Gen Mol FASE 2016 Copy

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HISTORICO
1600
1800
Células,
organelas
1900
Genes e enzimas
Beadle e Tatum, 
1940
DNA:depositário 
Avery, 1944 
Dupla Hélice
Watson e Crick, 1953 
Descoberta do
microscópio
Fundação da genética (Mendel, 1866)
 e da evolução (Darwin, 1859)
Nucleína (Miecher, 1869)
Cromatina (Flemming,1879)
Divisão Celular 
Sutton e Boveri, 
1902
Fatores e fermentos 
Garrod e Bateson, 
1909 
Princípio transformante
 Griffiths, 1928 
1950
Biologia Molecular (Genética Molecular)
Se relaciona com o estudo da estrutura e função do DNA, dos genes, bem como da organização e funcionamento do genoma.
Cepa Lisa (L)
Camundongo morre
Camundongo sobrevive
Cepa rugosa (L)
Camundongo sobrevive
Cepa Lisa (L)
inativada pelo
calor
Cepa Lisa (L)
inativada pelo
calor
Cepa rugosa (L) viva
+
Camundongo morre
O princípio transformante: Griffiths, F. 1928
Avery – MacLeod – McCarty - 1944
Cepa Lisa (L)
inativada pelo
calor
Cepa rugosa (L) viva
Camundongo morre
O princípio transformante: Avery O. 1944
O DNA é o depositário da informação genética
proteínas
RNA
polissacarídeos
lipídeos
DNA
Camundongo sobrevive
Cepa rugosa (L) viva
1952- Experimento de Hershey-chase
Experimentos que levaram ao modelo da dupla hélice
Alexander Todd descreve que o DNA é um polinucleotídeo 
REGRAS DE CHARGAFF
Primeira regra (~1950)
Verificou que a quantidade de G era igual à de C; e a quantidade de A, igual à de T. 
Erwin Chargaff
1905–2002
Segunda regra (~1950)
A composição de bases do DNA varia de espécie para espécie com relação à porcentagem de A, C, G e T
Esta diversidade molecular (antes desconhecida) fazia com que o DNA fosse um candidato mais plausível para carregar a informação genética (do que as proteínas)
Rosalind Franklin faz experimentos de difração de Raios-X que são “mostrados” a Watson 
Esses experimentos sugerem uma estrutura helicóide, com duas fitas e um diâmetro com pirimidinas e purinas pareando
Experimentos que levaram ao modelo da dupla hélice
Experimentos que levaram ao modelo da dupla hélice
Erwin Chargaff se encontra com Watson e Crick e relata seus achados: as quantidades relativas de A e T são iguais e C e G também. 
Dogma Central da Biologia Molecular
DNA – guardião da informação genética
RNAs e proteínas celulares
Síntese dos constituintes celulares
Proposto por Francis Crick em 1957
Evolução do conhecimento em biologia
 molecular desde a dupla-hélice
1950
1960
Hibridização
por Sothern,1975
Genômica,
1991
Dupla-hélice, 1953
Transcrição 1957
Replicação, 1958
 DNA polimerase, 1961
Código
genético, 1961
Regulação da 
expressão gênica,1961
DNA
recombinante,
1973
Sequencimento 
de DNA, 1975
Primeiro gene
 humano,1977
Insulina 
recombinante,1982 
Transgênicos,
1980 
Bancos de 
armazenamento
 de dados 1971
PCR,1985
Enzimas de restrição,1971
Retrotranscrição, 1970 
1970
1980
1990
Eletroforese em gel é uma técnica de separação de moléculas que envolve a migração de partículas em um determinado gel durante a aplicação de uma diferença de potencial. 
As moléculas são separadas de acordo com o tamanho, pois as menores irão migrar mais rapidamente que as de maiores.
A eletroforese normalmente é utilizada para separar proteínas e moléculas de DNA e RNA.
Visualização
Visualização
Cortar o DNA
Enzimas de restrição: tesouras moleculares
Enzimas de Restrição: Clivam a fita dupla de DNA em sequências específicas de de nucleotídios, o sítio de restrição da enzima. 
Atualmente se conhecem mais de1.200
BamHI - Bacillus amyloliquefaciens H 	5’ G/GATCC 3’ 
EcoRI - Escherichia coli R 			5’ G/AATTC 3’ 
HaeIII - Haemophilus aegyptius 		5’ GG/CC 3’ 
PstI - Providencia stuartii 			5’ CTGCA/G 3’ 
Plasmídios: Pequenas moléculas de DNA circular que se replicam independentemente do DNA cromossômico 
Presentes em bactérias.
São utilizados para gerar batérias transgênicas.
DNA Estranho
Fragmentos do
DNA estranho “insert”
Plasmídio aberto, 
Gene resistente à Ampicillina
Plasmídio circular,
com
“Insert”
Mistura com aenzima Ligase
L
I
G
A
T
I
O
N
Criação de moléculas recombinantes
Isolar o DNA
- digerir com enzimas de restrição
- digerir os plasmídeos com a mesma enzima
- ligar as fitas de DNA e plasmidiais
Introduzir os plasmídeos recombinantes nas 
 bactérias
CLONAGEM DA INSULINA
Insulina recombinante 
-Gene responsável pela produção de insulina dos seres humanos inseridos em bactérias (plasmídios)
 -Bactérias produzem insulina humana recombinante
-produção praticamente ilimitada e com custos muito baixos.
Transgenia: permite isolar um gene de interesse de uma espécie e inseri-lo no material genético de outra. 
Espécie Transgênica: recebeu um gene exógeno, que ele não possuia e, assim, passará a produzir a proteína codificada por ele.
Transgênicos
Primeiro mamífero
transgênico: hormônio
do crescimento
Transgênico que reverteu
o sexo
Tabaco com gene
luminescente de bactéria
Clonagem : produção de cópias idênticas. 
 Clonagem Gênica: trechos do DNA são inseridos em plasmídios para produzir inúmeras cópias da molécula. 
Clonagem de organismos por transferência nuclear: o núcleo de um indivíduo é extraído de uma célula somática e inserido em um óvulo sem material genético nuclear. 
Por meio de inseminação artificial, essa célula poderá se desenvolver em um indivíduo da mesma espécie.
PCR
Reação em Cadeia da Polimerase
Quem inventou a PCR
Kary Mullis, geneticista Nobel em Química (1993) pelo desenvolvimento de um método que permite sintetizar, em poucas horas e in vitro, uma grande quantidade de um determinado fragmento de DNA
Seus estudos em 1985 permitiram amplificar o DNA
Mullis, K. and Faloona, F. (1987). Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol 155: 335-35
PCR
Polymerase Chain Reaction (reação em cadeia da polimerase)
Reação enzimática de polimerização de DNA in vitro
Amplificação de sequências específicas de DNA, permitindo sua visualização e/ou análise posterior
É um processo termodinâmico e enzimático
Reação para amplificação de segmento específico de DNA
Etapas da PCR
1. Desnaturação
2. Anelamento
3. Extensão
A técnica de PCR tem por objetivo amplificar uma sequência alvo específica por meio de uma enzima termoestável, in vitro. 
Neste método utiliza-se além desta enzima, os quatro nucleotídeos e um par de primers (iniciadores) que delimitam a região a ser amplificada. 
Estes primers são utilizados para direcionar a síntese do DNA, e delimitam a sequência que será amplificada.
Em cada ciclo, as fitas servem de molde para a geração de novas fitas.
Cada ciclo se inicia com a desnaturação da dupla-hélice do DNA, elevado a altas temperaturas (91-95o C). 
Esta etapa é seguida da dos primers ao DNA molde, a temperaturas que variam de 53-65oC.
Posteriormente ocorre a elongação de cadeia por ação da polimerase, em geral entre temperaturas de 65-72oC. 
O número de ciclos varia de acordo com o objetivo e condições utilizadas.
1. Desnaturação - 94ºC – 96ºC
 Separa a dupla fita do template em duas fitas simples 
2. Pareamento - 37ºC – 65ºC 
Primers ligam-se em locais específicos do DNA molde 
3. Extensão - 72ºC 
DNA polimerase usa os dNTPs adicionando-os a nova fita de acordo com a regra de pareamento – polimerização. 
Principio da PCR
Amplificação Exponencial
Termocicladores
Aplicações da PCR
Diagnósticos moleculares
Identificação e isolamento de genes
Marcadores moleculares
Expressão gênica
Diagnóstico molecular – gripe aviária
Meningite e penuemonia bacteriana
 HIV
Identificação humana: teste de paternidade por DNA
Hibridização por Southern
+ + + + + + + + + +
Pólo negativo
- - - - - - - - - - - - - -
Poços
 
1. Separação do DNA fragmentado
por 
eletroforese em gel
 
2. Transferência do DNA fragmentado
 para um suporte sólido
(filtro de
Nitrocelulose)
3. 
Hibridização 
com a sonda marcada
4. Lavagem do filtro para manter
apenas a sonda 
 hibridizada com
o fragmento de DNA
especifico 
 5. Exposição 
 
 a um filme de Raios-X 
Teste de Paternidade 
Paternidade 
Inclusão 
Exclusão
DNA na sociedade
DNA
Trangênicos
Drogas
recombinantes: 
insulina, vacina HBV
Medicamentos
inteligentes
(dosagens pessoais)
Diagnóstico de
doenças 
Teste de Paternidade
Projeto genoma: santo Graal
Árvore da vida
Código da vida
Manual de informações
Livro de receitas