5. Técnicas de Purificação de Caracterização de Proteínas

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Prof. Dr. Helotonio Carvalho
Diadema, 1º semestre de 2012
Unidade Curricular de Bioquímica Estrutural
UNIFESP – Campus Diadema
Técnicas de Purificação e Caracterização de Proteínas
Aula Prática na semana que vem na Unidade Conforja!
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Uma célula possui milhares de proteínas diferentes, o que torna o processo de separá-las algo extremamente difícil. 
Os métodos existentes para purificação e caracterização de proteínas têm como objetivos determinar características físicas como peso molecular, ponto isoelétrico e número de subunidades, bem como a natureza dos aminoácidos constituintes e sua seqüência. 
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Purificação de Proteínas 
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A purificação de proteínas utiliza métodos baseados em diferentes propriedades como carga, tamanho e polaridade.
Tipicamente, é uma tarefa bastante difícil quando se parte de um tecido, pois em muitos casos consiste em chegar a uma proteína com pureza maior > 98% a partir de um tecido no qual ele pode representar menos de 0,1% em peso!! Técnicas de biologia molecular têm facilitado este processo através da produção de proteínas recombinantes. 
O processo de purificação exige uma série de etapas seqüenciais, que enriquecem progressivamente a solução na proteína desejada. 
A escolha do material de partida é crucial! Isso pode facilitar muito a purificação. Uma proteína pode estar presente tanto na hipófise, quanto no fígado de um animal de laboratório. O fígado, por ser maior, deve ser o órgão de escolha. 
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O tipo de estratégia de purificação varia de acordo com a localização da proteína dentro da célula, bem como o tipo de proteína. 	
Uma proteína de membrana exige a solubilização da membrana com detergente.
Proteínas fortemente ligadas ao DNA como histonas, necessitam de quebra do núcleo e redução das interações com o DNA (p.e. com o uso de alta concentração de sal).
Se uma proteína é mitocondrial, é mais fácil purificar esta organela (centrifugação diferencial) a fim de reduzir o número de proteínas contaminantes nas etapas subseqüentes.
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Planejamento de um processo de purificação de proteína
Escolha do material de partida
Lise das células
Precipitação de proteínas contaminantes com (NH4)2SO4
Diálise para retirada de sal
1a etapa cromatográfica
2a etapa cromatográfica
Proteína pura
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Métodos utilizados na lise de tecidos e células
Liquidificador: quebra tecido conjuntivo e também as células. Também pode romper organelas.
Homogeneizador tipo Potter: rompe as células mas deixa organelas intactas.
Sonicação
Ciclos de congelamento/descongelamento 
Detergentes
O método a ser usado depende do tipo de material inicial (tecidos, células de mamíferos em cultura, bactérias) e do tipo de proteína em questão. Sonicação e ciclos de congelamento/descongelamento são mais usados para culturas de células e bactérias, enquanto liquidificador e Potter são mais indicados para se processar tecidos.
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Sobrenadante 2
Mitocôndria e lisossomos
Purificação de componentes celulares através de centrifugação diferencial
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“Salting in” e “Salting Out”
A solubilidade de proteínas é afetada pela concentração de sal de duas maneiras:
Em concentrações baixas de sal, a solubilidade de uma proteína aumenta com a [sal] (“salting in”). 
Em concentrações mais altas de sal, a solubilidade de uma proteína dimimui com o aumento da [sal]. Quando a concentração de sal é suficientemente elevada, a proteína deve estar quase completamente precipitada (“salting out”). 
Devido ao fato de a solubilidade de diferentes proteínas em alta concentração de sal variar bastante, a técnica de “salting out” é bastante usada nas etapas iniciais de purificação de proteínas. 
O sal mais usado para esta finalidade é o (NH4)2SO4.
Testes iniciais são realizados para encontrar uma concentração de sulfato de amônio que precipite o máximo de proteínas contaminantes sem precipitar a proteína de interesse.
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A diálise é usada para separar moléculas pequenas de moléculas maiores
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Métodos de separação de proteínas
1-Cromatografia 
Definições: 
Fase estacionária (matriz sólida porosa)
Fase móvel (tampão, solvente, gás)
Tipos: 
Coluna
Camada fina
Papel
Equipamentos
HPLC (High Pressure Liquid
Chromatography): amostras líquidas
 FPLC (Fast Protein Liquid 
Chromatography ): proteínas em solução
CG (Cromatógrafo a Gás): amostras volatilizáveis.
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Cromatografia em coluna
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Cromatografia de troca iônica
Resina pode ser carregada negativamente, com no caso ao lado, ou positivamente.
As proteínas se movem a diferentes velocidades de acordo com sua carga no pH do tampão utilizado. 
No caso ao lado, com uma resina carregada negativamente, proteínas com carga mais negativa se movem mais rapidamente e eluem antes da coluna. 
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Resinas de troca iônica
Separação de proteínas básicas (com carga positiva) e neutras
Separação de proteínas ácidas (com carga negativa) e neutras
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Cromatografia de filtração em gel
Separação de proteínas por tamanho.
Proteínas maiores passam mais facilmente, enquanto as menores entram nos poros das esferas de resina e demoram mais para eluir.
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Cromatografia 
de afinidade
Separação de proteínas por afinidade com a coluna.
Alta especificidade.
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Separação baseada na migração de proteínas carregadas submetidas a um campo elétrico.
No caso de proteínas, utiliza géis de poliacrilamida com ligações cruzadas que funcionam como peneiras moleculares diminuindo a migração das proteínas. Proteínas com relação carga/massa menor têm um maior atraso na migração.
SDS-PAGE: caso especial em que se utiliza o detergente dodecil sulfato de sódio, que se liga a todas proteínas da amostra conferindo uma carga negativa bastante alta a estas. A carga intrínseca das proteínas passa a ser irrelevante. Como o SDS desnatura as proteínas, todas passam a ter uma forma parecida e a separação ocorre, neste caso, quase que exclusivamente pela massa da proteína. 
Métodos de separação de proteínas
2-Eletroforese 
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Gel corado com Coomassie Blue
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Determinação de peso molecular por SDS-PAGE
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Focalização isoelétrica
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Eletroforese Bidimensional
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Eletroforese Bidimensional
Permite separar até milhares de proteínas diferentes!!
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Determinação da sequência de aminoácidos de uma proteína
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Determinação da composição de aminoácidos por HPLC
Para a detecção dos aminoácidos por HPLC, estes são derivatizados com um composto fluorescente (OPA, o-ftalaldeído). A identificação dos picos de cada aminoácido se dá pela comparação com padrões. Um pico com o mesmo tempo de retenção de um padrão identifica aquele aminoácido.
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Clivagem de uma proteína com Tripsina
Tripsina cliva proteínas após resíduos de Arg ou Lys.
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Clivagem de uma proteína com Quimiotripsina
Quimiotripsina cliva proteínas após resíduos de aminoácidos aromáticos.
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Clivagem de uma proteína com brometo de cianogênio
Brometo de cianogênio cliva proteínas em resíduos de metionina
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Montagem da seqüência de aminoácidos da proteína a partir dos fragmentos gerados
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Sequenciamento de peptídeos através da Degradação de Edman
 Identificar o aminoácido amino-terminal.
Purificar o peptídeo com n-1 aminoácidos e reagir novamente com fenilisotiocianato.
Funciona bem com peptídeos pequenos (até 50 aas).
Esta reação permite identificar o número de cadeias polipeptídicas de uma proteína identificando o aminoácido NH2-terminal.
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Quebra de pontes S-S
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Espectrofotometria
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A espectrofometria utiliza a propriedade de absorção de luz característica de uma série de substâncias.
Espectros de absorção podem ser usados para identificação de substâncias, sobretudo na região do infravermelho.
A absorção na região do espectro visível e ultravioleta é muito usada para medidas de concentrações de proteínas (e ácidos nucléicos).
Qualquer reação
que produza cor pode ser acompanhada pelo seu espectro na região do visível.
Dosagem de proteínas por espectrofotometria UV-Vis
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Espectrofotometria-Lei de Lambert-Beer
A=e b C
I0=intensidade de luz incidente
I=intensidade de luz transmitida
e=absortividade molar 
b=caminho ótico da luz pela amostra
C=concentração da solução em estudo
A absorbância de uma amostra é diretamente proporcional à concentração da molécula responsável pela absorção
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Espectrometria de massa
Permite a determinação da massa de proteínas com extrema precisão! Após se saber a massa da proteína, pode-se detectar facilmente modificações covalentes, presença de cofatores, etc. Também pode ser usada no sequenciamento de peptídeos.
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Espectro ESI-MS de apomioglobina (16.951 Da) de coração de cavalo
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Determinação de estrutura de proteínas por Difração de Raios X
 Raiox X incidem sobre os átomos de um cristal de proteína ,sofrendo difração.
O padrão de difração pode ser usado para determinar a posição e a natureza destes átomos.
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Espectro de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) Unidimensional de uma globina
 RMN utiliza a propriedade de spin nuclear apresentada por alguns átomos e a alteração deste spin quando submetido a um campo magnético.
 1H e 13N apresentam spin nuclear e geram sinais em um espectro de RMN
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Determinação da estrutura de uma proteína por RMN Bidimensional
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