Relatório 1 Farmacognosia I Eugenol (1) (1) (1)

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUÍZ DE FORA CAMPUS AVANÇADO GOVERNADOR VALADARES
DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA
Disciplina: Farmacognosia I Prática
Professora: Dra. Ydia Mariele Valadares
Daniel Melo
Larissa Martins Duarte Andrade
	Rafael Noman de Castro	
ANÁLISE DA QUALIDADE DE DROGAS VEGETAIS
Governador Valadares
2017
SUMÁRIO
31.0. INTRODUÇÃO	
2.0. OBJETIVO	4
3.0. MATERIAIS E MÉTODOS	4
3.1. Materiais Utilizados	4
3.2. Reagentes Utilizados	4
4.0 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL_____________________________________ 5
5.0. RESULTADOS E DISCUSSÕES	6
6.0. CONCLUSÃO	10
7.0. REFERÊNCIAS	10
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1.0. INTRODUÇÃO
Eugenia caryophyllata, conhecida popularmente como cravo-da-índia, é extensamente usada na culinária como especiaria, principalmente os brotos secos de sua flor, nos quais pertence o cálice de uma pequena massa globulosa, denominada “cabeça do cravo”. Além de utilizado como tempero, os brotos do cravo-da-índia, juntamente com suas folhas e talos, são utilizados para extração do óleo do cravo, que assim como os brotos da flor, está inserido na medicina alternativa há muito tempo (RIGOTTI, 2012). 
Para uso terapêutico, técnicas como infusão, decocção, tinturas, extratos fluidos e óleos ou vinagres costumam ser usadas para melhor aproveitamento de sua constituição química. Seu óleo essencial é utilizado principalmente devido às propriedades do eugenol (70 a 95% da constituição do óleo), no entanto, o mesmo também é constituído por acetil-eugenol, cavicol, 4-alilfenol, cafeína, teofilina, teobromina, flavonoides, ésteres sesquiterpênicos, salicilato de metila, óxido de cariofileno, epóxido de humuleno, metil-amilacetona, álcool benzílico, furfurol, tanino, goma e cera (cariofilina) (GRANDI, 2014).
O eugenol apresenta baixa solubilidade em água e é totalmente solúvel em etanol, clorofórmio, gordura e éter. Apresenta ponto de fusão de -9ºC e de ebulição de 256ºC (AFFONSO, 2012). Possui consistência líquida e oleosa. (ALMEIDA, 2004).
	A extração do óleo essencial pode ser feita em solução etanóica a 80% sob constante agitação. Técnicas de destilação são também, comumente usadas na purificação. Ensaios de pureza podem ser realizados para garantir a qualidade do óleo extraído ou comprado. Os ensaios consistem em avaliar as características físicas da amostra, uma vez que substâncias puras possuem suas características definidas (SANTOS, 2014). A cromatografia, por exemplo, pode ser utilizada para avaliação e identificação de substâncias, utilizando princípios de solubilidade e polaridade da amostra.
	O eugenol é considerado um anestésico forte e substância antisséptica, bem como antiespasmódico, estimulante da mente e do corpo, analgésico, antibacteriano, antiflatulento. Possui fórmula molecular C10H12O2 (imagem 1), se apresenta como líquido claro incolor transparente, amarelo ou de cor âmbar, possui odor de cravo (GRANDI, 2014).
Imagem 1: Fórmula estrutural do Eugenol (PUBCHEM, 2016)
	O eugenol foi isolado pela primeira vez em 1929 e hoje é encontrado nas indústrias farmacêutica, alimentícia, cosmética, de perfumaria e até cigarros. Por possuir marcante efeito anestésico, é popular na odontologia, além do potencial contra dores de dente e uso junto ao óxido de zinco para formação de cimentos para cimentação, utilizado para tratamento dentário, sendo excelente contra microinfiltrações, considerado o menos irritante entre os materiais dentários e, além disso, funciona como proteção ao complexo dentinho-pulpar com presença de um anestésico na polpa, o eugenol. Em estudos in vitro, o eugenol revelou ser um agonista GABA, principal meio inibitório para dor, e antagonista ao glutamato. Seu efeito sobre tratamentos para problemas de origem microbiana também apresenta resultados satisfatórios em teste in vitro, bem como sua associação a alguns antifúngicos, como para o tratamento de Candida albicans (AZAMBUJA, 2016).
2.0. OBJETIVO:
Realizar ensaios de pureza e identificação em amostra de cravo e essência (óleo) de cravo.
3.0. MATERIAIS E MÉTODOS:
3.1 MATERIAIS ULTILIZADOS :
Proveta;
Pipeta 5 mL;
Pipeta de Pasteur de vidro;
Laminas pra observação no microscópio optico;
Microscópio óptico;
Tubos de ensaio;
Papel de filtro;
Becquer;
Bastão de Vidro;
Pinça.
3.2 REAGENTES UTILIZADOS :
Solução saturada de cloreto de sódio;
 Etanol;
 Cloreto férrico 10 % em etanol;
 Clorofórmio;
 Estufa (temperaturas superiores a 100 °C);
 Microscópio;
 Lâmpada com luz ultravioleta (254 nm) e câmara escura;
 Tesoura;
 Vanilina sulfúrica SR (Preparação: Dissolver 1 g de vanilina em 100 mL de
metanol. Adicionar 4 mL de ácido clorídrico e 5 mL de ácido sulfúrico);
 Hidróxido de potássio 5,5 M.
4.0 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL:
4.0.1 TESTE DE FALSIFICAÇÃO PELO ALCOOL (fração solúvel em água/alteração de volume de fase oleosa):
Primeiramente adicionou-se a uma proveta 2 mL de essência de eugenol e 2 ml de solução saturada do cloreto de sódio, logo após agitou-se a mistura e a deixou em repouso. Como os líquidos são imiscíveis, se separaram. A água possui densidade maior que a densidade do eugenol, essa ficou na parte inferior do recipiente e o óleo ficou sob a água, demonstrando visualmente a diferente de densidade entre os líquidos.
4.0.2 TESTE DE FALSIFICAÇÃO POR GORDURAS:
Gotejou três vezes pontos separados em um pedaço de papel de filtro a essência do cravo. Posteriormente, colocou-se o papel na estufa previamente aquecida a 100°C por 30 minutos. Após o tempo pré-determinado retirou-se o papel da estufa e observou-se que a gota da essência tinha evaporado por completo, sem deixa mancha translucida permanente. Assim pode-se concluir que a essência não estava contaminada.
4.0.3 TESTE PARA PROVA DE IDENTIFICAÇÃO:
 	Na parte inferior ao ovário do cravo da índia efetuou-se um corte transversal e colocou-o sobre uma lâmina de vidro. Em seguida adicionou sobre a lâmina de vidro hidróxido de potássio 5,5M, e após 5 minutos observou-se no microscópio óptico as células e poucos cristais de eugenol potássico aciculares. 
	Com a pressão da unha comprimiu-se o cravo da índia sobre um papel de filtro e observou se exultou um óleo amarelo e odor característico de eugenol.
4.0.4 TESTE EM EXTRATO ETANÓLICO DE CRAVO:
	Separou-se dez botões florais e os adicionou em um béquer contendo 5 ml de etanol. Após alguns minutos, tranferiu-se o extrato obtido pra dois tubos de ensaio. Ao primeiro tubo adicionou-se 2 gotas de cloreto férrico (FeCl3) 10% que apresentou uma coloração verde intensa. Ao segundo tubo, adicionou-se 10ml de hidróxido de potássio a 5,5M, que apresentou uma coloração amarelo turva.
4.0.5 IDENTIFICAÇÃO POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA PARA CRAVO DA ÍNDIA:
Com o auxílio de um capilar aplicou-se sobre uma placa cromatográfica pequenas 3 gotas de extrato etanólico de cravo da índia, 1 gota amostra comercial de eugenol e 1 gota da essência padrão. Tendo como fase estacionária sílica gel e a fase móvel o clorofómio. Depois da aplicação das amostras, essas foram colocadas em contato com o eluente em uma cuba. Logo após a eluição, essa placa foi submetida à secagem na estufa. Posteriormente foi observada na luz UV em que reconheceu o padrão das manchas formadas após a eluição. Seguidamente a placa foi nebulizada com solução de vanilina sulfúrica e submetida à temperatura de 100°C na estufa por aproximadamente 5 minutos.
5.0. RESULTADOS E DISCUSSÕES
ENSAIO DE PUREZA:
Pesquisa de falsificação para a essência (óleo) de cravo-da-índia:
- Falsificação pelo álcool (fração solúvel em água/alteração de volume de fase oleosa)
	Ambas as frações adicionadas 2ml de essência de cravo-da-índia e 2ml de solução saturada de NaCl permaneceram em igual volume ao inicial e imiscíveis.
	O presente ensaio tem como objetivo avaliar a presença de álcool como adulterantena essência de cravo-da-índia. Como já descrito, o óleo essencial de cravo, possui características lipossolúveis, não se dissolve em água, caracterizado assim como apolar (TRANCOSO, 2013). O álcool é uma estrutura polar devido às hidroxilas presentes, se misturado em óleo essencial de cravo, alteraria a característica apolar do óleo devido interações dipolo induzido-dipolo. O NaCl em meio aquoso é dissociado, formando íons, os íons são altamente polares devido a presença de cargas. Uma vez que a essência de cravo está adulterada com álcool ocorre uma homogeneização por parte do óleo na solução saturada de NaCl, diminuindo o volume do óleo e aumentando o meio aquoso, constatando assim a adulteração. O fenômeno da homogeneização do óleo na solução de NaCl é devido as interações que se formam, do tipo íon-dipolo, uma interação muito mais forte do que a formada pelo álcool e óleo.
	Sendo assim, foi constatado que no óleo essencial (padrão) utilizado no procedimento não havia a presença de algum adulterante alcoólico.
- Contaminação com outros óleos e gorduras
	Depois de retirado o papel de filtro com gotas de óleo essencial da estufa (30 minutos a 100ºC), foi constatado que a essência evaporou por completo, sem deixar mancha translúcida permanente.
	O eugenol possui ponto de fulgor de 104ºC (AZAMBUJA, 2017), ou seja, a menor temperatura de liberação de vapor da substância. Considerando a variação de temperatura da estufa e sua calibração é possível dizer que em 30 minutos o eugenol presente tenha sido evaporado, assim como o beta-cariofileno, os constituintes majoritários do óleo essencial. Caso ocorra uma contaminação com outros óleos e gorduras o papel apresentaria manchas características, o que não ocorreu.
REAÇÕES DE IDENTIFICAÇÃO:
- Provas de identificação do material vegetal (cravo-da-índia)
	Realizou a leitura da lâmina contendo amostra com o corte do cravo-da-índia. Pode-se observar, no microscópio, com dificuldade poucos cristais translúcidos possuindo formato de agulha do eugenol potássico.
	A reação do eugenol com KOH em meio alcoólico forma o isoeugenol, um isômero do eugenol.
Imagem 2: Reação do Eugenol e KOH	
O tratamento de óleos com bases fortes como hidróxido de sódio (NaOH) ou de potássio (KOH) faz com que eles sofram hidrólise (saponificação) para formar glicerol e sal de um ácido graxo de cadeia longa.
	Ao comprimir uma unidade de cravo-da-índia observou uma mancha de cor amarelo no papel de filtro e a mesma exalava odor característico do eugenol. Comprovando dessa forma que o material vegetal, cravo-da-índia, era utilizável para os testes.
A droga vegetal é constituída pelos botões florais dessecados. Contém, 	no mínimo, 15% de óleo essencial. O óleo essencial é constituído basicamente de, no mínimo, 75% de eugenol e de 5 a 12% de beta-cariofileno (AFFONSO, 2012). 
- Reações de identificação com FeCl3 e KOH para cravo-da-índia
	Este teste e usado para identificação de presença de fenóis em compostos pela observação do aumento da intensidade da cor.
No primeiro tubo de ensaio adicionou-se o extrato obtido mais duas gotas de cloreto férrico (FeCl3) 10% que apresentou uma coloração verde intensa. No segundo tubo, adicionou-se 10ml de hidróxido de potássio (KOH) a 5,5M, notou-se uma coloração amarelo turvo, tendo a formação de um precipitado.
Imagem 3: Reação do eugenol com cloreto férrico (FeCl3)
	A formação da turvação foi notada, assim como a mudança de cor mais intensa, então podemos dizer que a presença da estrutura fenólica do eugenol foi positiva (CEBRIAN, T. 2007).
- Identificação por cromatografia em camada delgada para cravo-da-índia
	A cromatografia em camada delgada (CCD) é uma técnica de adsorção líquido–sólido. Nesse caso, a separação se dá pela diferença de afinidade dos componentes de uma mistura pela fase estacionária.
	A sílica utilizada é importante para o mecanismo de adsorção, para o grupo polar dos compostos se ligarem a parte polar da sílica. Ela possui boa estabilidade térmica, não polui o produto estudado. 
	Um dos mais importantes aspectos da cromatografia é que em um dado sistema cromatográfico o movimento (relativo) de um composto em relação a frente do solvente é uma propriedade característica e reprodutível. No caso da CP e CCD este movimento é expresso pelo RF: relação de fluxo (rate factor): sendo a relação entre a distância percorrida simultaneamente da origem até o centro da mancha (ds) e o limite do eluente (frente do solvente)(de): (BRAIBANTE, 2012).
Rf = ds / de
	A cuba de vidro considerada como câmaras são usadas durante o processo da cromatografia, elas devem ser tampadas para permitir uma perfeita saturação do ambiente e assim ocorrer à separação dos componentes.
Segue abaixo o fator de retenção para todas as manchas identificadas no procedimento:
Rf extrato: 0,05
Rf essência (padrão): macha 1: 0,2 
Mancha 2: 0,33
Rf eugenol (comercial): 0,33
Imagem 4: Placas do ensaio de cromatografia em CCD
	O extrato apresentou apenas uma mancha pouco acima do ponto de aplicação da placa com rf de 0,05. A essência apresentou 2 manchas, com rf de 0,2 e 0,33. O eugenol comercial apresentou apena uma mancha com o rf de 0,33.
	É possível dizer que a segunda mancha da essência (padrão) é referente ao eugenol, uma vez que o eugenol (comercial) apresentou apenas uma mancha com o mesmo rf.
	O extrato não apresentou mancha referente ao eugenol ou qualquer outra substância de possível identificação com esse ensaio. A não presença do eugenol, possivelmente é devido ao pouco tempo de decantação dos cravos em etanol, o que não possibilitou uma extração completa. Porém os testes anteriores para reações de identificação com KOH e FeCl3 confirmaram a presença de eugenol no extrato. Assim, pode se dizer que a cromatografia apenas não foi sensível para o extrato nesse ensaio.
6.0. CONCLUSÃO:
	No final dos procedimentos realizados no laboratório e de acordo com os ensaios é possivel concluir que a amostra comercial de eugenol não possui adulteração ou contaminação com nenhuma outra substância química. Com isso os testes de análise da qualidade de drogas vegetais foram realizados com êxito, exceto a cromatografia em camada delgada, que não possibilitou uma confirmação mais precisa de presença do eugenol e identificação das amostras, mas os outros resultados permaceram válidos. 
7.0. REFERÊNCIAS
RIGOTTI, M. Plantas Medicinais Nativas e Exóticas. 2ª Edição. Botucatu-SP. Edição do autor. 2012.
GRANDI, T. S. M. Tratado das plantas medicinais: mineiras nativas e cultivadas.1ª Edição. Belo Horizonte: Adaequatio Estúdio, 2014.
PUBCHEM. Disponível em: <https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/3314#section=2D-Structure>.
AZAMBUJA, W. Óleos essenciais. Eugenol. Disponível em: <http://www.oleosessenciais.org/eugenol/>.
ALMEIDA, M.A. Efeitos do eugenol sobre o músculo liso traqueal de cobaio. Dissertação (Mestrado em Ciências Fisiológicas) – Centro de Ciências da Saúde, Universidade Estadual do Ceará. Fortaleza, 127p. 2004.
SANTOS, F.A. Extração, caracterização e aplicações do óleo essencial cravo-da-índia (Syzygium aromaticum). Monografia (Trabalho de Conclusão de Curso) - Processos Químicos, Faculdade de Pindamonhangaba 32p. São Paulo 2014.
TRANCOSO, M.D. Projeto Óleos Essenciais: extração, importância e aplicações no cotidiano. Revista Práxis: Rio de Janeiro, n. 9, p. 89-96, jun. 2013.
Raphael da S. Affonso; Magdalena N. Rennó; Gláucia B. C. A. Slana; 	Tanos C. C. Franca. Aspectos Químicos e Biológicos do Óleo Essencial 	de Cravo da Índia. Rev. Virtual Quim. 4 (2), 146-161; 2012.
BRAIBANTE, Mara. Química Analítica Qualitativa Experimental 2012 UFSM Disponível em: <http://w3.ufsm.br/laequi/wp-content/uploads/2012/07/Cromatografia.pdf>