Apoptose (Rodrigo Dallacqua - Alfenas - 2013)

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Morte celular programada: 
Apoptose, autofagia e necrose 
Dr. Rodrigo Pires Dallacqua 
Um dos tópicos mais estudados na Biologia moderna 
 
Prêmio Nobel em Fisiologia – 2002 – mecanismos genéticos da MCP 
Juntamente com sinalização celular, controle do ciclo 
celular, proliferação celular, faz parte dos mecanismos 
envolvidos no desenvolvimento do câncer: uma das 
patologias que mais preocupam no contexto científico e 
social nos dias atuais 
HISTORICO DAS PESQUISAS COM MORTE 
CELULAR E/OU APOPTOSE 
1800s Numerosas observações de morte celular 
1908 Mechnikov ganha o prêmio Nobel (fagocitose) 
1930-40 Estudos sobre metamorfose 
1948-49 Morte celular nos membros de aves e exploração de NGF 
1955 Início dos estudos com lisossomos 
1964-66 Necrose e Morte celular programada descritas 
1971 Origem do termo apoptose 
1977 Identificação dos primeiros genes de morte celular (C. 
elegans) 
1980-82 Observação de DNA ladder & identificação de ced-3 
1989-91 Mais genes de apoptose identificados, incluindo 
 bcl-2, fas/apo1 & p53, ced-3 sequenced 
 
 (Richerd et.al., 2001) 
http://web.mit.edu/horvitz/www/horvitzlab.html 
Premio Nobel de Fisiologia em 2002 
“Este nemátode possui menos de 1000 células somáticas 
e padrões fixos de divisão, migração e morte celular, 
gerando indivíduos de anatomia simples” 
Vantagens do estudo da morte celular em C. elegans 
 De um total de 1090 células somáticas, sofrem apoptose 131, sobrando 959 
células que formarão o corpo do adulto 
C
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O
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... Crescimento do Embrião e Desenvolvimento 
... Estabelecimento e Manutenção da Homoestase Tecidual 
... Controle de Populações de Céls. do Sistema Imune 
... Infecções Virais Crônicas 
... Doenças Neuro Degenerativas 
... Diabetes Insulina-dependente 
... Aterosclerose 
... Infarto do Miocardio 
... AIDS 
... Etc... 
Ocorrência de Morte Celular 
1-Elimina células danificadas/prejudiciais 
2-Fisiologicamente ocorre: 
 na renovação de células epiteliais e hematopoéticas 
 Mantém número constante de células nos tecidos adultos: 
Ex.: 5x10 células do sangue → eliminadas por morte celular 
programada (dia/adultos) 
# colapso endometrial durante a menstruação 
# deleção de células nas criptas intestinais 
# na regressão de tumores 
3-Papel importante no desenvolvimento embrionário: 
 -eliminação do tecido larval durante metamorfose (anfíbios e 
insetos) 
 -regressão da cauda do girino 
 -eliminação de tecidos entre os dedos (membrana interdigital) 
 -eliminação de neurônios em excesso 
4- Mecanismo de defesa: 
 -células infectadas por vírus 
 -células com danos no DNA 
 -células cancerosas 
No controle das populações celulares 
 
Neurônios (fatores de sobrevivência ) 
 
Funções e contexto biológico da MCP 
Morte 
celular 
ajusta o 
número de 
células 
nervosas 
Células 
nervosas 
Células 
nervosas 
apoptóticas 
Fatores de 
sobrevivência 
liberados pelas 
células-alvo 
células-alvo 
Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Na eliminação de estruturas (tecidos inteiros) 
 
Eliminação da cauda de girinos (anfíbios) 
Substituição de tecidos e órgãos de insetos 
 conservação evolutiva (similaridade de seqüência) dos genes 
que codificam as proteínas envolvidas nos processos de MCP 
 esta conclusão se baseia no estudo de organismos genéticos 
(modelo) Drosophila (inseto), C. elegans (verme), Zebrafish 
(peixe), G. gallus (ave), M. muscullus (camundongo) em 
comparação com os genes conhecidos em humanos. 
Conservação evolutiva da MCP 
Perspectiva: Conhecimento dos componentes e 
regulação do processo de morte celular pode ser 
usado em prol da cura de doenças – Através de 
Terapia Gênica ou outro tipo de terapia direcionada 
a um alvo molecular específico 
 Conservação evolutiva Aplicabilidade terapêutica 
-vacúolos citoplasmáticos 
-encolhimento e diminuição 
do contato célula-célula 
Fragmentação da 
membrana nuclear 
-condensação cromatínica 
-Despolarização da 
membrana mitocondrial 
-fragmentação 
internucleossomal do DNA 
-desintegração nuclear e 
corpos apoptóticos 
-fagocitose pelos 
macrófagos 
Ocorrência unicelular 
Estímulo fisiológico 
Sem reversibilidade 
Atinge células individualmente; 
 
A célula se “murcha” e o citoplasma fica denso; 
 
A cromatina se torna condensada e disposta em 
grumos colados à carioteca; 
O núcleo se fragmenta 
 
A membrana citoplasmática 
emite projeções e forma 
brotamentos que contêm 
fragmentos do núcleo; 
Fragmentação das células em múltiplos 
brotos (corpos apoptóticos). 
PROCESSO HISTOLÓGICO DA 
APOPTOSE 
Passos histológicos 
distintos: 
 duração de 2-3 horas 
 processo não sincrônico 
 mudanças bioquímicas e 
morfológicas 
 
Fragmentação do DNA 
internucleossomal produz 
padrão de escada no gel de 
eletroforese. 
http://www.sgul.ac.uk/depts/immunology/~dash/apoptosis/intro.html 
TROFOBLASTO – ETAPAS DAS MUDANÇAS 
MORFOLÓGICAS 
A- Condensação do citoplasma 
→ clivagem da lâmina e 
filamentos de actina 
 
B- Condensação nuclear → 
quebra da cromatina e proteínas 
estruturais nucleares 
 
C-D- Fragmentação da célula → 
corpos apoptóticos → 
translocação de fosfatidilserina 
superfície celular → 
degradação macrófagos 
APOPTOSE E CICLO CELULAR 
 Células em apoptose  maioria dos casos na fase Go (sem proliferação) 
 
 Estímulo apoptótico 
 
 Fase morfológica de pré-condensação: 
 acúmulo de produtos gênicos 
 necessários para a apoptose 
 
 Passo irreversível  ativação de endonucleases 
 (tempo de duração da apoptose: 2-3 horas) 
 
 
CÉLULA 
 Go 
FASE A1 DE 
APOPTOSE 
FASE A2 DE 
APOPTOSE 
www.sghms.ac.uk/.../ ~dash/apoptosis/mito.html 
APOPTOSE – EFEITO 
NUCLEAR 
Clivagem do DNA nas 
unidades nucleossomais: 
-PARP (reparo DNA) → 
clivada pela caspase 3 
-Laminas → degradaçãp pela 
caspase 6 → condensação da 
cromatina e fragmentação 
nuclear 
-Fragmentação do DNA: 
Realizada pela enzima CAD 
(DNase ativada por caspase) 
 
Complexo inativo CAD+ICAD 
 
ICAD clivado → Caspase 3 
 
CAD → fragmentação DNA 
Toxicol Pathol 2007 35: 495 
Coloração H&E: 
Pâncreas de 
camundongo: setas 
células apoptóticas: 
citoplasma condensado e 
núcleos picnóticos 
Coloração H&E: 
miocárdio de rato: 
setas indicam células 
apoptóticas: núcleo 
fragmentado 
Maquinaria da Apoptose 
Procaspase 
Ativação de 
procaspase por 
clivagem 
Caspase 
ativa 
Procaspase
s inativas 
Pró-
domínios 
clivagem 
Caspas
e ativa 
Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Cascata de 
caspase Uma molécula de 
caspase iniciadora 
ativada 
Muitas moléculas de caspases executoras 
Clivagem de 
proteína citosólica 
Clivagem de 
lâmina nuclear Componentes do citoesqueleto; proteínas de adesão 
Caspases 
Estão presentes no citosol sob a forma de pró-enzimas 
inativas, tornando-se ativas após clivagem proteolítica. 
Quando ativas clivam proteínas chaves: 
 
 - Proteínas que inativam a DNAse 
 - Na manutenção da integridade da estrutura celular. 
 
Reação de amplificação- cascata 
Qual é o sinal para que a primeira 
procaspase seja ativada?? 
2 vias de sinalização: 
-Via extrínseca (ativação de receptores de 
superfície por um sinal de morte extracelular) 
-Via intrínseca (o sinal de morte vem de dentro 
da própria célula) 
Ativação de caspases 
efetoras 
Via extrínseca: receptor de morte Fas 
Linfócitos matadores promovem a via 
extrínseca 
Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Via intrínseca da apoptose 
Depende da liberação de proteínas mitocondriais: citocromo C 
Liga-se à Apaf-1 (proteína adaptadora de ativação da procaspase) 
Oligomerização de Apaf-1 
em um heptâmero chamado 
apoptossomo 
Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Proteínas Apaf-1 recrutam 
procaspases iniciadoras 
(procaspases-9) . Essas 
então ativam procaspases 
executoras para induzir 
apoptose 
Recrutamento e 
ativação de 
caspase 9 
Caspase-9 cliva e então 
ativa procaspases 
executoras 
Cascata de caspase 
que conduz à 
apoptose 
Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
COOPER, G.; HAUSMAN, R. The Cell: A Molecular Approach 
Mitocôndria – alteração da 
permeabilidade da membrana 
 Liberação de Citocromo c 
Ativação de caspases. 
Proteínas reguladoras 
intracelulares 
 Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, Bcl-1 e 
A1 -proteínas anti-apoptóticas 
 Bax, Bad, Bid 
proteínas pró-apoptóticas 
 IAP- Liga às caspases inibe a 
atividade ou ativação. 
 
Proteínas que controlam o sinal apoptótico e estabelecem 
conexão ao programa de execução 
Bcl2 
Gene p53 – crítico - envolvido no controle da apoptose. 
Governa a resposta celular a danos ao DNA. 
Defeito- células deixam de morrer e proliferam acumulando danos 
genéticos que podem gerar o câncer 
Integração de sinais e a homeostase celular 
 Sinais extracelulares regulam os sinais intracelulares apoptóticos 
(ativa ou inibi). 
 Ação – regulam os níveis ou atividades dos membros das famílias 
Bcl2 e IAP. 
 
 
Se há danos no DNA, há interrupção do ciclo antes de avançar para fase S 
O sinal de parada em G1 é dado pela p53 (níveis intracelulares aumentam) 
Integridade Celular: o poro de transição de 
permeabilidade mitocondrial se mantém 
habitualmente fechado. 
APOPTOSE 
Depleção de ATP 
NECROSE 
 expressão p53 
Expressão de Bax 
Abertura do poro 
mitocondrial 
Lesão do DNA Ativação das caspases 
(liberação do citocromo c) 
Abertura do poro de algumas 
mitocôndrias 
Fatores de sobrevivência podem inibir a apoptose 
Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 
Alguns fatores estimulam a 
transcrição de genes que 
codificam Bcl2 
Produção aumentada de Bcl2 
antiapoptótica 
Apoptose bloqueada 
1- AIDS  destruição apoptótica dos linfócitos T/CD4  indução da 
permeabilização da membrana mitocondrial 
2- Doenças neurodegenerativas: Alzheimer e Parkinson  apoptose 
precoce dos neurônios  demência progressiva, perda cognitiva e 
memória 
3- Infarto do miocárdio por isquemia  necrose das células que 
dependem dos vasos afetados e apoptose das células vizinhas pela 
geração de ROS 
4- Doenças hepáticas induzidas por toxinas e alcoolismo 
5- Osteoporose  perda da massa óssea 
Doenças Associadas com Aumento da 
Apoptose 
NECROSE: 
 
-processo patológico (autólise das células): resultado 
de uma lesão maciça no tecido  caracterizada por: 
-inchaço citoplásmatico e mitocondrial, 
- ruptura da membrana celular e vazamento do plasma 
celular 
-resposta inflamatória e reação de tecido patológico 
grande número de células afetadas simultaneamente 
CARACTERÍSTICAS NECROSE APOPTOSE 
Estímulo Patológico Fisiológico ou 
Patológico 
Ocorrência Grupo de Células Células Individuais 
Reversibilidade Irreversível Irreversível 
Ativação de Endonucleases Não Sim 
Liberação de Enzimas 
Lisossomais 
Sim Não 
Inflamação Exudativa Presente Ausente 
Alterações Nucleares Presente Presente (Cariorrexe) 
Morfologia Tumefação e Lise 
Celular 
 Corpos Apoptóticos 
NECROSE E APOPTOSE 
Glândulas 
salivares 
 
Intestino 
larval 
 
Picos de 
ecdisona 
0h 2h 4h 6h 8h 10h 12h 
 
Terceiro 
ínstar 
larval 
 
 Pré-pupa 
 
Pupa 
 
Estágio de 
Desenvolvimento 
 
Horas após a 
Formação do pupário 
Formação do pupário 
 
Eversão da 
Cabeça 
 
Morte Celular Programada por AUTOFAGIA 
Figura modificada de Thummel, 2001 
Habilidade que a célula tem em digerir seus próprios componentes 
Mecanismos da AUTOFAGIA 
Ryan, 2012 
Célula engloba seus 
componentes em 
membranas 
Se funde com 
lisossomos 
autofagossomo 
lisossomo 
autolisossomo 
AUTOFAGIA 
Modelo glândula salivar de Drosophila 
Martin, D.N & Baehrecke, E.H.,2004 - Development 
 * vacúolos 
 núcleo