Aula 3 Dosagem da atividade enzimática

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Dosagem da atividade enzimática
1 Rotular 5 tubos de ensaio um para cada amostra (rompimento celular, sobrenadante 1, pellet 1, sobrenadante 2, pellet 2).
2 A seguir, adicionar 125 µl de sacarose 0,1M em cada tubo,
3 Adicionar 100 µl de tampão acetato 100 mM, pH 5,0, homogeneizar,
4 Incubar durante 10 minutos a 30oC.
5 Adicionar 25 µl de amostra. Conforme tabela 1.
	Tubo
	Sacarose (µl)
	Tampão acetato (µl)
	
Incubar
10 min
30oC
	Amostra 
	Volume de amostra*
	1
	125
	100 
	
	Extrato celular
	
	2
	125
	100 
	
	Sobrenadante 1
	
	3
	125
	100 
	
	Pellet 1
	
	4
	125
	100 
	
	Sobrenadante 2
	
	5
	125
	100 
	
	Pellet 2
	
*você poderá diluir este volume! Recomenda-se que a diluição seja feita em tampão acetato de sódio
6 Homogeneizar e incubar a 30oC durante 30 minutos.
7 Para parar a reação, adicione 1mL do reagentes DNS
8 Incubar os tubos durante 5 minutos a 100oC.
9 Resfriar os tubos, transferindo-os para um recipiente com água a temperatura ambiente.
7. Adicionar 2 mL de água destilada, agitar
8 Ler a 540 nm.
9 Utilizar a equação 01 e 02 para calcular a atividade enzimática da invertase.
O coeficiente angular utilizado para o cálculo será obtido a partir da curva padrão de glicose!
	Amostra 
	Volume total
	OD 280 nm
	OD 540nm
	Atividade enzimática
	Fator de purificação 
	Extrato celular
	
	
	
	
	
	Sobrenadante 1
	
	
	
	
	
	Pellet 1
	
	
	
	
	
	Sobrenadante 2
	
	
	
	
	
	Pellet 2
	
	
	
	
	
Para discussão dos resultados:
O processo de precipitação com etanol foi eficiente? Justifique sua resposta.
Compare o resultado obtido pelo seu grupo com os resultados disponíveis na literatura.
Porque na tabela acima não foi calculado o rendimento? Justifique
Descreva três mudanças no processo de precipitação para torna-lo mais eficiente.