincipaises-
truturas,incluindoosfolículosovarianosé
mostradanafigura11.1.
Tiposde FolículosOvarianos
A populaçãofoliculardoovárioébastante
heterogêneae localiza-seno córtexovaria-
227
Folículopré-ovulatório
Folículoterciário
\
FolículosecundárioMO
Folículoprimário
Folículoprimordial
Mesovário
Ovulação
Folículoatrésico
Corpohemorrágico
Figura11.1.Organizaçãodo ovárioilustrandosuasprincipaisestruturas.
no. De acordocomo graudeevolução,os
folículospodemserdivididosem:a) folícu-
lospré-antraisounãocavitárioseb) folícu-
los antraisou cavitários.A estruturahisto-
lógicade folículospré-antraise antraisé
mostradanafigura11.2.No tocanteà dis-
tribuiçãoda populaçãofolicular,90-95%
correspondeaos folículospré-antrais.Em
outraspalavras,os folículospré-antraisar-
mazenamemtornode90%dosoócitospre-
sentesno ovário.
~ FolículosPré-antrais
Os folículospré-antraissãoconstituí-
dospelosfolículosprimordiais,primários
e secundários(Figueiredo,1995).Eles
podemserdiferenciadosentresipelafor-
mae númerode camadasdecélulasda
granulosaquecircundamo oócitoimatu-
roouprimário.
228
Figura11.2.Estruturahistológicadefolículospré-antrais
e antraisbovinos.A) folículoprimordial;B)
folículoprimário;C) folículosecundário;DI
folículoantral-(EO:estromaovariano;MB:
membranabasal;00: oócito;CG: célula
da granulosa;AT:antro;ZP:zona pelúci-
da, CR:coronaradiata,CT:célulastecais.
FoIículos Primordiais
Sãoosmenoresfolículosencontradosno
ovário.No bovino,o diâmetrodo folículo
primordialbemcomodooócitonelecontido
medem,respectivamente,30- 40JLme20-
25JLmdediâmetro(Beckersetal.,1996).Os
folículosprimordiaissãoosprimeirosfolícu-
los formadosno ovário(Eppig& O'brien,
1996)e consistemem um oócitoimaturo
localizadono centrodo folículo,circundado
porumaúnicacamadadecélulasdapré-gra-
nulosadeformapavimentosademarcadapor
umamembranabasal(Braw-Tal& Yossefi,
1997),queos separado estromaovariano
(Gordon,1994).Emalgunsfolículosprimor-
diaishácélulastantodeformatopavimento-
so,quantocúbico(folículosdetransição-Van
DenHurk etaI.,1997).Osfolículosprimor-
diaisestãolocalizadosnaregiãoperiféricado
córtexdoovário(Greenwald& Moor, 1989),
constituemopooldereservadefolículosquies-
centes(Beckersetal.,1996)ecompreendem
90%detodaa populaçãofolicularpresente
noováriomamífero(Erickson,1986).
FoIículos Primários
Caracterizam-sepelapresençadeum
oócitoimaturocentral,circundadoporuma
camadadecélulasdagranulosadeforma
cúbica(HulshofetaI.,1994).Nessetipode
folículo,ascélulasdagranulosaaumentam
emnúmeroe tornam-semaisvolumosas
(VanDenHurketaI.,1997).Naespéciebo-
vina,o folículoeo oócitonelecontidome-
dem,respectivamente,40- 60JLme 30-
40JLmdediâmetro(BeckersetaI.,1996).
FoIículos Secundários
Caracterizam-sepela presençade um
oócitoimaturocentral,sendocircundadopor
duasoumaiscamadasdecélulasdagranulo-
sadeformacúbica(Hulshofetal.,1994).Nos
folículossecundáriosemestádiosmaisavan-
çados,asfibrasdetecidoconjuntivoorgani-
zam-separalelamenteàmembranabasalpara
formaracamadadecélulastecais(VanDenHurk etal.,1997).Nessesfolículos,umaes-
truturahialinizada,denominadazonapelúcida
tambémjápodeserevidenciadaemcorteshis-
tológicoscoradospelométododacoloração
PAS-hematoxilina(Figueiredo,1995).Em
bovinos,o folículosecundáriopodemedirde
60 a200/lmdediâmetro.
... FolículosAntrais
A categoriadefolículosantraiscompreen-
deosfolículosterciárioseosfolículosdeDe
Graaf,estesúltimossãotambémdenomina-
dosdefolículosmadurosoupré-ovulatórios
oudominanteseforamdescritosnoCapítu-
lo 3. SegundoFortune(1994),a formação
da cavidadeantralemmamíferos(mulher,
vacae rata)é observadaquandoo folículo
atinge0,2a 0,4mmdediâmetro.Entretan-
to,Lussieretalo(1987)observaramodesen-
volvimentodacavidadeantralemvaca,emfo-
lículoscomdiâmetroentre0,14a 0,28mm.
OrigemdosFolículosOvarianos
Especialmentenotocanteaosruminantes,
a formaçãodosfolículosovarianose,conse-
quentemente,dosoócitosnelescontidos,ini-
cia-seno períodopré-natal.A liberaçãodo
oócitopelo folículoou ovulaçãoé sempre
precedidapor dois processosconsideravel-
mentelentos:a oogêneseea foliculogênese.
A relaçãoentreos processosdeoogênesee
foliculogêneseé ilustradanafigura11.3.
.. Oogênese
A oogênesepodeserdefmidacomoocon-
juntodeprocessosquecompreendeodesen-
volvimentoediferenciaçãodascélulasgermi-
nativasprimordiais(CGP) da fêmeaatéa
formaçãodooócitohaplóidefecundado(Rüs-
se,1983).Antesdeserinclusonofolículoova-
riano,acélulaoocitáriaéprecedidadaevolu-
çãodedoistiposcelularessucessivos,asaber:
229
,
I
I
I
CrescimentoI
oocitário I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I 2"Paradadameiose ) I
Foliculogênese: II (Fim) FPO =~6caro.CGC + antro+ Ooe.2°(Nu-M2)
~ J
Ovulação
I Ooe.2°(Nu-M2)I~I S~T~I .
.. 2"Retomaa melOse
I Blastoeisto~ ~ IEndodermar--
Mitose
Oogênese:
(Inicio)
~ Mitose
i" Paradada Meiose
r-----------
I FOIiCUIOgê~~(Início) FoI.Pnmordial= I eam.CGPav+ Ooe.1°(Nu-PI)I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
FoI. Primário= I eam.CGC + Ooe. 1°(Nu-P I)
FoI. Secundário=~2 eam.CGC + Ooe. 1°(Nu-PI)
FoI. Terciário= ~6 eam.CGC + antro + Ooe. 1°(Nu-PI)
PPO -LH-Puberdade
Oogênese:
(Fim) ~
Matnração
oocitária
Fecundação
I Zigoto I
Formaçãodosoócitose folículosdestacandoa relaçãodosprocessosde oogênesee foliculogênese:
MCI; massacelularinterna;CGP - célulagerminativaprimordial;Ooe.-oócito;Nu-núcleo;Pl -prófase
1;CGPav-céluladagranulosapavimentosa;cam- camada;CGC- céluladagranulosacúbica;PPO
- picopré-ovulatório;M 1- metófase1;A1- anófase1;Tl - telófase1; P2- prófase2; CP - corpúsculo
polar;M2 - metófase2; FPO- folículopré-ovulatório;SPTZ- espermatozóide;A2 - anófase2;T2- teló-
fase2; OHF - oócitohaplóidefecundado.
Figura11.3.
230
asCGP easoogônias.As CGP têmorigem
extragonadalesãoformadasduranteoperío-
doembrionáriocomosesegue:apósafecun-
daçãodo oócitopeloespermatozóideé for-
madoozigotoqueevoluiráaoestádiodeblas-
tocisto.Este,por suavez,é constituídopor
duasestruturas,ou seja,o trofectodermaou
trofoblastoe o botãoembrionário,também
chamadode embrioblastoou massacelular
interna.A partirdobotãoembrionário,três
folhetosserãooriginados:oectoderma,ome-
sodermaeoendoderma.Desteúltimofolheto
seráformado,dentreváriasestruturas,o saco
vitelínico,do qualserãooriginadasas CGp,
asquaiscaracterizam-seporseremmóveise
altamenteinvasivas(Hirshfield,1991).Ainda
navidafetal,nasespéciesbovinaeovina,as
CGP migramparao mesênquimada crista
genitale colonizama gônadaindiferenciada
(Wassarman,1994).Nesselocal,asCGPper-
demasuacaracterísticamóvelemultiplicam-
sepormitose,podendoatingirnobovino,em
tornodedoismilhõesdecélulaspor animal
(Erickson,1966b).Apósumprocessomarca-
dopelocrescimentocelularepelaredistribui-
ção de organelascitoplasmáticas,as CGp,
dentrodoovário,multiplicam-seativamente
e diferenciam-seemoogônias.As oogônias
sofrerãosucessivasmitosese,posteriormente,
entrarãonaprimeiradivisãomeiótica(estádio
deprófaseI) e passarãoa serdenominadas
deoócitosou ovócito.Os oócitoscujosnú-
cleosencontram-senaprimeiradivisãomeió-
ticasãodenominadosoócitosprimáriosou
imaturos.O núcleooocitárioqueseencontra
nafasedemeioseI passará,sucessivamente,
porquasetodosestádiospertencentesàpró-
faseI (leptóteno,zigóteno,paquítenoedipló-
teno).Porém,oprocessomeióticoéinterrom-
pido (primeiraparadadameiose)noestádio
dediplóteno,tambémdenominadodeestá-
diodedictiotenoou devesículagerminativa
(VG). O núcleodooócitopermaneceránes-
teestádiopelomenosatéqueo animalatinja
a puberdade.Duranteo períodoemqueo
núcleooocitárioseencontrarnafasedepró-
faseI, o oócito,emíntimainter-relaçãocom
ascélulassomáticasinclusasnocompartimen-
tofolicularempreenderáumaintensafasede
crescimento,caracterizadaporumaumento
naatividadetranscripcional(síntesedeRNA),
acúmulodelipídioseabsorçãoativae/oupas-
sivadediferentesnutrientes.Quandoo ani-
malatingeapuberdade,devidoàocorrência
deliberaçõespré-ovulatóriasdeLH, algumas
horasantesdaovulação,ameioseéretomada
eonúcleooocitárioentraemdiacinese.Nesse
momento,iniciao processoderompimento
daVG queéseguidadasfasesdemetáfaseI,
anáfaseI etelófaseI, quandoentãoocorrerá
aexpulsãodoprimeirocorpúsculopolar,re-
sultandonaformaçãodo oócitosecundário,
assimdenominadopelofatodeseunúcleoen-
contrar-senasegundadivisãomeiótica.Essa
secaracterizaporumarápidae,àsvezes,ine-
xistentefasedeprófase11,queprogrediráaté
metáfase11,quandoentãoocorreasegunda
paradadameiose.O oócitoretomaráameiose
somenteseforfecundadopeloespermatozói-
de.Nessecaso,o núcleodo oócitopassará,
sucessivamente,pelosestádiosdeanáfase11
etelófase11,seguidodaexpulsãodosegundo
corpúsculopolareformaçãodooócitohaplói-
defecundado,marcandoassim,oflllldaoogê-
nese(Figura11.3).
.. Foliculogênese .
A foliculogênesepodeserdefinidacomo
oprocessodeformação,crescimentoema-
turaçãofolicular,iniciandocomaformação
dofolículoprimordialeculminandocomo
estádiodefolículomaduro,tambémconhe-
cidocomofolículodeDeGraafoupré-ovu-
latóriooudominante(Saumande,1981).
Conformemencionadoanteriormente,a
funçãodofolículoéproporcionarumam-
bienteidealparaamanutençãodaviabilida-
de,bemcomo,o crescimentoematuração
231
oocitária.Desse modo, a foliculogênese
ocorrerásimultaneamenteàoogênese,quan-
doo oócitoestiverentreasfasesdeprófase
I àmetáfase11,namaioriadasespécies.Em
outraspalavras,a foliculogêneseiniciaapós
eterminaantesdaoogênese(verFigura11.3).
Nasespéciesbovinaeovina,respectivamen-
te,emtornodo 130°e90°diasdegestação,
umacamadadecélulassomáticasplanasou
achatadas,conhecidascomocélulasdapré-
granulosa,origináriasdo mesoderma,cir-
cundamo oócitoprimárioou imaturo(nú-
cleoemprófase1),formandoo primeiroe
maisprimitivodosestádiosfoliculares,que
é denominadofolículoprimordial.Após a
formaçãodosfolículosprimordiais,ascé-
lulasdapré-granulosaparamdemultipli-
car-seeofolículoprimordialentranoperío-
dodedormênciaouquiescência.A prolife-
raçãocelularéretomadasomentequando
o folículoprimordial(quiescente)começa
acrescer,mesesouanosapósasuaforma-
ção(Hirshfield,1991),passandosucessiva-
mentepelosestádiosdefolículosprimários
esecundários(folículospré-antrais)eter-
ciário(folículoantral)atéchegaraoestádio
defolículopré-ovulatório.A cronologiada
oogêneseefoliculogênesenoperíodofetal
nasespéciesbovinaeovinaémostradana
tabela11.1.
Tabelo11.1. Cronologiado oogênesee foliculogêneseem ováriosde fetosbovinose ovinos.
Eventos
Identificaçãodascélulasgerminativasprimordiais
Daerencioçãosexualdogônado
Desenvolvimentodosgruposdeoogônios
Multiplicaçãodosoogônios:início
fim
Sincronização do mitose em:
4oogônios
8oogônios
16oogônios
Início do meiose
Início do separação dos folículos
Surgimentodosfolículosprimordiais
Surgimentodosfolículosprimários
Surgimentodosfolículossecundários
Surgimentodosfolículosterciários
Nascimento
Fonte-Erickson,19660-Rüsse,1983, *Smithet01.,1993.
A grandemaioriadosoócitosnoovárioé
armazenadanos folículosprimordiais.Este
pooldefolículoséprogressivamentereduzi-doduranteavidareprodutivadafêmea(Gos-
denetaI., 1983;Gougeonet al., 1994).A
populaçãototalde folículosno ovárioma-
míferoconsisteemumagrandereservadefo-
lículosprimordiaisquiescenteseumnúmero
232
muitomenordefolículosemfasedecresci-
mento(Cahill& Mauléon,1981).Algunsfo-
lículosprimordiaisiniciamoseucrescimento
tãologoelessejamformados,masoutrosper-
manecemquiescentespormesesouanos.O
mecanismoqueinfluenciaocrescimento,de-
senvolvimentoediferenciaçãoespontâneosde
algunsfolículosprimordiaisquiescentes,na
Diasdegestação
Bovino Ovino
35 23
39- 40 31
57 43
60 48
170 55
62 48
74 53
82 55
75-82 55
90 66
130 90*
140 95
210 103
230- 250 150
280 150
presençadefolículosremanescentesinativa-
dos,não é conhecidoatéo momento.Na
maioriadasespécies,ocrescimentofolicular
começacomatransformaçãomorfológicade
folículosprimordiais,noqualooócitocircun-
dadoporumacamadadecélulasdapré-gra-
nulosa pavimentosasevoluemparafolículos
primários,nosquaisos oócitossãocircun-
dadospor umacamadade célulasda gra-
nulosadeformacubóide.Nos bovinos,en-
tretanto,essasmudançasmorfológicasnão
podemserusadasparadefiniraativaçãodos
folículosquiescentesporqueosfolículospri-
mordiaiscontêmalgumascélulasdagranulo-
sadeformacubóidenasuaestruturacelular
(VanWezeletal.,1996).No momentodaati-
vaçãofolicular,inicia-se,dentreoutroseven-
tos,aexpressãogênicaparaasíntesedepro-
teínasparaformaçãodazonapelúcida(Ran-
kinetal.,2000).Porproliferaçãodascélulas
dagranulosa,sãoformadosos folículosse-
cundários,comduasoumaiscamadasdecé-
lulasdagranulosadeformacubóide.O ta-
manhodosoócitosaumentae a zonapelú-
cidapodeserobservadaentreo oócitoe as
camadasde célulasdagranulosa.Especial-
menteemgrandesfolículossecundários,oes-
tromaquecircundaa membranabasalse
desenvolveemumacamadatecalbemdefini-
da.O mecanismoresponsávelpelocrescimen-
to dosfolículospré-antraisé poucoconhe-
cido.Entretanto,acredita-sequeodesenvol-
vimentodosfolículospré-antraisépoucode-
pendentedegonadoITofll1aseé,provavelmen-
te, influenciadopor fatoresintraovarianos,
como a ativina,EGF (EpidermalGrowth
Factor),FGF (FibroblastGrowth Factor),
TGFa (TransformingGrowthFactor-alfa),
TGF~ (TransformingGrowthFactor-beta)e
IGF-1 (Insulin-likeGrowthFactor1).Recen-
temente,algunsITabalhostêmmostradoaim-
plicaçãode doisfatoresde crescimentono
processoqueregulaodesenvolvimentoecres-
cimentodefolículospré-antrais.Um desses
fatoreséo Kit-ligande(KL), tambémdeno-
minadosteamcellfactorousteelfactor.O KL
épredominantementeproduzidopelascélulas
dapré-granulosaeéreconhecidopeloc-Kit,
o qualéexpressopelooócitoecélulastecais
(MayerhoferetaI., 1997).Ováriosfrescos,
cultivadossemoucomadiçãodoKL apresen-
taram,respectivamente,umapercentagemde
68%,60%e45%defolículosprimordiais,e
32%,40%e55%defolículosprimários.Estes
resultadossugerem,portanto,queoKL pode
induziro desenvolvimentodefolículospri-
mordiaisduranteocultivodetecidoovariano
oriundoderatasde4 diasde idade(Parrot
& Skinner1999).Um outrofatorimportante
é o fatordediferenciaçãodecrescimento"9
(GDF-9), oqualéproduzidoapenasnooóci-
to (Mayerhoferet aI., 1997).Dong et aI.
(1996)mostraramqueaausênciadoGDF-
9 previnea formaçãodosfolículossecundá-
rios,levandoconseqüentementeàdegenera-
ção dos oócitosinclusosemfolículospri-
mários,demonstrandoqueo GDF-9 atua
apenasnasfasesposterioresdo crescimento
de folículospré-antrais(Mayerhoferet aI.,
1997).Comocrescimentofolicular,umaca-
vidaderepletadelíquidoéformadadentroda
camadadecélulasdagranulosaeatecator-
na-semaisestratificada.Essesfolículossão
chamadosdefolículosterciáriosoufolículos
antrais.Em ováriosbovinos,umacavidade
antralpodedesenvolver-senosfolículoscujos
diâmetrosvariamde0,14- 0,28mm(Lussier
etaI.,1987).Osfolículosantraisirãocrescer
emtamanhoe apenasum ou algunsdeles,
dependendodaespécie,iráovular.Embovi-
nos,o diâmetrofolicularaumentade0,020-
0,040mm (folículosprimordiais)paramais
de10mmantesdaovulação(lreland,1987).
Cálculosbaseadosnoíndicemitóticodascé-
lulasda granulosadefolículosantraisindi-
camqueum períodoequivalentea doisci-
closestraisérequeridoparaumfolículocres-
cerdoiníciodaformaçãodoantro,istoé,de
233
0,13mmaotamanhopré-ovulatório(Lussier
etal.,1987).
PopulaçãoFolicular
A populaçãofolicularnoovárioaonasci-
mentofoiestimadaem235.000folículosna
vaca(Betteridgeetal.,1989),160.000naove-
lha(Oriancourtetal.,1991),37.000nacabra
(Bezerra,1998)e2.000.000namulher(Eri-
ckson,1986).Entretanto,onúmerodefolícu-
lospresentesno ovárioé marcadopor uma
grandevariaçãoindividual (Cahill et aI.,
1979).Embovinos,apopulaçãofolicularpo-
devariardeOa 720.000folículosporovário
(Erickson,1966b).A populaçãoedistribuição
dosdiferentestiposfolicularesnosováriosde
animaispodemserafetadasporváriosfatores,
incluindoa raça(Cahill& Mauléon,1981),
idade(Rüsse,1983;Erickson,1966a,b),ní-
veishormonais(Peters,1976)eestadorepro-
dutivo(Ericksonetal., 1976).
Atresia Foliculare Seu Impactona Redução
Massivado Capital Oocitário no Ovário
Conformemencionadoanteriormente,o
ováriomamíferocontémmilharesdeoócitos
inclusosemfolículospré-antrais.Entretanto,
agrandemaioriadestesfolículosnãochega
atéàovulação,masaocontrário,éeliminada
pormeiodeumprocessoconhecidoporatre-
siafolicular.Evidênciasmorfológicasindicam
queexistemdoistiposdeatresia:tipoA etipo
B.NaatresiadotipoA. queéobservadamais
comumenteemfolículospré-antrais,asalte-
raçõesdegenerativasocorremprimariamente
nooócito.No tocanteàatresiadotipoB,que
ocorremaisfreqüentementenosfolículosan-
trais,asprimeirasalteraçõesocorremnascé-
lulasdagranulosa(Erickson,1986).A atresia
éumprocessofisiológico,deduraçãodesco-
nhecida,quepodeocorrerporviadegenera-
tivae/ou apoptótica.SegundoHirshfield
(1989),umfolículoatrésicopodeseridenti-
ficadopelapresençadepicnosee/ouapopto-
234
senascélulasdagranulosae/ou alterações
degenerativasdooócito.A apoptoseoumor-
tecelularprogramada(Schwartzman& Ci-
dlowski,1993)jáfoidemonstradaemfolícu-
los (TillyetaI.,1991)eigualmentesugerida
comosendoumdoselementosdaatresiafo-
licular(Hughes& Gorospe,1991).Aatresia
pareceserumdoselementosquecontrolao
númerodefolículosselecionadosatéchegar
à ovulação.A duraçãoprecisa(Henderson
etaI.,1987),bemcomooestádionoqualos
folículosovarianossãomaissusceptíveisde
sofreratresia,nãosãoconhecidos.Váriashi-
pótesesforamformuladasnotocanteaomo-
mentoda fasededesenvolvimentofolicular
noqualaatresiaocorre.Byskov(1978)sugere
queaatresiapodeocorreremqualquermo-
mentododesenvolvimentofolicular,incluin-
doa fasepré-antral.Outrosautores(Grimes
etal.,1987;Hendersonetal.,1987),parale-
lamente,relatamqueaatresiaafetaprincipal-
menteosfolículosantraisdegrandetamanho,
especialmente,quandoestesatingemumestá-
dionoqualadiferenciaçãoterminaldascélu-
Iasdagranulosaedatecaocorre.Independen-
tedafasenaqualocorree,apesardeserum
fenômenonatural,aatresiareduzdemaneira
significativao númerodeoócitospotencial-
menteovuláveis,diminuindo,consequente-
mente,aproduçãodeoócitosviáveisdurante
avidareprodutivadeumanimal.Emresumo,
o desenvolvimentodeumfolículopré-ovula-
tórioinvivo,apartirdefolículospré-antrais,
éumfenômenoraroporqueseconsideraque,
embovinos,somenteumemcadamilfolículos
primordiaisatingiráoestádiodefolículoma-
durooupré-ovulatório.
Parte 11:Manipulação de Oócitos
Inclusosem FOPA - MOIFOPA
Conceito
A MOIFOPAéumabiotécnicaquecon-
sisteno isolamentoouresgatedefolículos
pré-antraisapartirdeovários,seguidodas
/
etapasdeconservação(resfriamentooucrio-
preservação)e/oucultivofolicular,visando-
sea estocagem,bemcomo,o crescimento,
maturaçãoefecundaçãoin vitrodosoócitos
previamenteinclusosemFOPA.
Importância
Aspectosanatômicoscomoforma,tama-
nhoe localizaçãoovarianae a organização
histológicadosovários,compreendendoas
suasregiões(corticalemedular),bemcomo,
asestruturasconstituintesdo estroma(por
exemplo,tecidoconjuntivo,fibroblastos,vasos
sangüíneos,vasoslinfáticos,nervos)edopa-
rênquima(folículos,corpohemorrágico,cor-polúteo,corpoalbicans)têmsidoextensiva-
mentedescritas(Ariyaratna& Gunawardana,
1997;Rodriguesetal.,1998).Damesmafor-
ma,asduasprincipaisfunçõesgeraisdosová-
rios,istoé,endócrinaegametogênica(produ-
çãoeliberaçãodeumoócitoporocasiãoda
ovulação)sãoigualmentedescritasemdiver-
saspublicações(Saumande,1981;Pineda,
1989).Referenteàfunçãogametogênica,em-
borasesaibaqueestaresultadainteraçãode
doisprocessos,istoé,oogêneseefoliculogê-
nese,muitopoucoéconhecidosobreosfato-
resprecisosquecontrolamodesenvolvimen-
to,bemcomo,aregressão(atresia)folicular.
Apesardo desenvolvimentodefolículosan-
trais,notadamenteembovinos,tersidoam-
plamentedescrito,informaçõesconcementes
à fisiolo~iados folículospré-antraissãoes-
cassas.E sabidodeestudoshistológicos,que
osfolículosprimordiaissãoativadosetrans-
formam-se,sucessivamente,emfolículospri-
máriosesecundários.Entretanto,nãosãoco-
nhecidoscomexatidãoosmecanismosenvol-
vidosna ativaçãodos folículosprimordiais,
bemcomoaquelesimplicadosnocrescimento
defolículosprimáriosesecundários.Emresu-
mo,comparadaàfaseantral,afasepré-antral
compreendeumperíodoobscuroepoucoco-
nhecidoda foliculogênesesendo,portanto,
umvastocampoparainvestigaçõescientíficas.
Tendoemvistaqueasbiotécnicasligadas
àreproduçãotêmcomofinalidadegeraloau-
mentoda eficiênciareprodutivados reba-
nhos,seráconsideradaagoraa eficáciado
ováriocomouma "máquina"produtorae
liberadoradeóvulos.Conformeabordadona
parteI dopresentecapítulo,oováriomamí-
ferocontémmilharesdeoócito&,inclusosem
suamaioria(cercade90%)nosfolículospré-
antrais.Apesardesteenormecapitaloocitário,
umaínfmIaproporçãodestesoócitos(cercade
0,1%)seráovuladae,conseqüentemente,po-
derãoteralgumapossibilidadedeseremfe-
cundados.Conformeoexpostoacima,consi-
derando-seo fatodequeaquasetotalidade
dosoócitosseráeliminadapeloprocessode
atresia,casoelespermaneçamnointeriordos
ovários,abiotécnicadeMOIFOPA sefunda-
mentaemdoisobjetivosprincipais,a saber:
1) resgatarou isolaros FOPA a partirdos
ováriosantesqueelessetomematrésicose
2) cultivarosFOPAe, consequentemente,os
oócitosimaturosnelesinclusos,atéoestádio
dematuração,prevenindo-osdaatresia.
A biotécnicade MOIFOPA é degrande
importânciatantoparaapesquisafundamen-
taloubásica,quantoparaa reproduçãoani-
mal.No tocanteàpesquisafundamental,esta
biotécnicapoderácontribuirparaelucidação
dosmecanismos,hojedesconhecidos,impli-
cadosna foliculogênesena fasepré-antral.
Nessecaso,os FOPA isoladosdo ambiente
ovariano,bemcomodainfluênciaendócrina,
nutricionalesanitáriacomumnoorganismo
animal,poderãosercultivadosinvitroempre-
sençade diferentessubstânciasconhecidas
(matrizextracelular,hormônios,fatoresde
crescimento,carboidratos,aminoácidos,etc.),
cujoefeitoindividualouassociadopoderáser
avaliadoecontroladoemdiversosexperimen-
tos.Osresultadosoriundosdessesexperimen-
tospermitirãoaelucidaçãodosmecanismos
envolvidostantonaativaçãodosfolículospri-
mordiais,quantonocrescimentodefolículos
primáriosesecundários.
235
Referenteà reproduçãoanimal,no futu-
ro,o isolamentodemilharesdeFOPAa par-
tir deumúnicoovárioe o posteriorcultivo
in vitro dosoócitosnelesinclusosatéoestá-
diodematuração,poderácontribuirparaa
multiplicaçãodeanimaisdealtovalorzoo-
técnicoouemviadeextinçãopormeiodo
fornecimentodeumgrandenúmerodeoóci-
tosoriundosdeummesmoanimal,quese-
riamcrescidosematuradosin vitro,eutiliza-
dosposteriormentenasbiotécnicasdeFIV
eclonagem.O fornecimentodeumapopula-
çãohomogêneadeoócitosoriundosdeum
mesmoanimalproporcionadopelabiotécni-
cadeMOIFOPA contribuirátambémparaa
padronizaçãodetécnicas,comoaclonagem,
FIV etransgênese,umavezqueserãodeuma
populaçãodeoócitosemummesmoestádio
de desenvolvimentoe de mesmaorigem.
Dessaforma,abiotécnicadeMOIFOPA po-
deráotimizara utilizaçãodeováriosdea)
animaisjovens(fetos,recém-nascidoseani-
maispré-púberes);b)animaiseliminadospor
razõessanitárias,desdequenãohajacom-
prometimentodoovário;c)animaisquenão
respondemaostratamentosconvencionais
desuperovulação;d) animaiscompatologias
gravesnosovidutose/ou útero;e) animais
mortos,desdequeacolheitadosováriosseja
realizadaantesqueasuadegeneraçãoocor-
ra.Umaoutraconseqüênciaimediatadesta
novabiotécnicaéacriopreservaçãodeFOPA
isoladosou insitu(nointeriordetecidoova-
riano)a qualpoderiater umaimportância
capitalnaconstituiçãodebancosdegermo-
plasmaanimalquevisariaaconservaçãode
oócitosdeanimaisdealtovalorzootécnico
e/ouemperigodeextinção.A vantagemda
criopreservaçãodeFOPA ésemelhanteado
sêmen.Tendoemvistaaprevalênciadosfo-
lículospré-antraissobreos folículosantrais
(90%contra10%),milharesdeoócitosneles
contidospoderiamserrecuperadosapartir
236
deumováriodeummesmoanimal,congela-
doseestocadospor longosperíodos(meses
aanos),preservandodestaformaomaterial
genéticodaespécieemquestão.A criopre-
servaçãodeFOPA tambémpodeserdegran-
de importânciapara a medicinahumana,
poispoderepresentarumaexcelentealterna-
tivaparamulheresqueapresentamproble-
masdeconcepção,ouquesãosubmetidasa
tratamentoquimioe/ouradioterápico.Final-
mente,outragrandeimportânciadabiotéc-
nicadeMOIFOPA emcurtoprazorefere-se
àformaçãoderecursoshumanos,poisno in-
tuitodedesenvolverprotocoloseficientesde
isolamento,congelaçãoe cultivode FOPA,
váriasdissertaçõesetesespoderãoserreali-
zadas.As vantagensdoempregoatuale/ou
futurodabiotécnicadeMOIFOPA estãore-
sumidasabaixo:
.Aumentoda eficiênciareprodutivade
animaisdealtovalorzootécnicoouem
perigodeextinção;.Reduçãodo intervaloentregerações;.Recuperaçãoderebanhoseliminados
porproblemassanitários;.Utilizaçãodeováriosdeanimaisque
nãorespondematratamentosdesupe-
rovulação;.Utilizaçãodeováriosdeanimaisporta-
doresdepatologiasgravesdeovidutos
e/ouútero;
.Permitea obtençãode descendentesde
umanimalmesmoapósa suamorte;.Otimizaçãodautilizaçãodebiotécnicas
comoa FIV,clonagem,transgênesee
transferênciadeembriões;
.Padronizaçãodasbiotécnicasde FIV,
clonageme transgênese;.Pesquisafundamental:fonteabundante
deinformaçõesarespeitodafoliculogê-
nesena fasepré-antral;.Formaçãoderecursoshumanos.
Isolamento in vitrddeOócitosInclusosem
FolículosOvarianosPré-antrais
~ BasesGeraisda Técnicade Isolamento
Folicular
A utilizaçãodapopulaçãodeFOPA para
criopreservaçãoe/oucultivoin vitronoâm-
bitodaspesquisasfundamentale aplicada
(futuro)éprecedidadoempregodemétodos
eficazesquepermitamo isolamentodeum
grandenúmerodeFOPAa partirdosovários.
Parao isolamentodeFOPA podemserutili-
zadosmétodosmecânicose/ouenzimáticos.
Naliteratura,osprimeirosregistrosdeestu-
dosdeFOPA isolados,respectivamente,em
animaisdelaboratório(Grob,1964- camun-
dongo)edomésticos(Figueiredoetal.,1992
- bovinos)ocorreramnasdécadasde 60 e
90utilizando-seprocedimentosenzimáticos
e mecânicos,respectivamente.O princípio
dosmétodosdeisolamentofolicularconsiste
na dissociaçãoou separaçãodos folículos
pré-antraisdosdemaiscomponentesdoes-
tromaovariano(fibroblastos,fibrascoláge-
naseelásticas,fibronectina,etc.)utilizando-
separaisto,instrumentosmecânicosassocia-
dos ou não aosquímicosou enzimáticos.
Nos procedimentosmecânicos,os equipa-
mentosmais comumenteutilizadossãoo
tissuechopper,míxer,tesourascirúrgicas,pe-
BOVINO
Wandjietai.,1996
50FOPA (feto)
quenosfórcepseagulhasdissecantes.Refe-
renteaosprocedimentosenzimáticos,asen-
zimasproteolíticasmaisutilizadassãoacola-
genase,tripsinaepronase,sendoaprimeira
empregadanamaioriadostrabalhos.
Métodosenzimáticosdeisolamentodefo-
lículospré-antraisforamdescritosnãoapenas
emanimaisdelaboratório(camundongo:Car-
roil etal., 1991a,b;rato:Oanieletal., 1989;
hamster:Roy& Greenwald,1985;coelho:Ni-
cosiaet al., 1975),mastambémemsuínos
(Greenwald& Moor, 1989;Hirao et aI.,
1994),gatos(Jewgenow& Pitra,1993),fetos
bovinos(Carambulaetal., 1996aefetosovi-
nos (CarambulaetaI., 1996b)e humanos
(Roy& Treacy,1993).Emcontrasteaospro-
cedimentosenzimáticos,métodosmecânicos
têmsidomaiscomumenteusadosparao iso-
lamentodefolículospré-antraisdeováriosbo-vinos(Figueiredoetal.,1992;NuttincketaI.,
1993b;Hulshofetal.,1994),emborapoucos
trabalhosem caprinos (Rodrigueset aI.,
1996),ovinos(Amorimetal.,1996)efelinos
(Jewgenow& Pitra,1993)tenhamsidodes-
critos.Os rendimentos(númeromédiode
FOPA isoladosporovário)deprocedimentos
enzimáticosemecânicosemováriosdedife-
rentesespéciessãomostradosnasfiguras11.4
e 11.5,respectivamente.Conformepodeser
BOVINO
Carambulaetai.,1996
3470FOPA(feto)
OVINO
Carambulaetai.,1996
1084FOPA(feto)
HUMANOS
Roy & Treacy,1993
760FOPA (jovens)
544FOPA (adultas)
"
I
CAMUNDONGO
Eppig, 1976
Greenwald
& Moor,1989
180.000FOPA
HAMSTER
Roy& Greenwald,1985
Figura11.4.Númeromédiodefolículosovarianospré-antraisisoladosemváriasespéciesutilizandoprocedimentoenzimático.
237
BOVINO
FigueiredoetaI., 1992
2142(feto);512(novilha);
298(vaca)
BOVINO \
Nuttincketal.,1993
90 FOPA (vaca)
CAPRINO
RodriguesetaI.,1996
1126FOPA (cabra)
BOVINO
HulshofetaI.,1994
2918FOPA(feto)
BOVINO (ZEBU)
deBemetaI.,1997
70075FOPA (vaca)
SILVESTRES
Jewgenow&
Stolte,1996
1867FOPA.
CAPRINO
Lucci etaI.,1997
10140FOPA (cabra)
OVINO
AmorimetaI., 1998
6368FOPA (ovelha)
Jewgenow&
Stolte,1996
2892FOPA
Figura11.5. Númeromédio de folículosovarianospré-üntraisisoladosemváriasespéciesutilizandoprocedimentomecânico.
observado,independentedotipodeprocedi-
mento(mecânicoouenzimático)podemser
isoladosdedezenasamilharesdefolículospré-
antraisporovário.Diantedoexposto,con-
clui-seque,devidoàgrandeeficiênciadosmé-
todosdisponíveis,aobtençãodeoócitosin-
clusosemfolículospré-antraisisoladosnão
constituiumempecilhoparaodesenvolvimen-
todabiotécnicadeMOIFOPA.
~ Protocolode Isolamentode FOPA
Bovinosin vitro
A títulodeexemplopráticoreferenteao
isolamentomecânicodeFOPA seráilustrado
edetalhadoabaixooprocedimentomecânico
simplesdesenvolvidoparabovinos(Figueire-
doetaI.,1993a)queéempregadocomoro-
tinaemdiferenteslaboratórios.Nesseproce-
dimento,o isolamentomecânicode FOPA
consisteemquatroetapas,descritasaseguir:
19 - Obtençãoe TratamentoPreliminardo
Ovário:
Os ováriosoriundosde animaismortos
(obtidosemmatadouro)ouvivos(apósova-
riectomia)sãocolocadosemmeiosapropria-
dos(exemplos:soluçãodeNaCIa0,9%,PBS,
M 199),transportadosaolaboratórioemre-
238
cipientestérmicosatemperaturasquevariam
de4°Ca39°C.Osmeios,bemcomo,astem-
peraturasutilizadasdependemdafmalidade
doestudo.No laboratório,osfolículosantrais
superficiaissãopuncionadoscomumapeque-
naagulhaparaaeliminaçãodofluidofolicu-
lar. Em seguida,os ováriossãoseccionados
comumalâminadebisturidemodoaobter
duasporçõesdoovário.Posteriormente,pro-
cede-sea remoçãodasestruturasovarianas:
corpoálbicans,corpolúteoecorpohemorrá-
gico,visandoobterumamelhorfragmentação
doováriono tissuechopper.
29- Fragmentaçãodo OvárionoTissue
Chopper:
Nestaetapa,asduasporçõesdecadaová-
riosãoseccionadas(sentidocórtíco-medular)
em pequenosfragmentosutilizando-seo
tissuechopperpreviamentereguladoparaa
realizaçãode cortesemintervalosseriados,
deacordocoma espécie(bovino- 50 '..1m:
Figueiredoetal.,1992;caprlno- 75J.lffi:Lucci
etal.,1998;ovino- 87,5/lm:Amorimetal.,
1998).Paraseobterumafragmentaçãomais
eficiente,oovário,notissuechopper,éumidi-
ficadocomM199 acrescidode 5%de soro
sangüíneo(M 199+),e cortadonossentidos
\
longitudinal,transversaleoblíquo.Emsegui-
da,osfragmentosovarianosobtidossãotrans-
feridosparatubosde50mI,contendo15mI
deM 199+eressuspendidosnestemeio.
39- DissociaçãoMecãnicados
FragmentosOvarianos:
Paraotimizaro processode isolamento
dosfolículospré-antrais,osfragmentosova-
rianospresentesnasuspensãoobtidosnaeta-
paanteriorsãodissociadosmecanicamente,
atravésderepetidosmovimentosdesucçãoe
ejeção,utilizando-sepipetasdePasteurcali-
bradasa 160011me60011mdediâmetro.
49- Separaçãode FoIículosIsoladospor
Meio de FiltraçãoSimples:
Apósadissociaçãomecânicacompipetas
dePasteur,asuspensãoobtidanaetapaante-
rior é sucessivamenteftltradaemmalhasde
náilonde50011me10011mdediâmetro,com
afinalidadedesepararosfolículospré-antrais
isoladosdosfragmentosdetecidoovariano
> 100Jlill dediâmetro,retidosnasmalhasde
10011m.Logoapós,ofIltradoobtidoélevado
ao microscópioinvertidovisandoa identifi-
cação,contagem,classificaçãoemanipulação
dosFOPA O procedimentomecânicosim-
plesdeisolamentodefolículospré-antraisé
ilustradonasfiguras11.6e 11.7.A figura
11.8ilustraosdiferentestiposdeFOPA bo-
vinos(primordiais,primáriosesecundários)
presentesnassuspensõesobtidasapósisola-
mentomecânico.
Cultivo ;n v;trode FOPA
~ BasesGeraisdoCultivodeFolículos
Pré-antrais
O objetivoprincipaldocultivoinvitrode
FOPA é o depermitiro desenvolvimento
folicularassegurandoocrescimentoematu-
raçãodosoócitos,bemcomoamultiplicação
eposteriordiferenciaçãodascélulasdagra-
nulosainclusasnessesfolículos.O sistema
Procedimentomecânicosimples
(FigueiredoetaI.,1992)
+
Dissociaçãomecânica
Filtração*OOllm)
+
Filtração(100Ilm)
suspensãt<lOOllm
+
Contagem
+
Folículosisolados
+ i +
Primordial Primário Secundário
Figura 11 .6. Procedimento mecânico simples de isolamento
de FOPA a partir de ovários bovinos.
decultivoidealdevepreenchertrêsrequisi-
tosbásicoseseqüenciais,a saber:preservar
a viabilidadedos folículos,conservarsua
aparênciamorfológicapré-existentein vivo
e,finalmente,desdequemantidasascondi-
çõesprecedentes,asseguraro crescimento
ematuraçãofolicular.Especialmentenoto-
cantea animaisdomésticos,os sistemasde
cultivodisponíveispreenchemsomentepar-
cialmenteosrequisitossupracitados.A com-
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