Bioténicas Aplicadas em Reprodução Animal (13)

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recemserimportantesparaasobrevivênciae
crescimentodefolículospré-antraisbovinos
isolados.Osprincipaisresultadosconcemen-
tesaodesenvolvimentodefolículospré-an-
traisbovinosinvitronapresençaouausência
desoro,hormônios,peptídiose fatoresde
crescimentoserãomostradosa seguir.
NuttincketaI. (1993a)mostraramque
os folículospré-antraisde vacasisolados
mecanicamentee cultivadospor 7 diasso-
bre uma monocamadade fibroblastosde
embriõesdecamufldongosirradiados,utili-
zando-seum meiosuplementadocom 10%
deNCS (newbomcalíserum),foramcapa-
zesdesobreviveremedesenvolvereminvitro.
Essesautores~bservaramque73%dosfolí-
culossobreviveram,mostrandoumaumen-
to do diâmetrofolicularde5 a 30 /lm e no
conteúdodeDNA de 1% a 72%.
Hulshofetalo(1995)avaliaramo efeito
dohFSH (FSH-humano)e/ou17~-estradiol
nocrescimentoin vitrodefolículospré-an-
traisdevaca,mecanicamenteisolados.Eles
tambémdemonstraramquepequenosfolícu-
lospré-antraisbovinospodemsercultivados
por 7 diasnaausênciadesoroehormônios,
aumentandoo seudiâmetro.Tambémfoies-
tabelecidoqueo FSH aumentaa prolifera-
çãocelulareo estradiolécapazdeinduziro
aumentonotamanhodascélulas.Quandoos
folículosforamestimuladoscomFSH e es-
tradiol,foi observadaa combinaçãodeseus
efeitos,aumentandoo crescimentofolicular.
Wandjietalo(1996a)estudaramo efeito
dooFSH (FSH-ovino),EGF,bFGF eTGF~
no desenvolvimentoeatividadeesteroidogê-
nicadefolículospré-antraisdefetosbovinos
isoladosenzimaticamente.Elesdemonstra-
ramqueaproliferaçãodascélulasdagranu-
losadefolículospré-antraisbovinospodeser
estimuladapelobFGF,FSH eEGF, enquan-
to o TGF~ inibeo seucrescimento.O FGF
bovinoeoTGF~antagonizamaestimulação
deFSH naproduçãodeesteróidepelascélu-
Iasdagranulosacultivadasdefolículospré-
antraisbovinos.Gutierrezetal (2000)mos-
traramque19%defolículosbovinoscultiva-
dosemumsistemadesenvolvidoparacélulas
dagranulosabovinassemFSH oufatoresde
crescimentoatingirame estádioantral.Por
outrolado,aadiçãodeEGF ouFSH aumen-
toupara55%ataxadedesenvolvimentoaté
o antro(GutierrezetaI.,2000).Outroexpe-
rimentorevelouqueo FSH eo EGF adicio-
nadodoFSH podeserrecomendadoparao
cultivoin vitrodefolículosbovinosmenores
(40,60e 80/lm- Sahaetal.,2000).
Wandjietalo(1996b)demonstraram,pela
primeiravezquefolículosprimordiaisbovi-
nospresentesemfragmentossuperficiaisdo
córtexovarianodefetossobrevivem,e ini-
ciamo crescimentoin vitroemaltastaxas'
(94%)emmeiodeculturasemsoro.Além
disso,relataramquea expressãodo PCNA
(proliferatingcellnuclearantigen)pelascé-
lulasdagranulosaeoócitoestáintimamen-
teassociadacomo iníciodocrescimentodo
folículoprimordial.
Os efeitosdoVIP eativinaA napresença
ouausênciadehFSH (Hulshof,1995)sobre
o desenvolvimentodefolículospré-antraisde
vacasisoladosmecanicamentetambémforam
investigados.Osresultadosdessesestudosre-
velaramqueoVIP estimulaodesenvolvimen-
todefolículospré-antraisbovinos.A ativinae
receptoresparaativinaforamimunohistologi-
camentelocalizadosemfolículospré-antrais
bovinos.O papeldaativinanodesenvolvimento
defolículospré-antraiséconfirmadopeloseu
efeitoestimulatórionocrescimentofoliculare
proliferaçãodascélulasdagranulosa,efeitode-
pendentedesuaconcentração.A ativinatam-
bémtemumaaçãosinérgicacomo FSH no
desenvolvimentofolicular.
Katska& Rynska(1998)relataramque
folículospré-antraisbovinoscultivadosem
TCM 199 suplementadocom FSH, 17~-
estradiol,insulina,trasferrinae selênio,pi-
245
ruvatode sódio, glutaminae hipoxantina
apresentaramviabilidadee crescimentofo-
licularsuperiorquandocomparadoaomeio
semsuplementação.
Contrariamenteaosefeitosbenéficosdo
FSH sobreo desenvolvimentoin vitrodefo-
lículospré-antraisbovinosdescritosanterior-
mente,Nuttincketalo(1996)mostraramque
opFSH (FSH-porcino)induzadegeneração
empequenosfolículospré-antraisbovinose
queessadegeneraçãopareceseratenuada
peloFGF-2. Essetrabalhotambémdemons-
trouqueo FGF-2levaaoaumentodasíntese
deDNA folicular,aqualnãoéobservadana
presençado pFSH. A discordânciaentreos
resultadosobtidosporNuttincketalo(1996)
e o dosautoresmencionadosacima,no to-
canteao efeitodo FSH sobreo desenvolvi-
mentodeFOPAbovinoin vitroé,provavel-
mente,devidoàsdiferençasnosprocedimen-
tosde isolamentofolicular,bemcomo,nos
diferentessistemasdecultivosempregados.
A influênciade diferenteshormônios,
fatoresde crescimentoe outrospeptídios
sobrea ativaçãoe crescimentoin vitrode
FOPA bovinosé ilustradana figura11.11.
CriopreservaçãodeOócitosImaturos
Oriundosde FolículosPré-Antrais
~ PrincipaisAvanços
A criopreservaçãodeoócitoséumaalter-
nativaparaconservaro materialgenéticode
espéciesouraçasdeanimaisdomésticosque
sãoutilizadoscomercialmente,bemcomode
mamíferossilvestres.Essatécnicatambémé
importantena medicinahumanaparaesto-
caroócitosdemulherescomproblemasre-
produtivosousubmetidasatratamentoradio
e/~uquimioterápico(nocasodecânceres),
reduzindoassimosproblemaséticos,legaise
moraisquegeralmenteestãoassociadoscom
aestocagemdeembriões(Shawetal.,2000).
Os oócitosutilizadosparaacriopreservação
podemserimaturos(origináriosdefolículos
pré-antraisou terciários)e maturos,oriun-
dosdepunçãodefolículospré-ovulatóriosou
obtidosapósmaturaçãoin vitro.A despeito
daconsiderávelpesquisarealizadaduranteos
últimos15anos,o progressoobtidonacrio-
preservaçãode oócitosmaturostemsido
muitolimitado(Parks& Ruffings,1992).Os
oócitosmaturostêmsidocriopreservadosuti-
lizando-seosprotocolosdecongelaçãolenta
erápida,bemcomodevitrificação.Entretan-
Figura11.11. Influênciadoscomponentesdo meiodecultivosobrea ativaçãoe crescimentode FOPAbovino
in vi/ro.
246
Nuttinck etaI., 1993 Figueiredo etaI., 1994 Hulshof etaI., 1995
20% de Soro 10% de FCS VIP e ativina
+ + + +
I
TI
PRIMORDIAIS
t+ t+ t- t+t+ t+ t- t+ t-
Meio semsoro FSH eE2 Hulshof FSH, EGF, FGF eTGF - f3 FGF eFSH
WandjietaI.,1996 etaI.,1996 WandjietaI.,1996 NuttincketaI.,1996
to,astaxasdefecundaçãoedesenvolvimento
invitrosãomuitoinferioresasdeoócitosnão
criopreservados.Apesardosoócitosmaturos
seremparticularmentesensíveisaosprocedi-
mentosdecriopreservação,algunsprogres-
sostêmsidoobtidosinicialmentecomaadap-
taçãodeprotocolosempregadosemembriões
(Parks& Ruffings,1992).Resultadosfavo-
ráveistêmsidorelatadosemcamundongos
(CarrolletaI.,1993;Men etal., 1997),coe-
lhos(Vincentetal.,1989)ehumanos(Gook
etaI., 1995).Todavia,tantoemanimaisde
produçãoquantoemhun:anos,estatécnica
aindanão foi completamentedesenvolvida.
Especificamenteemruminantes,a maioria
dostrabalhossobrecriopreservaçãodeoóci-
tosmaturostemsidorealizadaembovinos
(Fukuetal.,1992,1995),utilizando-se,prin-
cipalmente,oDMSO eo PROH, comocrio-
protetoresemprocedimentosdecongelação
lenta(Um etal.,1999;DemircietaI.,2001)
e rápida(GooketaI.,2000).
Característicascitológicasespeciaisdos
oócitosmaturos,taiscomofuso meiótico,
grânuloscorticaise citoesqueletotêm se
mostradosusceptíveisadanosduranteo res-
friamentoe a exposiçãoaoscrioprotetores
(Rall, 1992).Essaexposiçãoe a posterior
criopreservaçãoestãoimplicadosnoaumen-
to da incidênciadeanormalidadesno fuso
meiótico,noiníciodaativaçãopartenogené-
ticaeno estímulodaliberaçãodosgrânulos
corticais.A criopreservaçãopodetambém
aumentaraincidênciadeperdacromossômi-
cano fusomeióticoe,nessescasos,nãose
podeobterresultadosfavoráveisnafecunda-
ção (WoodetaI., 1997).Em experimentos
defecundaçãoinvitro,ocitoesqueletodeoó-
citos maturosde camundongassofreram
rupturadarededeftlamentosedesorganiza-
çãodofuso,levandoàdispersãodoscromos-
somos(ErogluetaI., 1996).
Maisrecentemente,acriopreservaçãode
folículospré-antraisvemsendoconsidera-
dacomoumagrandealternativaparaaesto-
cagemdeumgrandenúmerodeoócitosima-
turosobtidosa partirdeum únicoanimal.
Os oócitosinclusosemfolículospré-antrais
possuemváriascaracterísticasqueostornam
menossuscetíveisà crioinjúriado queos
oócitosmaturos(GosdenetaI.,1994;Shaw
etaI.,2000).Dentreelas,asmaisimportan-
tessão:o menortamanhodo oócito,bem
comodassuascélulasdesuporte(célulasdagranulosa),suabaixataxametabólica,está-
diodociclocelular(núcleonoestadodepró-
fasedaprimeiradivisãomeiótica),número
restritodecélulasdagranulosa,ausênciade
zonapelúcidaedegrânuloscorticaisperifé-
ricoseapequenaquantidadedelipídiosin-
tracitoplasmáticossensíveisàsbaixastempe-
raturas.Todasessascaracterísticassãopo~
tencialmentebenéficasparaa criopreserva-
ção.Umavezqueagrandemaioriadosoóci-
tosencontra-seinclusaemfolículospré-an-
traise queessesoócitosnãopossuemum
fuso meiótico,os riscos citogenéticossão
menoresnasdivisõessubseqüentes(Oktay
etal.,1998).Portanto,elessãopoucosusce-
tíveisàsaberraçõescromossômicas(Candy
etaI., 1994)e,conseqüentemente,maisre-
sistentesaosprocedimentosdecongelação.
Alémdisso,diferentementedosoócitosma-
turos,osfolículosprimordiaispossuemtem-
poparareparardanossubletaisnasorgane-
Iaseemoutrasestruturasduranteasuapro-
longadafasedecrescimento,queocorreria
duranteo cultivoin vitro.Entretanto,ainda
nãoháumnúmerosuficientedeexperimen-
tosnestaáreaparacomprovaressasuposi-
ção(OktayetaI.,1998).
Os oócitosinclusosemfolículospré-an-
traispodemsercongeladosinsitu,istoé,no
interiordo própriotecidoovariano(Coxet.
al., 1996;NewtonetaI.,1996;Candyetal.,
1997)ouapósisolamento(Cortvrindtetal.,
1996;Jewgenowetal.,1998).Atualmente,a
criopreservaçãodo córtexovariano,paraa
247
medicinahumana,temsidoumaalternativa
promissoraparaapreservaçãodafertilidade
(Oktayetal.,1998,Newton,1998).Alémda
perdanatural(atresia)defolículospré-antrais
queocorrein vivo,emhumanosdepara-se
comosproblemasdeinfertilidadeprematura
comoresultadodotratamentodecertoscân-
ceres,incluindoaltasdosesquimioterápicas
eirradiaçãoabdominal(Nugentetal.,1997).
Na medicinahumana(Newtonetal., 1996;
Newton,1998;Newtonetal.,1998)eemani-
maisdelaboratório(Coxetal.,1996;Guana-
senaetal., 1997a,b),os pesquisadorestêm
concentradoseusesforçosparaacriopreser-
vaçãodefolículospré-antraisinsituoEsseses-
tudostêmdemonstradopor análisehistoló-
gica,quefolículospré-antraispresentesnote-
cidoovarianoapósacongelaçãoedescongela-
çãoapresentam-semorfologicamentenormais
(Hovattaetal.,1996;Candyetal.,1997).Des-
saforma,o tecidoovarianocongelado,con-
tendoosfolículospré-antrais,podeserutili-
. zadoposteriormenteparatransplantes.Ca-
mundongasovariectomizadase auto-trans-
plantadascomtecidoovarianofrescooucon-
geladoe descongelado,apresentaramciclos
estraisregularespós-transplanteem75e80%
dosanimais,respectivamente(Harp et aI.,
1994).Tecidoovarianodesagüiscriopreser-
vadotambémtemsidotransplantadosoba
cápsularenalde camundongasimunodefi-
cientes.Nos enxertosrecuperados21 a 32
diasdepois,observaram-sefolículosemtodos
osestádiosdafoliculogênese,incluindofolí-
culosantraisde1a2mmdediâmetro(Candy
etal., 1995).Resultadossimilarestambém
foramobtidospor Hovattaetalo(1996)em
humanos,utilizando-seo DMSO eo PROH
comocrioprotetores.Cox etaI. (1996)de-
monstraramqueováriosfetaiscongeladose
descongeladosquandotransplantadosrecu-
peraramafertilidadeemcamundongas,mos-
trandoque73a86%dosanimaismostraram-
segestantes.O transplanteparaumambien-
248
tediferentein vivopodeserumaalternativa
paraaconstituiçãodebancosdetecidoova-
rianocongelado(Newton,1998).Fragmen-
tosdeovárioovino(GosdenetaI., 1994)e
primatanãohumano(Candyetal.,1995)en-
xertadossobacápsularenaldecamundongos
imunodeficientes,demonstrourevasculariza-
çãoecrescimentofolicular.Ademais,folículos
presentesnotecidoovarianohumanocresce-
ramatéoestádioantral(maisde5mmdediâ-
metro)apósseissemanasdeestimulaçãoexó-
genaeomFSH (Oktayetal.,1998).Embora,
atéomomento,nãotenhasidodemonstrado
queo tecidoovarianocriopreservadopossa
restaurara fertilidadeemhumanos,o nasci-
mentodeanimaisviáveistemsidoobtidoa
partirdeenxertodetecidoovarianocongelado
edescongeladoemcamundongos(Carroll&
Gosden,.1993;Gunasenaetal.,1997a,b).Em
animaisdomésticoscomoosovinos,aviabili-
dadefoliculartambémjá foi demonstrada
atravésdaanálisehistológicadetecidoovaria-
no congeladoe descongelado(Salleet aI.,
1998).Bairdetalo(1999)realizaramauto-
transplantede tecidoovarianoem ovelhas
apósdescongelaçãoe observaramaumento
nosníveisdeprogesteronaquatrosemanas
apóso enxerto.Porém,nessaespécie,osresul-
tadosmaisencorajadoresforamreportados
porGosdenetalo(1994),osquaisrelataram
nascimentoapóso transplantedetecidoova-
rianocongeladoedescongelado.
Emboraresultadossatisfatóriosreferentes
àcongelaçãodetecidoovarianojátenhamsi-
doobtidosemalgunsanimaiscomocamun-
dongas(Candyetal.,1997;GuanasenaetaI.,
1997a,b),coelhas(Danieletal.,1983),ove-
lhas(Gosdenetal.,1994;Salleetal.,1999)e
atémesmoemmulheres(Newtonetal.,1996,
1998),a formaçãodegelointracelularainda
. poderepresentaremalgunscasos,umentrave
parao sucessodacriotecnologia.Em tecido,
aformaçãodegelointracelulartemmostrado
sermuitomaisprevalentee podeocorrera
umataxasignificativamentemaiordoquepo-
de ser atingidanascélulasem suspensão
(Acker& McGann,1998).A criopreservação
detecidoésubstancialmentediferentedacrio-
preservaçãodecélulasemsuspensão,como
osfolículospré-antraisisolados,porexemplo.
Emumtecidoorgaf\Ízado,adifusãodeágua
ecrioprotetoresnãoéfacilitada.Váriostipos
celularesemum tecidodesempenhamuma
contribuiçãoparaa funçãodo mesmo.Por-
tanto,asobrevivênciadecadatipocelularpós-
descongelaçãoé extremamenteimportante
(Harpetal.,1994).O tecidodoestromaova-
rianoémuitoricoemcélulas,asquaisestão
juntamenteposicionadas.Portanto,a forma-
çãodegelonoespaçointercelularpodedani-
ficarfacilmenteascélulasequebraracomu-
nicaçãointercelularnecessáriaparaaintegri-
dadedotecido(Sugimotoetal., 1996).
Umapossívelalternativaparareduziras
injúriascausadaspelaformaçãodegeloin-
tracelularseriaacongelaçãodefolículospré-
antraisisolados.No entanto,esseprocedi-
mentotemsidoestudadoapenasemcamun-
dongosefelinos.Utilizandofolículosprimor-
diaisdecamundongosisoladosenzimatica-
mente,que foramcongeladoslentamente
comDMSO,CarrolletaI.(1990)consegui-
ramo nascimentodeumanimalvivoapósa
fecundaçãodooócitocultivadoin vitro.Em
umoutrotrabalho,CarrolletaI. (1991b)re-
lataramquea criopreservaçãonãoafetao
crescimentoeo desenvolvimentodofolículo
e nema habilidadedo oócitoderetomara
meiose,demonstrandoassim,queépossível
estocarumgrandenúmerodefolículospara
oseusubseqüentedesenvolvimentoin vitro.
Em umaprimeiratentativadecongelarfolí-
culospré-antraisdegatas,JewgenowetaI.
(1995),utilizandoumprocedimentodecon-
gelaçãolenta,empregandooDMSO, relata-
ramqueapenascercade 12%dosfolículos
queforamcongelados,encontravam-sein-
tactosapósadescongelação.Posteriormente,
Jewgenowetalo(1998)testaramdiferentes
crioprotetores(DMSO, PROH, EG eglice-
rol) tambémparaa congelaçãolentadefo-
lículospré-antraisfelinoseobservaramque
somentequandoo glicerolfoi empregado,
houveumadiminuiçãononúmerodefolícu-
loscomoócitoecélulasdagranulosaintactos
quandocomparadocomfolículosnãocon-
gelados(controle).A percentagemdefolícu-
losviáveisutilizandoosdemaiscrioproteto-
resfoi similarao controle.
~ Protocolode Criopreservaçãode FOPA
Caprinos
A títulodeinformação,aseguirseráapre-
sentadooprotocolodecriopreservaçãodefo-
lículospré-antraiscaprinosutilizadonolabo-
ratóriodeManipulaçãodeOócitoseFolículos
OvarianosPré-antrais(IAM OFOPA).Os ová-
rios caprinosobtidosem abatedourossão
transportadosatéaolaboratórioaumatempe-
raturade20°C.No laboratório,oovárioédi-
vididoempequenosfragmentos(3a5mm)e
equilibradosa 20°C por um períodode20
minnapresençadeumasoluçãocrioprotetora
compostapor MEM adicionado1,5M de
DMSO e 10%deFCS. Ao términodos20
min,osfragmentosovarianossãotransferidos
paraum freezerprogramável,previamente
resfriadoa20°Ceresfriadosaumavelocidade
de2°C/mina-7°C. O tecidoovarianoéen-
tãomantidonessatemperaturaduranteain-
duçãodaformaçãodecristaisdegelo(see-
ding).O seedingérealizadomanualmente,uti-
lizando-seumapinçapré-resfriadaemnitro-
gêniolíquido.Em seguida,a temperaturaé
reduzidaa0,3°C/minatéatingir-33°Cquan-
doentão,osfragmentosovarianossãoremo-vidosdofreezeremergulhadosemnitrogênio
líquidoa -196°C.
Paraadescongelação,osfragmentosova-
rianossãorapidamenteexpostosàtempera-
turaambientepor 1mineentãoimersosem
banho-mariaa 37°C por um períodosufi-
249
cienteparaocorrera descongelaçãototal.
Apósadescongelaçãoérealizadaaremoção
do crioprotetor.Paraisso,cadafragmento
ovarianoésubmetido,separadamente,atrês
lavagenssucessivasemMEM, realizadasa
intervalosde5minoApósaremoçãodocrio-
protetor,os fragmentosovarianospoderão
sersubmetidosao isolamentofolicular.
No casodacriopreservaçãodefolículos
pré-antraisisolados,oprotocoloutilizadono
lAMOFOPA é,resumidamente,o seguinte:
amostrasdesuspensãofolicular,de0,9 mI
sãoadicionadasdamesmaquantidade(0,9
mI) desoluçãocrioprotetorae transferidas
paratuboseppendorfeequilibradasa20°C
porumperíodode20minutos.Apósoperío-
dodeequilíbrio,osfolículospré-antraisiso-
ladossãocongeladosutilizando-seo proto-
colodescritoanteriormentedescritoparaos
folículospré-antraisinsituoParaadesconge-
lação,ostuboseppendorfcontendoosfolícu-
losisoladoscriopreservadossãorapidamente
aquecidosà temperaturaambientepor um
minutoe entãoimersosembanho-mariaa
37°Cporumperíodosuficienteparaocorrer
adescongelaçãototal.Emseguida,érealiza-
daa remoçãodocrioprotetor.Paraaremo-
çãodocrioprotetor,asuspensãodefolículos
é submetidaa trêslavagenssucessivasem
meioMEM suplementadocom10%deFCS
à temperaturaambiente,realizadasa interva-
losdecincominutos.Apósesseprocedimento,
osfolículospré-antraispoderãosersubme-
tidos,posteriormente,ao cultivoin vitro.
EstadoAtualda BiotécnicadeManipulação
in vitrode FOPA
Superadaa etapadedesenvolvimentode
métodoseficazesparao resgatedeFOPA a
partirdosovários,o grandedesafiodospes-
quisadoresconsisteno desenvolvimentode
sistemasdecultivoespeciaisqueproporcio-
nemcondiçõesadequadasparaodesenvolvi-
mentoótimodeFOPA in vitro.Na literatura,
250
umavariedadedeexperimentosrealizadosem
animaisdomésticoscomo:gatas(Jewgenow,
1996;Jewgenowet aI., 1998),marsupiais
(Butcher& Ulman,1996),cabra(Huanrnin
~Yong,2000),ovelha(CecconietaI.,1999)
evaca(Figueiredoetal.,1994a,b;Hulshofet
al.,1995;Wandjietal.,1996a;Gutierrezetal.,
2000)demonstraramahabilidadedefolículos
pré-antraisisoladosmecânicaouenzimatica-
menteaodesenvolvimentoin vitro.Embovi-
nos,Figueiredoetalo(1994c)mostraramque
FOPA podemsercultivadoscomsucessona
presençadeFCS, enquantoqueoutrostraba-
lhosmostraramos efeitospositivosdo FSH
(HulshofetaI., 1995;WandjietaI., 1996a),
VIp, ativina(Hulshof, 1995),bFGF, EGF
(Wandjietal.,1996a)nocrescimentoin vitro
defolículospré-antraisconformemostrado
anteriormente.Folículospré-antraisfelinos
tambémjá foramcultivadosin vitro(Jewge-
now& Stolte,1996).Nessaespécie,obser-
vou-sequeEGF e ITS foramresponsáveis
pelapreservaçãodaestruturadefolículospré-
antraiscultivadosinvitro(JewgenoweGõritz,
1995)equeo FSH estimulouo crescimento
de folículospré-antrais(Jewgenowe Pitra,
1993).Emanimaissilvestres,Jewgenowetalo
(1997)compararamodesenvolvimentodefo-
lículospré-antraisoriundosdeováriosdefelí-
deosdomésticos(gata)esilvestres(leoaeti-
gresa).A taxadedesenvolvimentodefolículos
pré-antraisdeleoaapresentou-seequivalente
àobservadaemgata,entretanto,folículospré-
antraisdetigresaapresentarambaixastaxas
deviabilidadeinvitro.Emmarsupiais,Butcher
& unman(1996)mostraramqueoFSH teve
efeitopositivosobreocrescimentoinvitrode
folículospré-antraisdegambássul-america-
nos.Nas espécieshumana(Roy & Treacy,
1993),ovina(Cecconnietal.,1999),caprina
(Huanmin& Yona,2001)e,inclusivebovina
(McCafferyetal.,2000),folículospré-antrais
isoladossedesenvolveraminvitroatéoestádio
antral.Em suínos,HiraoetaI. (1994)obtive-
rama ovulaçãoin vitroa partirde folículos
pré-antraisisoladosquecresceramematura-
ramiIJ vitro.Entretanto,amaioriadostraba-
lhosreferentesaocultivodefolículospré-an-
traisinvitrofoirealizadaemanimaisdelabo-
ratório.Em ratos,relatou-sea produçãoin
vitrodeembriões,a partirdafecundaçãode
oócitosoriundosdefolículospré-antraiscul-
tivadosin vitro(DanieletaI.,1989).Em ca-
mundongos,odesenvolvimentoinvitrodefo-
lículospré-antraisfoidescritoporváriosauto-
res(Qvistetal.,1990;CarrolletaI.,1991a,b;
Nayüdu& Osborn,1992;Cortvrindt& Smitz,
1998).Resultadosespetacularesforamrelata-
dosporEppig& Schroeder(1989),queobti-
veramonascimentodecamundongosapartir
defolículospré-antraisquecresceram,matu-
rarame foramfecundadosin vitro.No ano
seguinte,Carrolletalo(1990)publicaramum
artigoquerepresentouumgrandemarcona
biotécnicadeMOIFOPA. Essesautoresobti-
veramprodutosviáveisapartirdodesenvol-
vimentoinvitrodefolículospré-antraisdeca-
mundongosqueforamsubmetidosprevia-
menteaprocedimentosdecongelaçãoedes-
congelação.A figura11.12mostradeforma
resumidao estadoatualda biotécnicade
MOIFOPA emdiferentesanimais.
ConsideraçõesFinaise Perspectivas
Conformemostradoanteriormente,abio-
técnicadeMOIFOPAapresentouumavanço
significativonosúltimos10anos.Folículos
pré-antraisoriundosdeováriosdesereshu-
manos,animaisdomésticos,silvestrese de
laboratóriopodemserisoladosecultivados
invitroemmeiosespeciaisquetêmpermitido
umaumentodataxadedesenvolvimentofo-
licularin vitro.Alémdisso,a viabilidadede
folículospré-antraisoriundosdeanimaisde
laboratório(camundongo)efelinospôdeser
preservadaapósprocedimentosdecongela-
çãoe descongelação.
Atualmente,a biotécnicade MOIFOPA
vemsendoutilizadasomenteempesquisafun-
damental,nãopodendoserutilizadaainda
paramultiplicaçãodeanimais.Entretanto,o
rápidoavançodaciência,associadoàsfaci-
lidadescrescentesdetrocasdeinformações
entrelaboratóriosdomundointeiro,poderão
resultar,no futuro,no desenvolvimentode
sistemadecultivoquepermitamumexcelen-
tecrescimentofolicularcomapreservaçãoda
viabilidadefolicular.Isso possibilitará,pos-
teriormente,autilizaçãodeoócitosoriundos
danumerosapopulaçãodefolículospré-an-
traisisoladosecrescidosinvitro,emprogra-
mas de fecundaçãoin vitro, clonageme
transferênciade embriões,contribuindoa
longoprazoparaamultiplicaçãodeanimais
dealtovalorzootécnicoemesmoaquelesem
viadeextinção.A curtoprazo,paralelamen-
teaoestudodecrescimentofolicularinvitro,
umaalternativaseriadedesenvolverproce-
dimentosdeisolamentoecongelaçãodefo-
lículospré-antraisin vitrovisando-seàutili-
zaçãofuturaemsistemasdecultivoqueapre-
sentaremcondiçõesótimasparao completo
desenvolvimentofolicularin vitro.Futura-
mente,coma utilização,naprática,dabio-
técnicade MOIFOPA, seráfactívelo res-
tabelecimentode populaçõesde animais
ameaçadosdeextinçãoapartirdepequenos
númerosdefêmeas.
No sentidodefinalizarestecapítulofare-
mosabaixoumaprojeçãodecomoseráare-
produçãoanimalquandoa biotécnicade
MOIFOPA estiverfrancamentedesenvolvida
eintegradaaoutrasbiotécnicasdareprodu-
ção,conformemostradonafigura11.13.No
futuro,animaisdealtovalorzootécnicoou
emperigodeextinção,estejamelesvivosou
mortos (fetos,recém-nascidosou animais
adultos)atuarãocomodoadoresdeovários
paraabiotécnicadeMOIFOPA. A partirde
um único ovário,milharesde FOPA serão
251
.
ovÁRIo
1 .
Isolamentofolicular
.
Fragmentosovarianos
Folículosisolados
EQUILÍBRIO (20°C/20min)
..
20°C(freezerprogramável)
2"C/min~
-7°C(seedinx)
O,3"C/min.
-33°C
.
Curvadecongelação
-196°C(NL2- períodom/Rimo24h)
.
Descongelacão(1minTemperaturaambiente/ banho-maria37°C)
.
.
Fragmentosovarianos
.
Remoçãocrioprotetor(3 lavagensemMEM - 5min)
I
~
Folículosisolados
Isolamentofolicular
+
Folículosisolado$
CULTIVOIN VITRO
Figura 11.12.Protocolode criopreservação de folículospré-antraiscaprinos, in sifue isolados.
252
Animal NacimentoCrescimento Antro Ovulação Embrião
felino
(lewgenowet01.,1997)
Morsupia
(Butcher& Ullmon,1996)
Babuíno
(Fortuneeta/.,1998)
Mulher
(Roye Treacy,1993)
Ovelha
([ecconi,et011999).
Vaca
(Gutie{{ezet01.,2000)
Cabra
(Huanmin& rong,2000)
Porca
(Hiraoetal.,1994)
Rata
(Oonielet 01.,1989)
Camundonga(EppigSchoedeç1989)
Camundonga
([a{{olletaI.,1990)*
Figura11.13. EstadoatualdabiotécnicadeMOIFOPAemdiferentesanimais.* Utilizaçãodefolículospré-antrais
isoladoscongelados/descongelados.
isoladosepoderãosercriopreservados,cons-
tituindobancosdegermoplasmaanimale/
ouseremcultivadosin vitro,permitindoo
crescimentoematuraçãodosoócitosneles
inclusos.Os oócitosmaturospoderãoser
entãofecundadoseosembriõesobtidospo-
derãotertrêsdestinos:a) o cultivoinvitro
atémórulaeblastocistoeposteriortransfe-
rênciaembrionária,sendosubmetidosou
nãoàcriopresevarção,b)seremmodifica-
dospelatécnicadetransgênesenoestádio
pronucleare,posteriormente,submetidosà
transferênciaembrionáriaouainda,c) se-
remmultiplicadospelatécnicadeclonagem
portransferêncianuclear.Destaforma,mi-
lharesdeindivíduospoderiamserprodu-
zidosa partirdeumúnicoovário,contri-
buindo,assim,paraamultiplicaçãodeani-
maisdealtovalorzootécnicoe/ouemperi-
godeextinção(Figura11.14).
253
Animais
-Altovalorzootécnico
-Emviasdeextinção
Mortosouvivos(feto,neonato,adulto)
a .
Ovário
tPerformancereprodutiva
Produçãodemilharesdeanimais
U
Clonagem
TE ~ I Transgênese
MN~FIV ~
Isolamento
a
MilharesdeFOPA
a ~Criopreservação
MIV
D
Culturain vitro»> Maturação
Figura11.14. Integraçãofuturada biotécnicadeMOIFOPAcomoutrasbiotécnicasda reprodução.MIV- maturação
in vi/To;FIV- fecundaçãoin vi/To;TE- transferênciade embriões.
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Capítulo12
Marcadores Moleculares
em'Reprodução An]'mal
JoãoFranciscoCpelhodeOliveira,~",izErnaniHenkes
"
UmPoucode História
Desdea domesticaçãodasprimeirases-
péciesanimais,há cercade 12.000anos
atrás,a seleçãoparadeterminadascaracte-
rísticastemdespertadoo interessedo ho-
mem.A identificaçãodeindivíduosmanifes-
tandofenótiposespecíficos,queos diferen-
ciavamdeseuscontemporâneos,foi prova-
velmenteabasedosprimeiros"programasde
seleçãoanimal"desenvolvidospelohomem
primitivo.Até hoje,a essênciadosprogra-
masde seleçãoanimaltemsido a mesma:
observarpopulações,identificarindivíduos
demaior,ou melhorexpressãodecaracte-
rísticasimportantes,acasalamentode indi-
víduosexcelentesedisseminaçãodessesge-
nótiposnos rebanhos.Tomandopor exem-
plo a espéciebovina,nosúltimos500anos
foramdesenvolvidasraçastaurinas(Bostau-
rustaurus)comgrandecapacidadedetra-
balhooualtamenteprodutorasdeleiteoude
carne.Do mesmomodo,emperíodosmais
recentesforamdesenvolvidaseaprimoradas
váriasraçasbovinas.Inicialmente,fenótipos
comocoloraçãodapelagem,ganhodepeso,
produçãode leite,tamanhodoschifresfo-
ramconsideradosparaa seleção.Posterior-
mente,foramincorporadasobservaçõesmais
sofisticadascomopesoemdiferentesidades
eaoabate,característicasdacarcaça,quali-
dadedo leite(teorprotéicoedegordura)e
circunferênciaescrotal.Diferentesraçasde
eqüinostambémforamdesenvolvidascom
basenessesprincípios,levandoemcontao pa-
drãodecoloraçãodapelagem,musculatura
eaptidãoparacorridas,sendoexemplostípi-
cosasraçasApaloosa,QuartodeMilhaePu-
ro-sangueInglês,respectivamente.Demanei-
ra geral,a maioriaabsolutadasespéciesdo-
mésticaspassouporalgumprocessodesele-
çãoapartirdesuadomesticaçãopelohomem,
principalmentecomousodeduasferramen-
tassubjetivas:observaçãoeintuição.
Comodesenvolvimentodemétodoscien-
tíficosdeanotação,processamentoeanálise,
foi possívelracionalizaros sistemasdesele-
çãoparao melhoramentodasespéciesera-
ças.Nessemomento,surgiramdiversosmo-
delosparaa seleçãoanimal,quesebaseiam
naobservaçãoenaanotaçãodediferentespa-
râmetroszootécnicos.Aanálisedessespa-
râmetroszootécnicossobmodelosmatemá-
ticos,permiteaclassificaçãoserialdosindiví-
duosdeumapopulação,conseqüentemente
fornecendosubsídiosparaaseleçãomal\>o\))e-
tivadosmelhoresanimais.Atravésdaanálise
261
dosparâmetrosdosascendentesedescenden-
tes,.essesmodelospermitempredizero de-
sempenhodeumfuturoreprodutor(a),quan-
docomparado(a)aseuscontemporâneos.
Subseqüentementeao desenvolvimento
de sistemasmatemáticosdeanálise,foram
desenvolvidastecnologiasdeacessoaoutros
níveisde variaçãobiológica.Inicialmente,
técnicasimunogenéticaspermitiramadeter-
minaçãodosdiferentessistemasdegrupos
sangüíneose,posteriormente,comadesco-
bertadaeletroforese,foipossívelacaracte-
rizaçãodospolimorfismosdeproteínas.Isso
deuacessoà caracterizaçãodeumavaliosa
gamadevariaçõesgenéticasemnívelmole-
cular.Essessistemaspassaramaserempre-
gadosnatentativadecorrelacionarsuasva-
riações(polimorfismos)comcaracterísticas
zootécnicasdeinteresseeconômico.
A publicaçãodeinúmerostrabalhoscientí-
ficosnessaárea,nasdécadasde60a80,ge-
rouumaassociaçãodecientistasqueresultou
nafundaçãodaEuropeanSocietyforAnimal
BloodGroupResearch(ESABGR), quepas-
soua editara revistalmmunogeneticLetter
(1964),posteriormenteAnimalBloodGroups
andBiochemicalGenetics(1970).Em 1972,
aESABGRpassouadenominar-selntematio-
nalSocietyforAnimalBloodGroupResearch
(ISABGR)e,fmalmenteem1988,lntematio-
nalSocietyofAnimalGenetics(ISAG), que
atualmentepublicaarevistaAnimalGenetics.
A partirdadécadade80, o desenvolvi-
mentoepopularizaçãodastécnicasdebio-
logiamolecularpermitiramaanálisedosáci-
dosdesoxirribonucléicos(DNA) e ribonu-
cléicos(RNA) emtodaasuaextensão.Con-
seqüentemente,o empregode marcadores
genético-bioquímicosperdeupartedesuare-
levânciaeaidentificaçãoeutilizaçãodemar-
cadoresmolecularesdeDNA, transformou-
senoprincipalobjetodeestudodacomuni-
dadecientíficaenvolvidacom essaárea.
Atualmente,empregam-sediferentestécni-
262
casdebiologiamolecularnapesquisadege-
nesresponsáveispelaexpressãodecaracte-
rísticaszootécnicas,ouderegiõesdogeno-
maqueestejamrelacionadascomamanifes-
taçãodestascaracterísticas.As estratégiasde
identificaçãoe caracterizaçãodemarcado-
resmolecularespodemserdivididasemduas
abordagens:
1.Mapeamentogenético(do inglêsgene
mapping)quevisaidentificar,comoem-
pregodemarcadoresmoleculares(geral-
mentedotipomicrossatélite),locusrela-
cionadosàscaracterísticasdeinteresse.
2. Metodologiadogenecandidato(doin-
glêsmajorgeneapproach) queobjetiva
identificaros genesresponsáveispor
etapasfisiológicascruciaisenvolvidas
namanifestaçãodecaracterísticasim-
portantestaiscomo,produçãodeleite,
desenvolvimentocorporal,etc.
~
Organização do DNA no Genoma
dos Eucariotes
O DNA éumamacromoléculaftlamentar
muitolonga,constituídaporumgrandenú-
merodedesoxirribonucleotídeos,cada um
compostodeumabase,umaoseeumfosfato.
As basesdasmoléculasdeDNA sãorespon-
sáveispelainformaçãogenética,enquanto
seusgrupamentososeefosfatotemumpapel
estrutural.Em 1953,JamesWatson,Francis
CrickeMauriceH. F.Wilkins,coma inesti-
mávelcolaboraçãodeRosalindFranklindedu-
zirama estruturatridimensionaldo DNA e
logoaseguiro seumecanismodereplicação
(Watson& Crick,1953).Essabrilhantedes-
cobertalevouà compreensãodo funciona-
mentodosgenesemtermosmoleculares.
A estruturatridimensionaldamoléculade
DNA éconstituídapor duascadeiaspolinu-
cleotídicashelicoidaisenroladasemtornode
umeixocomum.Ascadeiascorrememsenti-
do opostoe sãomantidasjuntaspor pontes
dehidrogênioentreosparesdebases.As bases