022016 Exerccios tecnologia DNA recombinante Biomedicina 20170815110912

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	Professor(a):
	Letícia da C. Braga 
Exercícios de Fixação
Descreva as etapas básicas de uma experiência de clonagem de genes.
Descreva os papéis das endonucleases de restrição e das ligases na clonagem gênica.
Diferencie uma molécula de DNA com extremidades coesas e uma com extremidades de corte perpendicular.
Cite quatro características imprescindíveis aos vetores de clonagem. Justifique sua resposta. 
De que maneira o gene lacZ é utilizado em experimentos de clonagem gênica?
Descreva como é obtido um cDNA.
Diferencie uma biblioteca genômica de biblioteca de cDNA.
Descrevas as vantagens do uso dos vetores λ e YAC (cromossomos artificiais de levedura) na construção de uma biblioteca genômica.
Defina o processo de hibridização com sondas de ácidos nucléicos.
Explique como uma sequência de aminoácidos em uma proteína pode ser usada para criar uma sonda de hibridização para seu gene.
Um plasmídeo bacteriano circular (pBI12) com 5 Kb e dois genes para a seleção, kanR e lacZ, tem dois sítios de restrição para Eco RI, um sítio para Xba I e um único sítio de restrição da enzima Hind III no meio do gene de resistência a canamicina (kanR). O DNA presente nos oito cromossomos de Drosophyla melanogaster é digerido com uma enzima de restrição, e é feita uma biblioteca em pBI12.
Relacione um procedimento passo a passo para esta clonagem, incluindo a(s) enzima(s) e o meio de seleção usado para testar a eficiência desta clonagem.
Descreva a importância da presença de um único sítio de restrição de HindIII.
Classifique o tipo de biblioteca foi usada neste experimento.
Analise a frase abaixo e explique suas conclusões: Os plasmídeos só se duplicam quando o DNA genômico é duplicado
A figura apresenta um fragmento de DNA a ser analisado com enzimas de restrição. Faça uma simulação da ação das enzimas EcoRI (5’-GAATTC), AluI (5’-AGCT) e PstI (5’-CTGCAG). Para as enzimas que cortam o DNA, aponte o número de fragmentos produzidos.
 As enzimas BamHI e PstI cortam as respectivas sequências de restrição de acordo com a figura.
a. Indique as extremidades 3’ e 5’ das moléculas resultantes das duas digestões.
b. De que modo ficariam estas extremidades se procedesse a uma incubação com DNA polimerase na presença de dATP, dTTP, dCTP e dGTP?
c. Após esta reação que aconteceria se incubasse os fragmentos resultantes da digestão com BamHI com DNA ligase? E no caso da PstI?
d. A ligação destes fragmentos regeneraria os locais de restrição da BamHI e da PstI?
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Prof. Francisco Prosdocimi
> Sequência 1
GCCTTCAATGGCAAGCGGTCTGGAATCCTACTTCTTGAATCGGCACGGTGTCATTACGGGCGGGGGCCAG
AACAACGTCCCTGGACATCACACCTAGCCCGTGCGACGGCGGAAACCTTCGCCGGCGCAGGCTTCGACGT
GACCCTCATCGCGGAACCCTCCCCCACCCCAGTGTTGGCGTGGCTGGTGCGCTCACGGCGAATGGACGTG
GGCGTGCAGATCACCGCCTCGCACAATCGAATTCAGGACAACGGCTACAAGCTGTACCTGGACGGCGGCT
CTCAGCTGGTCTCCCCCGCCGACCGGCAGATCGAGGAGCACATTGCCGCCCAGCCAACTGACGCGGCGAA
GATCCCCCGCTCCGAGGCGAAGTCTGTAGACCTGTCCGTAGTCTCCGGCTATGTCACCGAGCTAAGTACC
CTGGTGGCCACCGGCCGCCAATCCGAGCTGGCGCCGCGGCGGAAGCTGAAGATCCTCTACACCCCCATGC
ACGGCGTGGGCGGCAATGCCCTGGAGTGGGCCTTACGTGAATTCGGCTTCGGCAACGTGCACGCGGTGGC
CTCGCAGCGCTGGCCGGACCCGACCTTCCCGACTGTGGACTTCCCCAACCCTGAGGAGCCGGGTGCCACC
GACGCGCTGCTGGAAGAAGCCCGCGCCATCGATGCGGACCTGCTGATCGCCCTGGATCCGGATGCGGACC
 
Suponha que a sequência acima tenha sido obtida de um extrato bacteriano. Uma vez conhecida a sequência deste gene, queremos agora cloná-lo em um vetor de clonagem. Para isso precisamos primeiro cortá-la com enzimas de restrição. Sabe-se que a enzima de restrição EcoRI corta um DNA fita dupla do seguinte modo e no seguinte sítio (veja figura). Responda:
 
a) Quantos sítios de restrição existem na nossa sequência? Sublinhe-os.
 
b) Esquematize um gel abaixo que apresente, na canaleta 1, um padrão de peso molecular onde as bandas representam sequências com 50bp, 80bp, 200bp e 1Kb. Suponha que seu DNA acima tenha sido digerido pela enzima EcoRI e represente, na canaleta 2, os fragmentos resultantes do corte (Dica: cada linha da sequência apresenta 70 bases).
 
c) Utilizaremos aqui um plasmídeo chamado pLADA contendo 900bp que apresenta um sítio para a enzima EcoRI dentro de seu sítio múltiplo de clonagem. O plasmídeo foi digerido com esta enzima de restrição e, assim, linearizado. Suponha que você tenha purificado do gel seu maior fragmento obtido na canaleta 2 e incubado este fragmento com o plasmídeo digerido, na presença de DNA ligase. Na canaleta 3, apresente as bandas resultantes deste experimento de ligação. Lembre-se que o plasmídeo pode ligar-se com ou sem o inserto. Explique porque as bandas têm o tamanho observado no gel.
_____________________________________________________________________________________
 
d) Invente uma enzima de restrição que corte num sítio diferente da EcoRI. Lembre-se que as enzimas de restrição cortam em sítios palindrômicos (idênticos nas duas fitas; GAATTC é GAATTC também na fita complementar-reversa). Apresente o sítio de corte de sua enzima, dê um nome para ela, corte o DNA da sequência 1 com esta enzima em pelo menos um sítio e apresente, na canaleta 4, os fragmentos gerados por este ensaio de digestão, com seus respectivos tamanhos.
Enzima:__________________
Sítio de corte: _______________________________
Número e tamanho dos fragmentos de restrição gerados_____________________________
Exercícios de Fixação 
Professora Cristina Aparecida de Souza
1.	As enzimas de restrição revolucionaram as técnicas de biologia molecular. Selecione a opção que descreve o modo de ação destas enzimas:		 
a)	Cortam o DNA doador levemente para remover as protuberancias.
b)	Cortam o DNA doador mas nao afetam o plasmídeo.
c)	Fazem cortes periódicos em sequencias específicas no DNA do doador e do plasmídeo
d)	São usada para introduzir os plasmídeos nas celulas bacterianas. 
2.	Geralmente as enzimas só atuam em sequência palindrômicas. Qual das seqüências abaixo é um palíndromo?
a)	5 'ACGGATTCGC 3'
b)	5 'ATG 3'
c)	5 'CCATT 3'
d)	5 'CCAGG 3'
e)	5 'AGGCCT 3'
3.	A enzima transcriptase reversa permite aos cientistas produzir que tipo de produto?
a)	As endonucleases de restrição
b)	Moléculas de cDNA
c)	Fragmentos de restrição Polimórficos
d)	Fragmentos de restrição ponta cega
e)	Transcritos de RNAm
4.	 Plasmídeos são pequenas moléculas de DNA dupla fita, contendo os elementos necessários para a sua replicação. Quando possuem as características adequadas são usados como veículos de clonagem de segmentos de DNA de interesse. Para a manipulação do vetor de clonagem e inserção do DNA exógeno, são necessárias técnicas que utilizem o corte com enzimas de restrição. Observe o mapa de restrição do plasmídeo YIP5. Este plasmídeo contém 5541 pb, e a enzima EcoRi corta no nucleotídeo número 1 ou 5541. Quais seriam o (s) tamanho (s) dos produtos gênicos se este plasmídeo for digerido com as seguintes enzimas de restrição:
a)	EcoRI + EagI
b)	HindIII + ApaI
c)	HindIII + ApaI + PvuI
5.	As enzimas de restrição do tipo II ou endonucleases de restrição, são enzimas especiais que cortam o DNA em locais específicos ao longo da molécula. Observe os sítios de restrição das enzimas EcoRI, HindIII, SmaI e analise a seqüência de DNA abaixo:
 
5´TAGACTGAATTCAAGTCAATACGCCCGGGTTCTAAACAGGATCGAAGCTTATGCCACACG 3´
3´ATCTGACTTAAGTTCAGTTATGCGGGCCCAAGATTTGTCCTAGCTTCGAATACGGTGTGC 5´
a)	Indique os sítios de restrição para as enzimas EcoRI, HindIII e SmaI. Representando na fita o local e a maneira do corte. 
b)	Represente no gel de agarose ao lado os produtos de digestão indicados em cada poço. Indique numericamente o tamanho de cada fragmento.
 
6.	Na tecnologia do DNA recombinante são utilizadas enzima bacterianas que tem a propriedade de cortar a molécula de DNA em pontos específicos, o que permite, por exemplo, que genes humanosque codificam proteínas de interesse médico ou comercial sejam extraídos, clonados em bactérias ou vírus, e depois sejam transferidos para animais de laboratório, que passam a produzir sistematicamente tais proteínas. 
a)	Qual é o nome que se dá a estas enzimas? 
b)	O que determina a especificidade destas enzimas? 
c)	Na natureza, qual deve ser o papel desempenhado por elas? 
d)	Qual é a ligação química rompida por estas enzimas?
7.	Para se criar uma molécula de DNA recombinante, um gene selecionado é removido a partir de um animal, planta ou microrganismo, e é inserido onde?
a)	Em uma biblioteca.
b)	Em um oligonucleotido.
c)	Em um palíndromo
d)	Em um vetor
e)	Em uma série de clonagem
15.	Uma biblioteca genômica é útil para obter:
a)	Revistas em pesquisa genômica
b)	Coleções de genes de um organismo.
c)	Informações instrutivas sobre como localizar o local exato do gene de interesse.
d)	As informações relativas aos primers e PCR.
e)	A estrutura e função de uma proteína isolada.
8.	Os primeiros passos para se construir um OGM (organismo geneticamente modificado) é a clonagem do gene de interesse. Para ser um bom vetor de clonagem, o vetor deve possuir algumas qualidades. Assinale qual das características abaixo NÃO faz parte destas características:
A) Eles devem possuir a sua própria origem de replicação.
B) Eles devem ser prontamente aceitos pelo hospedeiro de clonagem.
C) Devem ser facilmente manipulados.
D) Eles devem ser capazes de transportar uma parte significativa do DNA doador.
E) Eles devem ser resistentes à digestão para endonucleases de restrição.
9.	Após a inserção de um vetor de clonagem em uma célula hospedeira, porque elas precisam ser plaqueadas em meio seletivo, que normalmente contém um antibiótico?
a)	Porque todas as células hospedeiras são naturalmente resistentes ao antibiótico
b)	Porque todas as células hospedeiras são naturalmente sensíveis ao antibiótico
c)	Porque o processo físico de transformação faz com que as células do hospedeiro se tornem resistentes ao antibiótico.
d)	Porque apenas as células hospedeiras que foram transformadas pelo vetor vão crescer na presença do antibiótico.
e)	Porque e apenas as células hospedeiras que não foram transformadas pelo vetor vão crescer na presença do antibiótico.
10.	A utilização do gene Lac Z pode ser utilizado em vetores de clonagem para seleção das celulas transformadas. Na inativação por inserçao do gene Lac Z:
a)	Se o DNA exogeno é inserido, o marcador beta galactosidase é inativado, e as colonias permanecem brancas.
b)	Se o DNA exogeno é inserido, o marcador beta galactosidase é inativado, e as colonias permanecem se tornam azuis.
c)	Se o DNA exogeno é inserido, o marcador beta galactosidase é ativado, e as colonias permanecem brancas.
d)	Se o DNA exogeno é inserido, o marcador beta galactosidase é ativado, e as colonias permanecem se tornam azuis.
11.	Se células hospedeiras sensíveis a ampicilina são plaqueadas em meio contendo ampicilina após a transformação com vetores que possuem gene de Resistencia a este antibiótico:
a)	Somente células que não adquiriram o vetor resistente a ampicilina podem crescer.
b)	Somente células que adquiriram o vetor resistente a ampicilina podem crescer.
c)	Todas as células irão crescer.
d)	A ampicilina é inativada no meio. 
Padrão 
Eco RI
Eco RI + Hind III
70 pb
60 pb
 
50 pb
40 pb
30 pb
20 pb
10 pb