relatorio pratica 2 e 3 (1)

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Precipitação com solvente orgânico de proteínas da levedura Saccharomyces cerevisiae e dosagem da atividade enzimática da invertase
Carla Rafaela de Andrade Maia 144250014, Layse Guedes Campos 144250040, Myllena Luiza Freitas Ferreira 144250022, Nicole Andrade Faria 144250031
Resumo
Durante a purificação de biomoléculas pode-se utilizar a precipitação para que ocorra o sucesso do processo. O efeito crucial da precipitação por solventes orgânicos é a redução da atividade da água pela diminuição da constante dielétrica do meio, fazendo com que aumente as forças eletrostáticas de atração entre as moléculas de proteína provocando a agregação entre estas moléculas, ocorrendo a precipitação. Após a precipitação é realizado a dosagem da atividade enzimática com a finalidade de analisar a integridade e a localização da molécula alvo. A prática teve como objetivo a precipitação por solvente orgânico de soluções advindas do rompimento celular da levedura Saccharomyces cerevisiae seguida da dosagem da atividade enzimática da invertase. Foi utilizado um espectrofotômetro para ler a absorbância a 540nm, com posse dos dados foi possível avaliar que a atividade enzimática encontrada não foi adequada, sendo o método utilizado não eficiente para a purificação da invertase ativa.
Introdução 
	Nos processos de purificação de biomoléculas a etapa de precipitação é de suma importância para que ocorra a purificação de proteínas de interesse biotecnológico. Durante esta etapa são obtidos o precipitado e o sobrenadante da composição da amostra, o precipitado contém um agregado de moléculas que podem ser vistas a olho nu e é obtido através da sedimentação das partículas sob força centrífuga (BELL, et al., 2003).
A precipitação pode ocorrer pela adição de solventes orgânicos nas soluções aquosas de proteínas. Tal fenômeno acontece devido os solventes apresentarem uma constante dielétrica inferior à da água. Solventes orgânicos em baixas temperaturas (0º C ou menos) são úteis para a separação de misturas proteicas, porque as proteínas podem ser precipitadas sem sofrerem desnaturação. Entretanto, a temperaturas mais elevadas, os solventes orgânicos podem levar à desnaturação por romperem pontes de hidrogênio e interações apolares, importantes na manutenção da conformação proteica (LEHNINGER, ; NELSON, 2006).
Após o processo de precipitação é necessário fazer a dosagem da atividade enzimática para avaliar a integridade e onde se encontra a enzima de interesse, ou seja: no pellet, sobrenadante ou se a mesma não apresenta atividade enzimática por ter sido desnaturada. A concentração de atividade enzimática (U/mL) em uma amostra pode ser determinada a partir da velocidade da reação catalisada pela enzima em análise. 
A invertase ou sacarase é a enzima responsável pela liberação do resíduo L-D-fructofuranosidio não-redutor, a partir da molécula de dissacarídeo. O seu substrato preferencial é a sacarose, resultando na sua hidrólise uma molécula de glicose e outra de frutose (PESSOA, 2005). Esta enzima possui uma grande importância, visto que foi a primeira proteína a ser identificada como um biocatalisador. (BROWN, 1902).
A prática teve como objetivo a precipitação por solvente orgânico de proteínas provindas das soluções do rompimento celular da levedura Saccharomyces cerevisiae utilizando o moinho de bolas e da permeabilização no over nigth, utilizando como agente precipitante o etanol e a dosagem da atividade enzimática da invertase.
Procedimentos experimentais 
A realização da precipitação com solvente orgânico foi feita a partir do sobrenadante proveniente do rompimento celular da levedura Saccharomyces cerevisiae no moinho de bolas e da permeabilização no over nigth. Inicialmente foi retirado e transferido para um eppendorf 600µL do sobrenadante da permeabilização no over night e 100µL do sobrenadante do rompimento celular. 
Para se iniciar o procedimento de precipitação foi adicionado aos sobrenadantes etanol 29%(v/v). O volume de sobrenadante do rompimento era de 1,1mL, portanto, foi adicionado 0,319mL de etanol. O volume do sobrenadante da permeabilização era de 6,0 mL do qual foi adicionado 1,74mL de etanol. As soluções foram agitadas por imersão, seguida por um banho de gelo por 10 minutos. 
Após o banho as soluções foram centrifugadas a velocidade de 10700 rpm durante 7 minutos obtendo os pellets e os sobrenadantes. Os dois pellets foram ressuspendidos em tampão 50mM fosfato pH=7,0. 
Foi adicionado novamente etanol nos sobrenadantes, mas dessa vez 45%(v/v). Foi colocado no sobrenadante do rompimento um volume de etanol 0,16mL e no sobrenadante da permeabilização 1,2mL. Ambos foram agitados por imersão e levados ao banho de gelo ao qual permaneceram por 20 minutos e, posteriormente, foram centrifugados a velocidade de 10700 rpm durante 7 minutos. 
Como resultado da centrifugação foi obtido novamente o pellet e o sobrenadante das amostras originárias do rompimento e permeabilização. Os pellets foram ressuspendidos em tampão 50mM fosfato pH=7,0
Para a dosagem da atividade enzimática foram rotulados oito tubos de ensaio para as amostras do rompimento e da permeabilização (rompimento celular, pellet r1, sobrenadante r2 e pellet r2; permeabilização over night, pellet o1, sobrenadante o2 e pellet o2). Em cada tubo foi adicionado 125µL de sacarose 0,1M e 100µL de tampão acetato 100mM, pH 5,0. Os tubos foram homogeneizados e incubados durante 10 minutos a 30ºC.
Em cada tubo foi colocado uma amostra de 25 µL (rompimento celular, sobrenadante 2, permeabilização e sobrenadante o2). As amostras dos pellets do rompimento e da permeabilização foram diluídas 10 vezes com tampão acetato de sódio 100mM e adicionada a um volume de 25µL (2,5µL de amostra e 22,5µL de tampão) em cada tubo. 
Os tubos foram homogeneizados e incubados a 30ºC durante 30 minutos. Posteriormente foi adicionado 250µL do reagente DNS em cada tudo para a reação ocorrer e incubados durante 5 minutos a 100ºC.
Os tubos foram transferidos para um recipiente com água a temperatura ambiente para serem resfriados. Em seguida foi adicionado 2 mL de água destilada em cada tubo e agitados. Foi lido a absorbância a 540nm.
Resultados e Discussão 
Após a reação das amostras com o DNS foi percebido uma mudança de cor nos tubos contendo amostras do rompimento, da permeabilização e dos pellets 1 e 2 de ambos, essa mudança de cor prova que nesses tubos haviam enzima invertase. 
Com a precipitação realizada, foi esperado que a enzima de interesse estivesse na parte mais concentrada, ou seja, no pellet. Consequentemente, o pellet foi diluído 10 vezes, pois a sacarose adicionada poderia ser pequena para a quantidade de enzimas presentes na amostra fazendo com que a quantidade lida no espectrofotômetro não fosse verdadeira. Os resultados obtidos para a densidade ótica em 540nm está apresentado na tabela (1).
Tabela 1- Valores encontrados para a atividade enzimática, fator de purificação e OD 540nm para as amostras.
	Amostra
	OD 540nm
	Atividade enzimática
	Fator de purificação
	Rompimento
	1,677
	0,002451
	1
	Pellet r1
	0,125
	0,000183
	0,0745
	Sobrenadante r2
	0,191
	0,000279
	0,1139
	Pellet r2
	0,164
	0,000240
	0,0980
	Permeab. over night
	0,220
	0,000326
	1
	Pellet o1
	0,967
	0,001413
	0,5767
	Sobrenadante or2
	0,013
	0,000019
	0,0078
	Pellet o2
	0,118
	0,000172
	0,0704
O rendimento não pode ser calculado porque não se obteve a dosagem da proteína total na amostra, já que, é a partir dela e da atividade enzimática que se encontra a enzima total necessária para o cálculo do rendimento.
O fator de concentração foi calculado através do coeficiente angular da reta encontrada na dosagem da glicose, mostrada na figura (1). 
Figura 1- Curva da dosagem da Glicose.
Através da equação (1), foi calculado o fator para as amostras. O valor do coeficiente angular encontrado na reta da dosagem da glicose é 1,267, logo, foi realizado o cálculo encontrado na equação (2).
 (1)
 (2)
Para o cálculoda atividade enzimática das amostras foi utilizado a equação (3). Uma unidade (U) de atividade de invertase foi estabelecida como a quantidade de enzima capaz de liberar 1Pmol de grupos redutores, medidos como glicose, por minuto, nas condições de reação utilizadas.
 (3)
O cálculo realizado para o rompimento é encontrado na equação (4). Foi feito o mesmo para as demais amostras e os valores obtidos estão apresentados na tabela (1).
 (4)
Para o cálculo do fator de purificação foi utilizado a equação (5). Foi feito o cálculo apresentado na equação (6) para o pellet r1. Os demais valores obtidos para as amostras estão encontrados na tabela (1).
 (5)
 (6)
O fator de purificação não foi adequado, o melhor resultado foi o do pellet o1 com o fator de purificação de 0,5767, sendo este um valor baixo e isso pode ter sido consequência do processo de precipitação por solvente orgânico. De acordo com o experimento realizado por Novaki et.al a atividade enzimática da invertesse foi de 457,45 U, utilizando Aspargillur Niger como microorganismo produtor, tendo como meio de cultivo o farelo de soja em pH 4 a 30oC. Como observado na tabela 1, a atividade enzimática da amostra com maior recuperado proteico foi de 0,001413 U. É possível que a Sacharomyces Sereviseae tenha produzido um isômero de invertase instável. Em vista dos resultados, a troca do microorganismo é recomendável para a purificação de invertase ativa e aplicável.
O solvente escolhido foi o etanol devido ao tamanho da sua cadeia, polaridade e custos, porém, como a atividade enzimática foi baixa é possível que o solvente tenha desnaturado a proteína. Diversos são os fatores que levam a desnaturação como a interação entre a cadeia carbônica do etanol, que é apolar, com a porção hidrofóbica da superfície da proteína, por isso o volume adicionado na precipitação deve ser controlado, altas concentrações favorecem as interações. Além disso, o controle de temperatura é um fator crucial para a recuperação da enzima ativa, em baixas temperaturas as moléculas tendem a se juntar, pensando na estrutura tridimensional da proteína, isso diminui a fluidez da molécula impedindo a penetração do solvente. Pode ter ocorrido a penetração do etanol na estrutura terciária da proteína ainda um pouco fluida, pois a temperatura não foi baixa o suficiente para evitar esse processo, causando a desnaturação da invertase. 
Observando esses parâmetros, é possível concluir que o etanol é capaz de precipitar proteínas a baixas temperaturas, porém, como não se obteve uma atividade enzimática adequada o método desenvolvido não foi eficiente para a purificação da invertase ativa, por isso, todo o método deve ser reavaliado. Para melhor eficácia do método o experimento deve ser realizado a uma temperatura mais baixa, entretanto, isso pode até ser viável em bancadas, mas tem um aumento significativo nos custos em larga escala. O solvente orgânico mais utilizado é o etanol pois o tamanho da sua cadeia é ideal para evitar a penetração e interação com a proteína, portanto a utilização de outro solvente só é recomendada se possuir características semelhantes, um exemplo é a acetona que pode ser utilizada desde que não desnature a enzima. Caso essas alterações não sejam viáveis devido aos custos do processo e a baixa rentabilidade o melhor a se fazer é utilizar outra técnica de precipitação, por exemplo, precipitação por sais.
 Referências Bibliográficas
BELL, D. J., HOARE, M., DUNNILL, P. The formation of protein precipitates and their centrifugal recovery. Downstream Processing, Fiechter, A., Springer-Verlag, Berlin, p. 1-59, 2003.
BROWN, A.J. Enzyme action. Journal of Chemical Society, v. 81, p. 373-386, 1902.
LEHNINGER, A.L.; NELSON Fundamentos de Bioquímica. 4ª ed. São Paulo: Sarvier, 2006. 839p.
NOVAKI, LEXANDRA. Produção, purificação e caracterização parcial da invertase obtida por fermentação em estado sólido de soja com Aspergillus casiellus. Toledo, PR:, 2009. 56f. 
PESSOA JÚNIOR, A.; KILIKIAN, B. V. Purificação de produtos biotecnológicos. 1.ed. Barueri, São Paulo: Manole, 2005. 440 p.