INSETICIDA BIOLÓGICO

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INSETICIDAS BIOLÓGICOS
Catiane Alves da Cunha
Isabela Afonso Ferreira Boson
Márcia Conceição da Costa
Sorocaba
2016
Inseticidas Biológicos 
Trabalho de Biotecnologia Farmacêutica
 e Biologia Molecular apresentado 
à Universidade de Sorocaba como exigência 
parcial para o curso de Farmácia.
 Prof. Dr. Vitor Manuel Cardoso Figueiredo Balcão 
Catiane Alves da cunha
Isabela Afonso Ferreira Boson
Márcia Conceição da Costa
Sorocaba
2016
SUMÁRIO
	
	Resumo.................................................................................................................................. 4
	Introdução............................................................................................................................. 6
	Pesticidas bioquímicos........................................................................................................... 9
3.1 Definição.......................................................................................................................... 9
3.2 Processo de desenvolvimento........................................................................................ 10
	Pesticidas microbianos..........................................................................................................11
4.1 Definição......................................................................................................................... 11
4.2 Processo de desenvolvimento........................................................................................ 13
	Pesticidas botânicos incorporados........................................................................................14
5.1 Definição......................................................................................................................... 14
5.2 Processo de desenvolvimento.........................................................................................16
	Descrição detalhada de um dos processos de produção......................................................16
	Referências............................................................................................................................18
RESUMO
Os biopesticidas surgiram como uma alternativa viável aos pesticidas químicos, que podem ter repercussões extremamente nefastas para o ambiente, nomeadamente devido à contaminação dos lençóis freáticos e solo podendo afetar a saúde pública. 
Estima-se que 2,5 milhões de toneladas de ingredientes pesticidas sejam aplicados anualmente em todo o mundo. O Brasil é o maior usuário desses produtos, com um mercado de quase US$ 10 bilhões, sendo US$ 2 bilhões referentes apenas ao controle da ferrugem da soja.
No Brasil, os biopesticidas representam de 1 a 2% do total de produtos utilizados para combater as pragas e doenças nas lavouras, atingindo aproximadamente de 97 a 194 milhões de dólares nas suas comercializações. A tendência, é que até 2020 os biopesticidas alcancem 10% do mercado nacional de defensivos agrícolas. Mundialmente as expectativas são de que em 2022 os biopesticidas alcancem a marca de US$ 6,1 bilhões nas comercializações, atingindo 20% deste mercado.
Seguindo a demanda mundial para a diminuição de utilização dos agrotóxicos e seus impactos negativos na alimentação, o Brasil começa a dar mais abertura ao mercado dos biopesticidas, o número destes agentes de controle registrados cresce em favor dos investimentos de empresas privadas e pela abertura dada pelo governo, o que permitiu o aumento dos produtos registrados dentro dos últimos 4 anos, que de 26 em 2011 passaram a 50 produtos registrado em 2013, além disso diversos novos biopesticidas estão em análise para registro no momento.
Com o rápido desenvolvimento dos biopesticidas tem-se vindo a desenvolver três principais grupos: biopesticidas microbianos; proteínas incorporadas nas plantas (PIPs); biopesticidas bioquímicos. 
Atualmente o mercado dos biopesticidas é dominado pelos biopesticidas microbianos, e mais particularmente pelas subespécies da bactéria Bacillus thuringiensis (Bt). Existem mais de 40 produtos baseados na Bt disponíveis globalmente representando cerca de 1% de todos os inseticidas vendidos. 
Palavras-chave: Biopesticidas, bioinseticidas, inseticida biológico, bio-herbicidas, biofungicidas, Bacillus thuringiensis, pesticidas, pragas.
ABSTRACT
Biopesticides emerged as a viable alternative to chemical pesticides, which can have extremely harmful effects on the environment, particularly due to contamination of groundwater and soil can affect public health.
It is estimated that 2.5 million tons of pesticide ingredients are applied annually around the world. Brazil is the largest user of these products, with a market of nearly $ 10 billion, $ 2 billion related only to soybean rust control.
In Brazil, biopesticides represent 1-2% of all products used to control pests and diseases in crops, reaching approximately 97 million to 194 million dollars in their trades. The trend is that by 2020 biopesticides reach 10% of the domestic market of pesticides. Worldwide expectations are that in 2022 the biopesticides reach the $ 6.1 billion mark in trades, reaching 20% ​​of this market.
Following the global demand for the reduction of use of pesticides and its negative impacts on food, Brazil is beginning to give more market opening of biopesticides, the number of those registered control agents growing in favor of private business investment and the opening given by government, which allowed the increase registered products within the last 4 years, which in 2011 began 26 to 50 products registered in 2013, in addition several new biopesticides are under consideration for the time record.
With the rapid development of biopesticides has developed three main groups: microbial biopesticides; proteins incorporated into plants (PIPs); biochemical biopesticides.
Currently the market is dominated by microbial biopesticides biopesticides, and more particularly of the subspecies of Bacillus thuringiensis (Bt). There are more than 40 products based on Bt available globally representing approximately 1% of all insecticides sold.
Keywords: Biopesticides, biological insecticide, bio-herbicides, biofungicides, Bacillus thuringiensis, pesticides, pests.
2. INTRODUÇÃO 
	Pesticida é o nome genérico dado às substâncias que visam matar, controlar e/ou inibir organismos indesejados que possam por em causa uma dada cultura, podendo ser agrupados em herbicidas, fungicidas, inseticidas, de acordo com o grupo de organismos alvo, respectivamente ervas/plantas, fungos e insetos. Com efeito, sem que no quotidiano se tome consciência da inferência assustadora, a verdade é que para além da indústria de armamento apenas a indústria agroquímica de produção de pesticidas tem como um dos seus objetivos produzir materiais ou substâncias mortíferas. 
A maioria dos pesticidas contém substâncias ativas que interferem na respiração, alimentação, crescimento e reprodução das pragas, de uma forma muito generalizada, ou seja, frequentemente atuam segundo características patentes na base destes processos biológicos, o que implica afetarem um amplo leque de organismos alvo. Isto significa que, para além de um dado pesticida eliminar uma determinada espécie de praga, elimina também outros seres vivos morfologicamente idênticos à praga. 
Um fungicida, por exemplo, não mata apenas o fungo que ataca as folhas de uma planta, mas também outro tipo de fungos que podem ser altamente benéficos e importantes para o desenvolvimento normal das plantas. Os pesticidas estão também associados à reinsurgências de pragas e ao desenvolvimento de resistências nas pragas. Como a maioria dos pesticidas não são muito seletivo, frequentemente a aplicação de um pesticida não elimina apenas a praga, mas também os seus inimigos naturais (predadores, parasitas). 
As pragas podem reproduzir-se mais rapidamente e são mais abundantes que os seus inimigos naturais e assim, podem reaparecer com maior intensidade após a aplicação depesticidas, obrigando a um uso cada vez mais frequente e em doses mais elevadas deste produto. No entanto, existem diversos mecanismos através dos quais as pragas podem desenvolver resistências aos pesticidas. Note-se que mesmo em condições de produção agrícola muito controlada, resíduos de pesticidas podem permanecer no meio, sendo lixiviados contaminando lençóis freáticos, pondo assim em risco a saúde humana. 
Num plano mais objetivo, podemos ainda acrescentar que a Organização Mundial da Saúde (OMS) calculou recentemente que todos os anos aproximadamente 25 milhões de trabalhadores agrícolas sofrem intoxicações devido a pesticidas, dos 2 quais 20.000 casos são mortais. 
Sendo assim, surge a necessidade de uma forma de pesticidas que consiga minimizar os problemas associados à resistência das pragas, reduzida especificidade de combate, bem como a poluição e contaminação do meio em que é utilizado. 
Os inseticidas têm sido bastante usados, tanto na agricultura e agropecuária quanto na área da Saúde Pública. Seu uso continuado tem provocado o aparecimento de populações resistentes e ocasionado problemas para o controle de vetores. Resistência tem sido detectada para todas as classes de inseticidas, afetando, direta e profundamente, a reemergência das doenças transmitidas por vetores,pois, apesar dos importantes avanços alcançados no desenvolvimento de métodos alternativos, os inseticidas químicos continuam sendo uma importante ferramenta dos programas integrados de controle. Nesse contexto, o monitoramento e o manejo da resistência, assim como o uso de substâncias com modos de ação diferentes dos inseticidas químicos convencionais, são elementos de suma importância em qualquer programa de controle de vetores. Os biopesticidas não são nocivos ao Homem e ao meio ambiente. 
A resistência é definida pela OMS como a habilidade de uma população de insetos tolerar uma dose de inseticida que, em condições normais, causaria sua morte. A resistência – dita fisiológica – é uma característica genética, como, por exemplo, a cor dos olhos. Desse modo, populações de insetos, ácaros e outros artrópodes podem, naturalmente, apresentar uma proporção de indivíduos que tenham alelos que lhes confiram resistência a um determinado produto químico. Cepas resistentes podem surgir como resultado do uso persistente de pesticidas que matam indivíduos com alelos suscetíveis e não matam aqueles que possuam alelos resistentes.
A resistência a inseticidas pode ser pensada como um processo de evolução acelerada de uma população que responde a uma intensa pressão seletiva, com a consequente sobrevivência dos indivíduos que possuem alelos que conferem resistência. A resistência é pré-adaptativa, resultado de mutações fortuitas. Assim, um pequeno número de indivíduos possui características que permitem sua sobrevivência sob doses de inseticidas normalmente letais. O próprio inseticida não produz uma mudança genética; seu uso continuado, entretanto, pode selecionar indivíduos resistentes.
Apesar dos vários estudos documentados sobre a resistência, o número de mecanismos envolvidos é bastante pequeno e inclui diminuição da taxa de penetração pela cutícula, detoxificação metabólica aumentada e diminuição da sensibilidade do sítio-alvo. Todos esses mecanismos são inespecíficos e, geralmente, conferem resistência cruzada a outro inseticida estruturalmente relacionado.
Uma alternativa para esse problema são os biopesticidas, que de acordo com a EPA (US Environmental Protection Agency), são substâncias derivadas a partir de materiais naturais, tais como animais, plantas, bactérias, fungos, protozoários e minerais. Um exemplo é o óleo de canola e o bicarbonato de sódio, pois tem aplicações de pesticida e são consideradas como biopesticidas.
O controle biológico é um fenômeno natural, a regulação do número de plantas e animais pelos inimigos naturais, os agentes bióticos de mortalidade. Envolve o mecanismo da densidade recíproca, o qual atua de tal forma que sempre uma população é regulada por outra população, ou seja, um ser vivo é sempre explorado por outro ser vivo e com efeitos na regulamentação do crescimento populacional, e assim mantendo o equilíbrio da natureza. O controle biológico foi definido por DeBach (1968) como “a ação de parasitoides, predadores e patógenos na manutenção da densidade de outro organismo a um nível mais baixo do que aquele que normalmente ocorreria nas suas ausências”.
De acordo com a EPA, Os biopesticidas se dividem em três classes principais:
	Pesticidas microbianos - consistem de um microrganismo (por exemplo, uma bactéria, fungo, vírus ou protozoários) como o ingrediente ativo. Pesticidas microbianos podem controlar diversos tipos de pragas, embora cada ingrediente ativo separado é relativamente específico para a praga-alvo.
	Pesticidas botânicos Incorporados - são substâncias pesticidas que as plantas produzem a partir de material genético que tenha sido adicionado a ela. A partir da introdução de proteínas específicas no material genético de plantas, ela produz a substância que destrói a praga.
	Pesticidas bioquímicos - substâncias que ocorrem naturalmente e que controlam pragas por mecanismos não tóxicos. Incluem substâncias como feromônios sexuais de insetos que interferem com o acasalamento, bem como uma variedade de extratos de plantas aromáticas que atraem pragas de insetos para armadilhas.
Um caso de biopesticidas de sucesso foi narrado por Thomas (2007), quando em resposta as preocupações sobre a saúde ambiental e humana na África, em 1989, foi lançado o programa LUBILOSA (Lutte contreles Biologique Locustes et les Sauteriaux) – Luta Biológica contra o Gafanhoto Grasshopper (Insecta: Orthoptera: Acrididae), onde foi identificado uma cepa virulenta do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae, que deu origem ao produto Green Muscle ®, que recebeu esse nome por causa cor verde dos seus esporos. Quando os esporos assexuados (chamados conídios) do fungo entram em contato com o corpo de um inseto hospedeiro, germinam e as hifas que emergem penetram a cutícula. O fungo passa então a desenvolver-se no interior do corpo do hospedeiro, matando o inseto ao fim de alguns dias.
De acordo com Parra et.al. (2002), atualmente o controle biológico assume importância cada vez maior em programas de manejo integrado de pragas (MIP), principalmente em um momento que se discute muito a produção integrada rumo a uma agricultura sustentável. Nesse caso, o controle biológico constitui ao lado da taxonomia, do nível de controle e da amostragem, um dos pilares de sustentação de qualquer programa de MIP. Além disso, é importante como medida de controle para manutenção de pragas abaixo do nível de dano econômico, junto a outros métodos, como o cultural, físico, o de resistência de plantas a insetos e os comportamentais (feromônios), que podem até ser harmoniosamente integrados com métodos químicos (produtos seletivos) ou mesmo com plantas transgênicas.
Apesar das grandes vantagens dos biopesticidas a sua elevada especificidade, requer uma identificação exata do agente patogênico/peste e, possivelmente, a necessidade de usar mais biopesticidas, a sua eficácia é variável devido à influência de fatores bióticos e abióticos (como por exemplo, a temperatura e pH) e a distribuição irregular dos biopesticidas no mercado, constituem inconvenientes ao seu uso.
3. PESTICIDAS BIOQUÍMICOS
3.1 Definição
Os pesticidas bioquímicos podem ser interpretados como um fenômeno natural: quase todas as espécies têm inimigos naturais que regulam suas populações.
Também conhecido como controle biológico, é considerado um tipo de biopesticida que consiste no uso de inimigos naturais das pragas para combatê-las, como por exemplo, o emprego de parasitoides no controle do pulgão do trigo. A técnica de controle biológico também pode ser realizada utilizando-se compostos químicos não tóxicos (de ocorrência natural), tal como feromônios sexuais utilizados para atrair as pragas para armadilhas.
O emprego de biopesticidas,como o uso do controle biológico, é essencial para uma boa execução do manejo integrado de pragas (MIP), pois, garante aos produtores ótimos resultados no combate as pragas e ainda uma diminuição no uso dos defensivos químicos.
Os organismos vivos que atuam como agentes de controle biológico constituem o grupo dos inimigos naturais, o qual é formado pelos parasitoides, predadores e patógenos.
Os dois primeiros são denominados agentes entomófagos e, o último, entomopatogênico. Esses organismos, entomopatogênicos, serão abordados dentro Pesticida Microbiano. 
Quanto aos entomófagos, embora exista um grande número de organismos que se alimentam de insetos, como pássaros, lagartos, sapos, tamanduá, a ênfase aqui é para insetos que se alimentam de insetos, onde se apoiam, atualmente, os programas de controle biológico de insetos-praga. Do ponto de vista econômico, um inimigo natural efetivo é aquele que é capaz de regular a densidade populacional de uma praga e mantê-la em níveis abaixo daquele de dano econômico estabelecido para um determinado cultivo. 
No geral, os inimigos naturais, em particular, os parasitoides e predadores mais efetivos, devem apresentar as seguintes características: adaptabilidade às mudanças das condições físicas do meio ambiente, um certo grau de especificidade a um determinado hospedeiro/presa, alta capacidade de crescimento populacional com relação a seu hospedeiro/presa, alta capacidade de busca, particularmente em baixas densidades do hospedeiro/presa, sincronização sazonal com o hospedeiro/presa e capacidade de sobreviver nos períodos de ausência do hospedeiro/presa, e capaz de modificar sua ação em função de sua própria densidade e do hospedeiro/presa, ou seja, mostrar densidade recíproca. 
Parasitoides – dentro da entomologia considera-se o termo parasitoide, ao inseto que parasita um hospedeiro, completa o seu ciclo em um único hospedeiro e usualmente mata esse hospedeiro. Suas larvas exibem o habito parasítico, e os adultos são de vida livre, se alimentando de néctar, substancias açucaradas etc. Os parasitoides estão, em sua maioria, dentro da Ordem Hymenoptera, e poucos na Ordem Diptera (Família Tachinidae). Atacam e se desenvolvem em todos os estágios dos insetos, ou seja, ovo, larva (ninfa), pupa e adulto. Alguns exemplos de parasitoides, Trichogramma pretiosum, Cotesia flavipes, Telenomus podisi, Trissolcus basalis, Lysiphlebus testaceipes, Aphidius colemani. 
Existem os parasitoides primários, aqueles que se desenvolvem em hospedeiros não parasitoides, ou seja, seus hospedeiros são fitófagos, saprófagos, polenófagos etc. E os hiperparasitóides, que são parasitoides que se desenvolvem em outro parasitoide (o parasitoide do parasitoide). Também existem os endoparasitóides, ou seja, o parasitoide que se desenvolve dentro do corpo do hospedeiro, podendo ser solitário, quando uma única larva completa seu desenvolvimento em determinado hospedeiro, ou gregário, quando várias larvas se desenvolvem até a maturidade em um único hospedeiro. E o ectoparasitóide, espécie que se desenvolve fora do corpo do hospedeiro (a larva se alimenta inserindo as peças bucais através do tegumento do hospedeiro), podendo ser também solitário e gregário. Como categorias do parasitismo, pode-se citar o multiparasitismo, situação na qual mais de uma espécie de parasitoide ocorre dentro ou sobre um único hospedeiro, e o superparasitismo, fenômeno no qual vários indivíduos de uma mesma espécie de parasitoide podem se desenvolver em um hospedeiro. No caso de um menor número de hospedeiros, em relação ao número de parasitoides, o superpararasitismo pode atuar como um mecanismo de regulação da população do parasitoide em função daquela do hospedeiro. E no multiparasitismo, pode ocorrer a competição, levando a morte de um dos parasitoides. 
Predadores – são indivíduos de vida livre, usualmente maior do que as presas requerem um grande número de presas para completar o seu ciclo de vida, e podem apresentar o comportamento predatório, tanto no estágio ninfal (larval) como adulto. Quanto ao hábito alimentar podem ser mastigadores ou sugadores. Estão presentes em várias ordens de insetos, sendo as mais importantes: Coleoptera (Famílias Coccinellidae, Carabidae), Diptera (Familias Syrphidae, Asilidae), Hemiptera (Famílias Anthocoridae, Pentatomidae, Reduviidae), Neuroptera (Família Chrysopidae), Hymenoptera (Família Vespidae), Dermaptera (Famílias Forficulidae, Labiduridae). Alguns exemplos de insetos predadores, Orius insidiosus, Chrysoperla externa, Labidura riparia, Cycloneda sanguinea, Porasilus barbiellinii, Brachygastra lecheguana, Podisus nigrispinus
3.2 Processo de desenvolvimento
O pesticida bioquímico pode ser definido pela ação dos inimigos naturais das diferentes pestes. Pode ser dividido em 2 grupos principais, controle biológico natural e controle biológico aplicado. O controle biológico natural ocorre quando as espécies nativas combatem e reduzem o número de indivíduos da espécie indesejada, por outro lado, o controle biológico aplicado envolve a intervenção do Homem para eliminar a peste. 
A principal via de controle biológico é a sua forma aplicada que consiste no uso de feromônios no combate às pestes. Este processo consiste na utilização de feromônios sexuais das espécies indesejadas em armadilhas, com o objetivo de atrair os organismos - alvo, controlando assim o número de indivíduos da peste. 
Figura 1 – Armadilha de feromônios
4. PESTICIDAS MICROBIANOS
4.1 Definição
Os pesticidas microbianos podem ser interpretados como uma estratégia de controle de pragas através da utilização de parasitoides, predadores e patógenos.
O controle microbiano de insetos pragas ou vetores, iniciou-se em 1945, nos Estados Unidos da América e utiliza microrganismos patogênicos isolados de insetos/vetores doentes durante epidemias/epizootias, que ocorrem naturalmente. Estes microrganismos produzem certas toxinas (esporos, células ou outros metabolitos) durante seu desenvolvimento e estas apresentam algumas atividades entomopatogênicas. Pesticidas microbianos são formulações que contém os esporos, células vegetativas ou algum metabolito do desenvolvimento dos microrganismos patogênicos e que mantém a característica de entomopatogenicidade. O desenvolvimento de Bacillus thuringiensis, um inseticida biológico, inócuo a vertebrados, peixes, flora, etc foi descoberta em 1902 por Ishiwata no Japão em 1902. A redescoberta deu-se em 1915 em Thuringia, na Alemanha por Berliner. Nos setenta anos que se seguiram à descoberta do Bacillus thuringiensis no início de 1900, ou seja 1902, no Japão e 1911 na Alemanha, houve relativamente pouca atenção voltada a esse micro organismo. Passados noventa anos, está sendo estudado por cientistas e pesquisadores das mais variadas áreas do conhecimento, tendo se realizado na década de noventa muitos eventos específicos a respeito do Bacillus thuringiensis (Oxford/Inglaterra, Cairo/Egito, Córdoba/Espanha, Montpelier/França, etc.) No Brasil, iniciaram-se Na década de 50 tanto os Estados Unidos quanto a França já produziam acima de 100 toneladas/ano desse importante inseticida biológico. No Brasil as primeiras aplicações do produto importado datam de 1960. No programa de bioengenharia no curso de pós-graduação em engenharia de alimentos houve o interesse em se desenvolver estudos de produção por fermentação submersa desse tipo de inseticida, utilizando-se das facilidades existentes no departamento de Engenharia de Alimentos. Seguiu-se uma tese de doutorado e uma de livre docência defendidas em 1976 e 1981 respectivamente sendo que ambas propiciaram a geração de processos de desenvolvimento de produtos, processos estes patenteáveis no Brasil. Esse tipo de bioinseticida também é usado no Brasil no controle de pragas da agricultura, como insetos da ordem lepidóptera que na fase jovem são lagartas tremendamente vorazes, causadoras de devastações na folhagem com enormes perdas na produção. Dentre esses vegetais suscetíveis estão o algodão, soja, muitas frutíferas, hortícolase florestas. Cerca de 150 variedades de insetos são suscetíveis ao Bacillus thuringiensis e nos EUA há recomendação para o emprego do inseticida biológico até mesmo para o tabaco.
As formulações de B. thuringiensis são os produtos biológicos mais vendidos em todo o mundo representando cerca de 90 % do faturamento com esses produtos. O seu emprego destina-se principalmente para o controle de lagartas, pragas florestais (30 milhões de dólares) e vetores representados por pernilongos e borrachudos. O custo para o tratamento de um hectare de cultura varia de US$ 7,5 a 15. Para o tratamento visando o controle de pernilongos, o custo envolvendo aplicação de B. thuringiensis var. israelenses pode chegar a US$ 67 o hectare. O mercado potencial para Bacillus thuringiensis deve crescer 10% ao ano e atingir cerca de US$ 150 milhões no ano 2000. Existem pesquisadores que acreditam em valores entre 300 a 750 milhões de dólares. No Brasil, o mercado para esses produtos é também muito promissor, pois ocorrem cerca de quinhentas pragas de importância econômica. Existem cerca de 65 produtos já desenvolvidos pelas indústrias, a partir de Bacillus thuringiensis, em diversas regiões do mundo, sendo 4 desenvolvidos por micro indústrias brasileiras.
No Brasil, iniciaram-se na Unicamp em 1970, estudos de produção de duas variedades de Bacillus thuringiensis, por fermentação submersa, culminando com uma tese de Mestrado em 1973. A continuidade levou a uma tese de Doutorado e depósito de uma patente de processo. Estudos posteriores implantaram o processo de fermentação semi sólida (10), usando resíduos particulados, farinhas, farelos, bagaço de cana de açúcar, quirela de milho, quirela de arroz, dentre outros resíduos da Agro indústria. Águas residuárias de agroindústrias e da pecuária, sangue de aves, como principal substrato fermentativo, também foram estudados como substrato, com a finalidade de obtenção de um biopesticida para uso contra pragas da Saúde Pública. Neste trabalho se apresentam estudos realizados em ambos os processos, fermentação semi-sólida usando quirela de milho e bagaço de cana como substrato fermentativo e fermentação submersa usando sangue de aves como substrato. Também se propõe, para a fermentação semi-sólida, o uso de um reator alternativo, para possibilitar o uso em pequenas propriedades ou desenvolvê-lo em pequenas empresas.
Estudou-se o desenvolvimento de duas variedades do microrganismo, Bacillus thuringiensis thuringiensis (Btt) e Bacillus thuringiensis israelensis (Bti), comparando sua produção com a realizada em substratos já reconhecidos. O processo submerso foi desenvolvido em agitador rotatório, sendo as variáveis do processo fermentativo, pH inicial, temperatura , agitação e aeração respectivamente 7,3; 30 o C; 150 rpm e a relação 1/5 entre volume de meio de cultura para volume nominal de frasco (50 ml/250 ml). Foram estudados substratos compostos com sangue de abatedouros de aves e de suínos. Os resultados obtidos tanto na fermentação submersa, como na fermentação semi-sólida, permitiram concluir que na fermentação semi sólida o binômio bagaço/quirela de milho e na fermentação submersa o sangue de aves, por permitirem bom crescimento e esporulação, e porque constituem resíduos abundantes e poluentes, podem ser utilizados com vantagens tecnológicas e econômicas para a produção de biopesticidas de Bacillus thuringiensis.
Foram desenvolvidos estudos de produção do inseticida bacteriano testando-se diferentes formulações de meios de cultura e utilizando-se subprodutos da agroindústria com a finalidade de reduzir custos de matéria prima. Determinaram-se os parâmetros e variáveis do processo fermentativo, passando-se a produzi-lo em condições satisfatórias, tendo-se realizado inclusive bioensaios com insetos, para verificar sua atuação entomopatogênica. A patente PI 7608688 resume-se em um processo de fermentação submersa para produção de um inseticida bacteriano que compreende uma nova técnica em relação ao controle químico dos insetos por soluções visando o controle microbiano de insetos. A patente foi concedida em 1984. Na continuidade das pesquisas observou-se que o micro organismo produzia outras toxinas além daquela à qual os insetos lepidópteros eram suscetíveis. Enquanto esta toxina era constituída de um complexo esporo cristal sendo ambos esporo e cristal tóxicos, que se formavam no interior da célula microbiana extra celular formava-se no sobrenadante da cultura uma exotoxina termo estável à qual eram suscetíveis os insetos da ordem dos dípterois, ou seja, moscas, mosquitos, muriçocas, etc.
4.2 Processo de desenvolvimento
Para o desenvolvimento de biopesticidas microbianos são utilizados organismos patogênicos, isolados a partir de insectos doentes no decorrer de grandes epidemias de origem natural. O primeiro biopesticida microbiano a ser utilizado foi desenvolvido pelo biólogo japonês Shigetane Ishiwata em 1901. Durante o seu trabalho, Shigetane Ishiwata isolou a bactéria Bacillus thuringiensis (Bt), que ainda hoje é amplamente utilizada. Atualmente mais de 400 espécies de fungos e de 90 espécies de bactérias são produzidas e vendidas em todo o mundo como biopesticidas, contra diferentes tipos de insetos. Os mais amplamente utilizados são as subespécies da bactéria Bacillus thuringiensis (Bt), que têm despertado um grande interesse face ao grave problema de poluição ambiental registrado em todo o mundo. Existem mais de 40 produtos baseados na Bt disponíveis globalmente para o controlo de larvas, besouros e mosquitos, que no seu conjunto perfazem cerca de 1% de todos os inseticidas vendidos. 
5. PESTICIDAS BOTÂNICOS INCORPORADOS
5.1 Definição
Os pesticidas botânicos incorporados podem ser interpretados como um campo de estudos em diferentes áreas, tais como ecologia de populações, biossistemática, comportamento, fisiologia e genética; O controle biológico por pesticidas botânicos incorporados envolve a interferência do homem.
A revolução na área da biologia molecular e da biotecnologia desde os princípios de 1980 promoveu um rápido desenvolvimento dos métodos de combate biológico, proporcionando aos biopesticidas competitividade no mercado dominado pelos pesticidas químicos. 
Os inseticidas botânicos foram muito populares e importantes entre as décadas de 30 e 40 e o Brasil foi grande produtor e exportador destes produtos, substâncias como piretro, rotenona e nicotina, que apresentam maior segurança no uso agrícola e menor impacto ambiental (Menezes, 2005).
Os inseticidas naturais foram gradativamente substituídos pelos sintéticos, pois apresentavam problemas como variações na eficiência, devido a diferenças na concentração do ingrediente ativo entre plantas e baixo efeito residual, que obrigava a se fazer várias aplicações em períodos curtos (Costa et al., 2004).
Ultimamente o interesse pelos biopesticidas botânicos para o controle de pragas tem aumentado. Substâncias atóxicas à saúde humana e ao ambiente vêm sendo avaliadas, fato este somado à demanda crescente por produtos alimentícios saudáveis e isentos de resíduos de agrotóxicos (Menezes, 2005).
O melhoramento genético convencional tem, a muito tempo, modificado geneticamente as plantas cultivadas, por meio de cruzamentos; no entanto estes cruzamentos só podem ser realizados entre espécies filogeneticamente próximas, estreitando desta forma, a base genética dessas plantas. Atualmente o melhoramento genético conta com a engenharia genética para auxiliar, algumas das limitações que lhe são impostas.  
Segundo Brasileiro e Cançado, 2000 a introdução do transgene no genoma vegetal receptor ocorre de forma controlada e independente da fecundação. Depois de incorporado ao genoma e alcançar a estabilidade de expressão, este transgene passa a fazer parte do material genético da planta sem alterar sua constituição genética global. Constituindo atualmente uma fonte de variabilidade genética adicional que pode ser explorada no melhoramento genético.
A obtenção de plantas transgênicas baseia-se em três etapas. A primeiraé a obtenção do gene a ser incorporado, o qual é normalmente encontrado na natureza e deverá ser isolado dos demais genes do organismo doador. Ele deve ser então incorporado em vetor para se processar a transformação.
A Segunda etapa consiste na técnica de introdução do gene na planta receptora. Três são os principais métodos a transformação via Agrobacterium, biobalística e eletroporação.
Finalmente a terceira e última etapa é dependente do poder de regeneração da célula em uma nova planta, por meio de cultura de tecidos. Talvez esta última seja o fator mais limitante, pois, de nada valeria se obter o gene e incorporá-lo na célula receptora sem contudo estabelecer a regeneração da planta. As pesquisas com reguladores de crescimento e cultura de tecidos vegetais, tem avançado consideravelmente, conseguido fazer regenerar um número cada vez mais crescente de espécies via cultivo in vitro,  possibilitando a transformação genética (Brasileiro e Cançado, 2000).
São variedades que contém um gene adicional possibilitando que a planta produza uma proteína que atua no controle de alguns insetos. A proteína sintetizada pela planta transgênica vem do Bacillus Thuringiensis (BT). Esse microorganismo é naturalmente encontrado no solo sendo conhecido pela sua capacidade de controlar insetos nocivos. O BT  tem sido utilizado em pulverizações há muitos anos para controlar várias pragas de diversas culturas.
A introdução do gene BT em determinado genótipo, confere a ele capacidade de produzir a Delta toxina, a qual por ocasião da esporulação, produz uma proteína cristalizada tóxica à larva de Lepidópteros.
O cristal da proteína se expressa, normalmente, como uma pró-toxina inativa, no intestino das larvas dos insetos, as proteases quebram a proteína em fragmentos ativos menores, ativando a toxina. A toxina ativa liga-se a receptores sob a superfície das células do intestino médio do hospedeiro, bloqueando o funcionamento das células (Moreira et al., 1999).
As plantas daninhas são fator limitante para o cultivo de várias espécies, pois competem por luz sola, nutrientes e água, com a cultura. O controle dessas plantas tem sido realizado com uso de herbicidas, que devem ser incorporados no solo ou aplicados antes que as espécies cultivadas germinem, evitando o contato com as mesmas, pois eles podem prejudica-las.
Em plantas com tolerância a herbicidas foram introduzidos genes que possibilitam o crescimento da planta mesmo em contato com o herbicida.
No caso da resistência ao herbicida glifosato é que o glifosato atua na inibição da síntese da enzima do 5 enol-piruvinil chiquimato 3 fosfato sintase (EPSP), importante na síntese de ácidos aromáticos em plantas e bactérias. Dois procedimentos podem ser utilizados na obtenção e plantas resistentes ao glifosato. O primeiro é a construção de um gene quimérico, EPSP de petúnia híbrida, que conecta-se a um promotor do vírus da couve-flor (CaMV), responsável pelo alto grau de expressão de genes em plantas. O gene é transferido par a planta por meio da agrobactéria. A presença do gene quimérico faz com ocorra grande produção de EPSP, tornando a planta resistente ao herbicida.
A Segunda forma é por meio de um gene mutado da EPSP sintase e uma bactéria (Salmoneia typhimurium) que altera um aminoácido na enzima e determina sua insensibilidade ao herbicida, fazendo com que as plantas transformadas com esse gene também apresentem tolerância ao glifosato. Nesse grupo tem-se soja Roundup Ready, milho Roundup Ready e algodão Roundup Ready (Moreira, 1999).
5.2 Processo de desenvolvimento
O combate biológico através das Proteínas Incorporadas nas Plantas (PIPs) baseia-se na técnica de ADN recombinante, onde é introduzido material genético nas plantas proveniente de um organismo com as características pretendidas. Assim, a própria planta passa a produzir o seu biopesticida, como consequência da transcrição e posterior tradução do gene introduzido, conferindo-lhe novas características. Esta via tem vindo a ser amplamente desenvolvida, tendo já conseguido atingir resultados bastante promissores em batatas, tomates, tabaco e algodão. A Figura 2 mostra o modo de ação da bactéria Bt. 
Figura 2 – Modo de ação de Bacillus thuringiensis
6. DESCRIÇÃO DETALHADA DE UM DOS PROCESSOS DE PRODUÇÃO 
As subfrações da Bt são obtidas pela separação rigorosa de cada produto da Bt num supernadante (sem partículas) e um “pellet” (com partículas) através de centrifugação (12,000g por 10 min). O supernadante sem partículas é filtrado (filtros com poros de 0,45 µm) sendo diluído em 10% (v/v) numa solução tampão salina de fosfato. 
As partículas resultantes da filtração são primeiramente concentradas 20x por osmose inversa durante 6 horas a uma temperatura de 4ºC. A semi-purificação das frações de CIP (corpos de inclusão paraesporal) é realizada segundo Thomas e Ellar et. al. com as seguintes modificações: Alíquotas 500 µL de cada produto da Bt diluído 2x e centrifugado (5 min) com 50 µL de vidro esmagado esterilizado para separarem os agregados. 
Após da centrifugação descontínua do gradiente de sacarose (80,000g por 14 horas a uma temperatura de 4°C) a camada de CIP rica em cristais é verificada através de uma análise proteica. A sacarose é removida recorrendo a uma diluição em 2 volumes e centrifugação com H20 duplamente destilada. Esta purificação é repetida 3 vezes. A solubilização dos CIP e conversão da pro- -endotoxina para ativar - endotoxina envolvem incubação quer dos produtos da Bt quer das frações dos CIP enriquecidos em 40mM de Carbonato de Sódio (pH 10) e a enzima tripsina (0.1% w/v) 9 a 37ºC. Para tal é efetuada uma eletroforese para monitorizar a digestão, e são recolhidas partículas residuais, incluindo esporos, através da centrifugação seguida de filtração por uma membrana (com poros de 0,2 µm). Dose equivalente é baseada na contagem dos esporos e na produção total de proteínas Bt. 
 
 
Figura 3. Esquema representativo do processo de produção.
7. REFERÊNCIAS
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