Aula 4 Esterilizacao

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Esterilização
Profa. Márcia Pedrini
Engenharia Bioquímica (DEQ0328)
(Capítulo 3 - Livro Biotecnol. Industrial
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Esterilização para processos fermentativos
	Esterilizar um equipamento significa eliminar todas as formas de vida de seu interior ou superfície. 	
Esterilização 
Porquê???
	Em alguns processos biotecnológicos industriais, a eliminação parcial da população microbiana dos equipamentos é suficiente para garantir a qualidade que se deseja no produto.
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Esterilização para processos fermentativos
Fermentação alcoólica;
Produção de vinagre/ácido acético;
Ácido láctico;
Antibióticos
E outros
Processos que ocorre a produção de inibidores de crescimento
O teor de inibidor impede + ou – o crescimento microbiano;
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Esterilização para processos fermentativos
Na indústria de laticínios, os processos de pasteurização destroem a maior parte, mas não todos micro-organismos;
Sais, açúcares em altas concentrações, condimentos, preservantes químicos,...
Aplicação de métodos de desinfecção que garantem assepsia adequada
ou controle pelas condições que se impõem.
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Esterilização para processos fermentativos
Métodos de esterilização
Calor seco
Calor úmido
Radiações UV
Radiações ionizantes
Ultrassons
Físicos
Hipoclorito
Fenóis
Formaldeído
Óxido de etileno
Ozônio
Dióxido de enxofre
Químicos
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Esterilização para processos fermentativos
Reatores bioquímicos e tubulações
Equipamentos destinados ao processamento de produtos de fermentação
Meios de cultura
Calor úmido (vapor saturado)
Calor úmido
Calor úmido, filtração em membranas
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Esterilização para processos fermentativos
Modo de ação dos agentes esterilizantes
Calor úmido
Tempera-tura elevada
Alto grau de umidade
Desnaturação irreversível das proteínas
Proteínas e carboidratos sofrem alterações sob tratamento de calor
Caramelização e geram produtos tóxicos;
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Esterilização para processos fermentativos
Modo de ação dos agentes esterilizantes
Calor seco
Transferência de calor lenta;
Diminuição do nível de hidratação celular;
Oxidação dos constituintes químicos
Confere certa proteção para proteínas, mas se houver baixo conteúdo de água na célula pode haver coagulação das proteínas também...
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Esterilização para processos fermentativos
Modo de ação dos agentes esterilizantes
Radiação UV
Ação esterilizante na região do espectro de 220 a 300nm -> região abiótica
Ligações cruzadas entre pirimidicas adjacentes na mesma fita de DNA, principalmente entre os resíduos de timina -> perda da integridade do DNA
O efeito letal é proporcional à dose de radiação aplicada
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Esterilização para processos fermentativos
Modo de ação dos agentes esterilizantes
Radiação UV
RNA também pode sofre ação da UV -> inativação 
pH, estado fisiológico da célula (> atividade na fase log) e constituição genética influenciam a sensibilidade microbiana a UV
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Esterilização para processos fermentativos
Modo de ação dos agentes esterilizantes
Radiação ionizante
Principais: alfa, beta, gama, raios X, raios catódicos, prótons, nêutrons e elétrons de alta energia;
Principal alvo: DNA
Morte celular resulta da formação de uma cadeia de ionização em uma porção significativa do DNA. A sensibilidade dos diferentes organismos varia com o volume de DNA;
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Esterilização para processos fermentativos
Modo de ação dos agentes esterilizantes
Óxido de etileno (EtO)
É um gás inodoro, sem cor, inflamável e explosivo.
Éter cíclico que mata as células, agindo com agente alquilante.
Proteínas  desnaturação
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Esterilização para processos fermentativos
Modo de ação dos agentes esterilizantes
Óxido de etileno (EtO)
Vantagens:
Esteriliza materiais sem danificá-los;
É utilizado para materiais termossensíveis;
É um gás altamente penetrante, com grande capacidade de difusão e solubilidade;
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Esterilização para processos fermentativos
Modo de ação dos agentes esterilizantes
Gluteraldeído
Age na superfície das células  interações glutaraldeído-proteínas;
Interação aumenta com a elevação do pH;
Reage principalmente com grupos amina livres das proteínas da camada peptideoglicana das bactérias  interferência no transporte de aminoácidos de baixo peso molecular
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Esterilização para processos fermentativos
Modo de ação dos agentes esterilizantes
Membranas Filtrantes
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Esterilização de reatores por calor úmido
	Agente de uso mais frequente é o calor úmido (vapor saturado);
	Obtido em caldeiras e distribuídos por dutos de aço galvanizado ou aço inoxidável, isolados termicamente;
Com altas temperaturas e pressões  o vapor é considerado estéril
– Pode-se usar filtração em cartuchos esterilizantes imediatamente antes da entrada do vapor no processo;
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Esterilização de reatores por calor úmido
Esterilização de reatores vazios
-> Injeção de vapor no interior e expulsão do ar presente;
-> Fechar reator e injetar vapor até T e P adequadas (121 °C e 1 atm);
-> 40 minutos a 1 hora – novas injeções só para manter T e P;
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Esterilização de reatores por calor úmido
Esterilização de reatores vazios
-> Fechar a entrada de vapor e injetar ar esterilizado para evitar que o resfriamento e a condensação do vapor presente no interior gere vácuo -> danos ao equipamentos ou promover entrada de ar externo contaminado por fissuras em soldas, vazamentos em válvulas etc.
-> Após resfriamento e estabilização da pressão interna, o meio de cultura esterilizado externamente pode ser carregado.
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Esterilização de reatores por calor úmido
Esterilização de reatores com meio de cultura
-> Durante o processo deve ser fornecida uma agitação mínima ao meio de cultura;
Requer 3 etapas:
1 – Circula-se vapor pela serpentina ou camisa até que o meio atinja 96 a 97°C, sendo que a cabeça do tanque deve receber vapor fluente para expulsar o ar do interior; Vapor fluente também deve ser usado para esterilizar válvulas, filtros e tubulações de entrada e saída do reator;
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Esterilização de reatores por calor úmido
Esterilização de reatores com meio de cultura
Requer 3 etapas:
2- Injetar vapor diretamente no meio de cultura até 100°C Fechar reator e injetar vapor até T e P adequadas (121°C e 1 atm) e corta-se a injeção direta de vapor controlando através da serpentina;
20 a 40 minutos – DEPENDE!
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Esterilização de reatores por calor úmido
Esterilização de reatores com meio de cultura
Requer 3 etapas:
3- Para o resfriamento, circular água fria nas serpentinas até 100°C -> injetar ar esterilizado para evitar formação de vácuo pela condensação do vapor; A 85°C, abrir a válvula de exaustão de gases;
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Esterilização de reatores por calor úmido
Esterilização de reatores com meio de cultura
Tempo de esterilização:
	Se reator é usado sempre com o mesmo microrganismo, se estiver em bom estado (perfeitamente limpo e sem fissuras, sem vazamentos em válvulas ou conexões de sensores) – 20 a 40 minutos a 121°C e 1 atm;
	Se for um reator multipropósito, utilizado com bactérias ou fungos formadores de esporos altamente resistentes ao calor – assepsia química antes da esterilização a vapor – pode ser até acima de 60 minutos a 121°C;
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Esterilização de reatores por calor úmido
Esterilização de reatores com meio de cultura
Etapa crítica: Aquecimento do meio de cultura até 96 ou 97°C
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Esterilização de reatores por calor úmido
Esterilização de reatores com meio de cultura
Reatores com esterilização programável
Automatizado – função de esterilização em software de controle
Esterilização em autoclaves
Reatores pequenos de até 30L
Erlenmeyers com meio de cultura – 15-30 minutos
Reatores – 40 minutos a 1 hora -> centro demora a atingir a temperatura adequada
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Esterilização de reatores por calor úmido
Esterilização de reatores com meio de cultura
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Esterilização de reatores por
calor úmido
Etapa de resfriamento
 - Inicia-se com o desligamento do aquecimento ou fechamento da entrada de vapor.
- Somente abrir a autoclave após a temperatura chegar próxima do ambiente, já que uma despressurização brusca pode provocar danos aos sensores colocados no interior dos reatores, como sondas de pH e do oxigênio dissolvido;
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Esterilização de reatores por calor úmido
 - Linha de exaustão de gases com filtro esterilizante adequado:
Evitar tanto a contaminação do reator por micro-organismos do ambiente como a contaminação do ambiente por micro-organismos e aerossóis originados no reator;
 - Linhas de inoculação, amostragem e esgotamento devem também ser esterilizadas pela passagem de vapor saturado