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26/08/2017 1 UNIDADE II: Vírus e fungos Profa. Dra. Deborah Moura Rebouças MICROBIOLOGIA VÍRUS 2 26/08/2017 2 Características gerais dos vírus •Contêm um único tipo de ácido nucleico, DNA ou RNA. •Contêm um envoltório proteico (às vezes recoberto por um envelope de lipídeos, proteínas e carboidratos) que envolve o ácido nucleico. •Multiplicam-se no interior de células vivas (hospedeiras) utilizando a maquinaria de síntese celular: são parasitas intracelulares obrigatórios. •Induzem a síntese de estruturas especializadas na transferência do ácido nucleico viral para outras células. 3 Vírus X Bactérias 4 26/08/2017 3 Tamanho dos vírus •O tamanho viral é determinado com o auxílio da microscopia eletrônica. •Vírus diferentes variam consideravelmente em tamanho. •Apesar de a maioria deles ser um pouco menor que as bactérias, alguns dos maiores vírus (como o vírus da vaccínia) são praticamente do mesmo tamanho de algumas bactérias pequenas. 5 Tamanho dos vírus 6 26/08/2017 4 Estrutura viral ÁCIDO NUCLEICO •Os vírus podem possuir tanto DNA como RNA, mas nunca ambos. •O ácido nucleico dos vírus pode ser: •DNA de fita dupla •DNA de fita simples •RNA de fita dupla •RNA de fita simples •O ácido nucleico pode ser linear, circular ou segmentado 7 Estrutura viral CAPSÍDEO •Envoltório proteico que protege o ácido nucleico •Constitui a maior parte da massa viral •Subunidades proteicas que compõem o capsídeo: capsômeros 8 26/08/2017 5 Estrutura viral ENVELOPE •Em alguns vírus, o capsídeo é coberto por um envelope, que normalmente consiste em uma combinação de lipídeos, proteínas e carboidratos. •Dependendo do vírus, os envelopes podem ou não apresentar espículas, constituídas por complexos carboidrato-proteína que se projetam da superfície do envelope, servindo para ligar o vírus à superfície da célula hospedeira. 9 Morfologia geral Vírus helicoidais Vírus poliédricos Vírus envelopados Vírus complexos 10 26/08/2017 6 Morfologia geral Vírus helicoidais •Lembram bastões longos, que podem ser rígidos ou flexíveis. •O genoma viral está no interior de um capsídeo cilíndrico e oco com estrutura helicoidal. •Exemplos: vírus da raiva e vírus da febre hemorrágica. 11 Morfologia geral Vírus poliédricos •Muitos vírus animais, vegetais e bacterianos são poliédricos. •O capsídeo da maioria dos vírus poliédricos tem a forma de um icosaedro, um poliedro regular com 20 faces triangulares e 12 vértices. •Os capsômeros de cada face formam um triângulo equilátero. •Exemplos: adenovírus e poliovírus. 12 26/08/2017 7 Morfologia geral Vírus envelopados •O capsídeo de alguns vírus é coberto por um envelope. •Os vírus envelopados são relativamente esféricos. •Exemplos: vírus helicoidais envelopados (vírus influenza) ou vírus poliédricos envelopados (herpesvírus). 13 Morfologia geral Vírus complexos •Vírus bacterianos, que possuem estruturas complicadas. •Exemplo: bacteriófago •Alguns bacteriófagos possuem capsídeos com estruturas adicionais aderidas: capsídeo (cabeça) poliédrico e bainha helicoidal. •A cabeça contém o genoma viral. 14 26/08/2017 8 Taxonomia dos vírus •O Comitê Internacional de Taxonomia Viral (CITV) agrupa os vírus em famílias com base: (1) no tipo de ácido nucleico viral (2) na estratégia de replicação (3) na morfologia •O sufixo virus é usado para os gêneros •O sufixo viridae é usado para as famílias •O sufixo ales é usado para as ordens •Exemplo: Família Herpesviridae, gênero Simplexvirus, espécie vírus do herpes humano, subespécie HHV-1, HHV-2. 15 16 26/08/2017 9 17 18 26/08/2017 10 19 Isolamento, cultivo e identificação de vírus •O fato de os vírus não poderem se multiplicar fora de uma célula viva complica a detecção, a quantificação e a identificação. •Os vírus não se multiplicam em meios de cultura quimicamente sintéticos, devendo estar obrigatoriamente associados a células vivas. •Os vírus cujos hospedeiros são as células bacterianas (bacteriófagos) multiplicam-se mais facilmente em culturas bacterianas. •Por isso, a maior parte do conhecimento sobre a multiplicação viral provém do estudo dos bacteriófagos. 20 26/08/2017 11 O cultivo de bacteriófagos em laboratório •Os bacteriófagos podem se multiplicar tanto em culturas bacterianas em meio líquido em suspensão quanto em meio sólido. •O meio sólido torna possível o uso do método da contagem da placa de lise para a detecção e a quantificação das partículas virais. 21 O cultivo de bacteriófagos em laboratório •Uma amostra de bacteriófagos é misturada com as bactérias em ágar fundido. •O ágar contendo a mistura de bacteriófagos e bactérias é então colocado em uma placa de Petri contendo uma camada de meio de cultura com ágar mais duro. •A mistura vírus-bactéria se solidifica formando uma camada com a espessura aproximada de uma célula bacteriana. 22 26/08/2017 12 O cultivo de bacteriófagos em laboratório •Cada vírus infecta uma bactéria, se multiplica e libera centenas de novos vírus que infectarão as bactérias adjacentes que, por sua vez, produzirão novos vírus. •Após vários ciclos de multiplicação viral, todas as bactérias localizadas nas proximidades da infecção inicial são destruídas. •Isso leva à produção de um determinado número de zonas claras, ou placas de lise, que são visíveis na monocamada de células bacterianas que crescem na superfície do ágar. 23 O cultivo de bacteriófagos em laboratório •Enquanto as placas são formadas, as bactérias de outras regiões da placa de Petri e que não foram infectadas continuam se proliferando rapidamente e produzem áreas de turbidez. •Cada placa corresponde, teoricamente, a uma única partícula viral da suspensão original. •Dessa forma, a concentração das suspensões virais, medida pelo número de placas formadas, em geral é dada em unidades formadoras de placas (UFPs). 24 26/08/2017 13 O cultivo de vírus animais em laboratório EM ANIMAIS VIVOS •Alguns vírus só podem ser cultivados em animais como camundongos, coelhos e cobaias. •A maioria dos estudos para avaliar a resposta imune contra infecções virais também é realizada em animais infectados. •Após ser inoculado com o espécime clínico, o animal é observado quanto ao aparecimento de sinais de doença ou é sacrificado para que seus tecidos possam ser analisados à procura de partículas virais. 25 O cultivo de vírus animais em laboratório EM OVOS EMBRIONADOS •É uma forma de hospedeiro conveniente e não dispendiosa para cultivo de vírus animais. •Uma perfuração é feita na casca do ovo embrionado, e uma suspensão viral ou uma suspensão de tecido suspeito de conter vírus é injetada no fluido presente no interior do ovo. •A multiplicação viral se manifesta pela morte do embrião, por danos às células embrionárias ou pela formação de lesões típicas nas membranas. •Método ainda usado na produção de vírus para algumas vacinas. 26 26/08/2017 14 O cultivo de vírus animais em laboratório EM CULTURAS DE CÉLULAS •Consistem em células que se dividem em meio de cultura em laboratório.•Os cultivos constituem coleções mais homogêneas de células e podem ser propagados e manipulados da mesma forma que as culturas bacterianas. 27 O cultivo de vírus animais em laboratório EM CULTURAS DE CÉLULAS •A obtenção de uma linhagem celular é iniciada com o tratamento enzimático de fragmentos do tecido animal para separação das células. • As células isoladas são suspensas em meio de cultura. •As células normais tendem a aderir ao recipiente e se reproduzem formando uma monocamada. •A infecção viral dessa monocamada muitas vezes causa a sua destruição à medida que os vírus se multiplicam. 28 26/08/2017 15 O cultivo de vírus animais em laboratório EM CULTURAS DE CÉLULAS •Essa destruição celular é denominada efeito citopático (ECP). • O ECP pode ser detectado e quantificado da mesma forma que as placas de lise produzidas por bacteriófagos em monocamadas de bactéria, sendo informado como UFP/mL. 29 O cultivo de vírus animais em laboratório EM CULTURAS DE CÉLULAS •Os vírus podem se multiplicar em: •Células de linhagem primária: derivadas de fragmentos de tecidos, tendem a morrer após poucas gerações. •Células de linhagem contínua: são utilizadas na multiplicação rotineira de vírus em laboratório. São células transformadas (ou cancerígenas), que podem ser mantidas por um número indefinido de gerações, sendo às vezes chamadas de linhagens imortais. 30 26/08/2017 16 Identificação viral •A identificação de um isolado viral não é tarefa fácil. •Os vírus só podem ser vistos com o auxílio de um microscópio eletrônico. •Os métodos sorológicos, como o Western blotting, são os métodos de identificação mais comumente utilizados, em que o vírus é detectado e identificado por sua reação com anticorpos. •Os virologistas podem identificar e caracterizar os vírus por métodos moleculares modernos, como o uso de poliformismos de tamanho de fragmentos de restrição (RFLPs, de restriction fragment length polymorphisms) e da reação em cadeia da polimerase (PCR, de polymerase chain reaction). 31 Multiplicação de bacteriófagos Os bacteriófagos podem se multiplicar por dois mecanismos alternativos: CICLO LÍTICO: •Termina com a lise e a morte da célula hospedeira •Ocorre em bacteriófagos T-pares (grandes, complexos e não envelopados) •4 fases: adsorção, penetração, biossíntese, maturação e liberação CICLO LISOGÊNICO: •A célula hospedeira permanece viva •Ocorre em bacteriófagos lambda (λ) •O fago permanece latente (inativo) •As células bacterianas hospedeiras são conhecidas como células lisogênicas 32 26/08/2017 17 Multiplicação de bacteriófagos CICLO LÍTICO: •ADSORÇÃO o fago adere à célula hospedeira. •PENETRAÇÃO o DNA do fago é injetado na célula hospedeira. Para isso, a cauda do bacteriófago libera uma enzima, a lisozima, que destrói uma porção da parede celular bacteriana. •BIOSSÍNTESE o DNA do fago direciona a síntese de componentes virais pela célula hospedeira. Esse período da multiplicação viral, no qual vírions completos e infectivos ainda não estão formados, é denominado período de eclipse. A síntese proteica do hospedeiro é interrompida. •MATURAÇÃO Os componentes virais são montados espontaneamente, formando novas partículas virais. •LIBERAÇÃO a célula hospedeira sofre lise através da lisozima, liberando os novos bacteriófagos produzidos. Os fagos liberados infectam outras células suscetíveis vizinhas, e o ciclo de multiplicação viral é repetido dentro dessas células. 33 Multiplicação de bacteriófagos 34 CICLO LÍTICO 26/08/2017 18 Multiplicação de bacteriófagos CICLO LISOGÊNICO: •Após a penetração em uma célula de E. coli, o DNA do fago, originalmente linear, forma um círculo. •Esse círculo pode se multiplicar e ser transcrito, levando à produção de novos fagos e à lise celular (ciclo lítico). •Alternativamente, o círculo pode se recombinar com o DNA bacteriano circular e se tornar parte dele (ciclo lisogênico). •O DNA do fago inserido na célula passa a ser chamado de profago. •Sempre que a maquinaria celular replicar o cromossomo bacteriano, o DNA do profago também será replicado. •O profago permanece latente na progênie celular. Entretanto, um evento espontâneo raro ou mesmo a ação da luz UV ou de determinadas substâncias químicas pode levar à excisão do DNA do profago e ao início do ciclo lítico. 35 Multiplicação de bacteriófagos 36 CICLO LISOGÊNICO 26/08/2017 19 Multiplicação de vírus animais •A multiplicação dos vírus animais segue o padrão básico da multiplicação dos bacteriófagos, mas com várias diferenças. •Os vírus animais diferem dos fagos no seu mecanismo de penetração dentro da célula hospedeira. •Além disso, uma vez dentro da célula, a síntese e a montagem de novos componentes virais são ligeiramente diferentes, em parte devido às diferenças entre as células procarióticas e eucarióticas. •Os vírus animais possuem determinados tipos de enzimas que não são encontrados nos fagos. •Finalmente, os vírus animais e os fagos diferem quanto aos mecanismos de maturação e liberação e quanto aos efeitos de sua multiplicação na célula hospedeira. •Existem diferenças entre os vírus de DNA e RNA com relação aos processos de biossíntese. 37 Multiplicação de vírus animais 38 26/08/2017 20 Multiplicação de vírus animais 39 Replicação de um vírus animal contendo DNA Multiplicação de vírus animais 40 Replicação de um vírus animal contendo RNA 26/08/2017 21 Multiplicação de vírus animais 41 Replicação de um retrovírus animal •Esses vírus contêm uma enzima, a transcriptase reversa, que utiliza o RNA viral como molde para a •síntese de um DNA de fita dupla complementar. •Essa enzima também •degrada o RNA viral original. O DNA •viral é então integrado ao cromossomo da célula hospedeira como •um provírus. Vírus e câncer •Os oncogenes, quando ativados, transformam células normais em células cancerosas. •Os vírus capazes de produzir tumores são denominados vírus oncogênicos. •Muitos vírus de DNA e retrovírus são oncogênicos. •O material genético dos vírus oncogênicos integra-se no genoma da célula hospedeira. •As células transformadas perdem a inibição por contato, possuem antígenos virais específicos (TSTA e antígeno T), exibem anormalidades cromossômicas e podem, ainda, produzir tumores quando injetadas em animais suscetíveis. 42 26/08/2017 22 Vírus e câncer Vírus de DNA oncogênicos •Os vírus oncogênicos são encontrados entre as famílias Adenoviridae, Herpesviridae, Poxviridae e Papovaviridae. •O vírus EB, um herpesvírus, causa linfoma de Burkitt e carcinoma nasofaríngeo. O Hepadnavirus causa câncer hepático. Vírus de RNA oncogênicos •Entre os vírus de RNA, somente os retrovírus parecem ser oncogênicos. •HTLV-1 e HTLV-2 têm sido associados com leucemia e linfoma em seres humanos. 43 Infecções virais Infecções virais latentes •Uma infecção viral latente é aquela em que o vírus permanece dentro da célula hospedeira por longos períodos, sem produzir uma infecção. •Os exemplos são o herpes labial e o herpes zoster. 44 Infecções virais persistentes ou crônicas •As infecções virais persistentes são processos patológicos que se estendem por um longo período, sendo geralmente fatais. •As infecções viraispersistentes são causadas por vírus convencionais; os vírus se acumulam por um longo período. •Por exemplo, o vírus do sarampo é responsável por uma forma rara de panencefalite subaguda esclerosante, vários anos após causar o sarampo. 26/08/2017 23 Infecções virais 45 Prions •Os prions são proteínas infecciosas descobertas na década de 1980. •Todas as doenças causadas por prions, como a CJD e a doença da vaca louca, envolvem a degeneração do tecido cerebral. •As doenças causadas por prions são resultantes de uma proteína alterada; a causa da alteração pode ser uma mutação no gene da PrPC ou o contato da proteína normal com a proteína alterada (PrPSc). 46 26/08/2017 24 Vírus de plantas e viroides •Os vírus de plantas entram nas plantas hospedeiras através de lesões ou com parasitas invasivos como os insetos. •Alguns vírus de plantas podem se multiplicar em células de insetos (vetores). •Os viroides são fragmentos de RNA infecciosos causadores de algumas doenças em plantas, como o viroide do tubérculo afilado da batata. 47 FUNGOS 48 26/08/2017 25 Características dos fungos •As colônias dos fungos são descritas como estruturas vegetativas porque são compostas de células envolvidas no catabolismo e no crescimento. •Fungos filamentosos e fungos carnosos •Leveduras •Fungos Dimórficos 49 Características dos fungos •Fungos filamentosos e fungos carnosos •O talo (corpo) de um fungo filamentoso ou de um fungo carnoso consiste em filamentos longos de células conectadas; esses filamentos são denominados hifas, que podem crescer até imensas proporções. •Hifas septadas Na maioria dos fungos filamentosos, as hifas contêm paredes cruzadas denominadas septos, que dividem as hifas em distintas unidades celulares uninucleadas (um único núcleo). •Hifas cenocíticas Em algumas poucas classes de fungos, as hifas não contêm septos e se apresentam como células longas e contínuas com muitos núcleos. 50 26/08/2017 26 Características dos fungos •Fungos filamentosos e fungos carnosos 51 Características dos fungos •Fungos filamentosos e fungos carnosos •Hifa vegetativa A porção de uma hifa que obtém nutriente. •Hifa reprodutiva ou aérea a porção envolvida com a reprodução. Projeta-se acima da superfície sobre a qual o fungo está crescendo e frequentemente sustenta os esporos reprodutivos. •Micélio Quando as condições ambientais são favoráveis, as hifas crescem formando uma massa filamentosa chamada de micélio, que é visível a olho nu. 52 26/08/2017 27 Características dos fungos 53 •Fungos filamentosos e fungos carnosos Características dos fungos •Leveduras •As leveduras são fungos unicelulares, não filamentosos, tipicamente esféricos ou ovais. •Da mesma forma que os fungos filamentosos, as leveduras são amplamente distribuídas na natureza: com frequência são encontradas como um pó branco cobrindo frutas e folhas. •As leveduras de brotamento, como as Saccharomyces, dividem-se formando células desiguais. 54 26/08/2017 28 Características dos fungos •Leveduras •No brotamento, a célula parental forma uma protuberância (broto) na sua superfície externa. •À medida que o broto se alonga, o núcleo da célula parental se divide, e um dos núcleos migra para o broto. •O material da parede celular é então sintetizado entre o broto e a célula parental, e o broto acaba se separando. 55 Características dos fungos •Leveduras •Uma célula de levedura pode produzir mais de 24 células- filhas por brotamento. Algumas leveduras produzem brotos que não se separam uns dos outros; esses brotos formam uma pequena cadeia de células denominada pseudo-hifa, como em Candida albicans. •As leveduras de fissão, como Schizosaccharomyces, dividem-se produzindo duas novas células iguais. Durante a fissão binária, as células parentais se alongam, seus núcleos se dividem, e duas células-filhas são produzidas. 56 26/08/2017 29 Características dos fungos •Fungos Dimórficos •Alguns fungos, mais notadamente as espécies patogênicas, exibem dimorfismo – duas formas de crescimento. •Tais fungos podem crescer tanto na forma de fungos filamentosos quanto na forma de levedura. •A forma de fungo filamentoso produz hifas aéreas e vegetativas; a forma de levedura se reproduz por brotamento. •O dimorfismo nos fungos patogênicos é dependente de temperatura: a 37°C, o fungo apresenta forma de levedura; a 25°C, de fungo filamentoso. 57 Características dos fungos •Fungos Dimórficos 58 26/08/2017 30 Ciclo de vida ESPOROS ASSEXUAIS: •Esporangiósporos: formado no interior de um esporângio, ou bolsa, na extremidade de uma hifa. O esporângio pode conter centenas de esporangiósporos. •Conidiósporos (conídios): um esporo unicelular ou multicelular que não é armazenado em uma bolsa. São produzidos em cadeias na extremidade do conidióforo. 59 Ciclo de vida ESPOROS SEXUAIS: •Geralmente são produzidos em resposta a circunstâncias especiais, muitas vezes durante mudanças ambientais. •Etapas: •1. Plasmogamia:Um núcleo haploide de uma célula doadora (+) penetra no citoplasma da célula receptora (–). •2. Cariogamia: Os núcleos (+) e (–) se fundem para formar um núcleo zigoto diploide. •3. Meiose: O núcleo diploide origina um núcleo haploide, esporos sexuais, dos quais alguns podem serrecombinantes genéticos. 60 26/08/2017 31 Ciclo de vida 61 Ciclo de vida 62 26/08/2017 32 Ciclo de vida 63 Ciclo de vida 64 26/08/2017 33 Fungos de importância médica •Zigomicetos possuem hifas cenocíticas e produzem esporangiósporos e zigósporos. •Ascomicetos possuem hifas septadas e produzem ascósporos e frequentemente conidiósporos. •Basidiomicetos possuem hifas septadas e produzem basidiósporos; alguns produzem conidiósporos. •Teleomórficos produzem esporos sexuais e assexuais. •Anamórficos produzem somente esporos assexuais. 65 Fungos de importância médica 66 26/08/2017 34 Doenças causadas por fungos •Micoses sistêmicas são infecções fúngicas quem afetam muitos tecidos e órgãos. •Micoses subcutâneas são infecções fúngicas que ocorrem abaixo da pele. •Micoses cutâneas afetam tecidos contendo queratina, como cabelo, unhas e pele. •Micoses superficiais são localizadas nos fios de cabelo e nas células superficiais da pele. 67 Referência utilizada 68 TORTORA, GERARD J.; FUNKE, BERDELL R.; CASE, CHRISTINE L. Microbiologia. 10 ed. Porto Alegre: Artmed, 2012. Capítulo 13: Vírus, Viroides e Prions Capítulo 12: Eucariotos: Fungos, Algas, Protozoários e Helmintos 26/08/2017 35 Obrigada pela atenção! 69
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