Enzimas Bioqúmica

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Enzimas
Introdução
	Um organismo deve ser capaz de catalisar reações químicas com eficiência e seletividade. As enzimas são as proteínas mais especializadas e têm um poder catalítico muito maior do que os catalisadores sintéticos ou inorgânicos. As enzimas tem quatro propriedades fundamentais: têm alto grau de especificidade para os seus substratos; aceleram as reações, atuam em condições suaves de temperatura e pH; e sua atividade pode ser regulada. Neste texto serão abordados os tópicos: propriedades das enzimas, como elas funcionam, princípios gerais da cinética enzimática, inibidores enzimáticos e por fim a regulação da atividade enzimática.
1. Propriedades e classificação
	A maioria da enzimas são proteínas, existindo um pequeno grupo de moléculas de RNA catalíticas e, por isso, a atividade catalítica depende da integridade das suas conformações nativas, ou seja, as estruturas proteicas, primária, secundária, terciária e quaternária das enzimas são essenciais para a atividade catalítica. Algumas enzimas precisam de um componente químico adicional denominado cofator, que pode ser um ou mais íons inorgânicos ou uma molécula orgânica ou metalorgânica, denominada coenzima. As coenzimas agem como carreadores transitórios de grupos funcionais específicos. Uma coenzima ou um íon metálico que se liga covalentemente a enzima é denominado grupo prostético. Holoenzima é uma enzima completa, cataliticamente ativa com sua coenzima e/ou íon e apoenzima é a parte proteica dessa enzima. Algumas proteínas também podem ser modificadas covalentemente por fosforilação, glicosilação, entre outros. Além disso, cada enzima tem um pH ótimo ou em certos casos, um intervalo de pH, no qual a atividade é máxima. As cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos do sítio ativo são essenciais para interação com o substrato e outros resíduos fora do sítio ativo também são importantes para a manutenção da conformação mais adequada para que ocorra a catálise enzimática.
	Todas as enzimas têm um número E. C. (Comissão Enzimática) e nomes formais que identificam a reação catalisada. Muitas enzimas também têm números comuns. As enzimas são classificadas segundo o tipo de reação que catalisam. Este sistema divide as enzimas em seis classes: oxirredutases, transferases, hidrolases, liases, isomerases e ligases; cada uma com subclasses. 
2. Mecanismo de ação
	As enzimas proporcionam um ambiente específico adequado para que uma dada reação possa ocorrer mais rapidamente. A propriedade característica das reações catalisadas por enzimas é que a reação ocorre confinada em um bolsão da enzima denominado sítio ativo. A molécula que se liga ao sítio ativo e sobre o qual a enzima age é denominada substrato. O contorno da superfície do sítio ativo é delimitado por resíduos de aminoácidos com grupos nas cadeias laterais que ligam o substrato e catalisam a sua transformação química. Frequentemente, o sítio ativo engloba o substrato, sequestrando-o completamente da solução. Uma reação enzimática simples pode ser descrita como:
Qualquer reação, como S P, pode ser descrita por um diagrama de coordenadas da reação. O eixo horizontal chamado de coordenada da reação reflete as mudanças químicas progressivas químicas à medida que S é convertido em P. O eixo vertical representa a variação de energia durante a reação. O ponto de partida tanto da reação direta quanto da reação reserva é denominado estado fundamental e corresponde a contribuição que uma molécula média (S ou P) fornece para a energia livre do sistema, sob dadas condições. O equilíbrio entre S e P reflete a diferença de energias livres dos seus estados fundamentais. Quando a energia livre do estado fundamental de P é menor do que a de S, o ∆G'° para a reação é negativa (reação exergônica) e o equilíbrio favorece mais P que S. Um equilíbrio favorável não significa que a conversão S-P ocorra em uma velocidade detectável. A velocidade da reação depende da barreira energética entre S e P que é denominada estado de transição. O estado de transição corresponde ao topo da curva com o mais alto valor de energia e é um ponto a partir do qual o decaimento para o estado S ou para o estado P tem a mesma probabilidade de ocorrer. A velocidade da reação depende da energia de ativação, que é a diferença entre o níveis energéticos no estado fundamental e do estado de transição, quanto maior a energia de ativação mais lenta é a reação. As enzimas aumentam a velocidade das reações diminuindo a energia de ativação e não afetam o equilíbrio da reação, mas a reação atinge o equilíbrio mais rapidamente quando a enzima apropriada estiver presente. Quando uma reação tem várias etapas, a velocidade final é determinada pela etapa (ou etapas) com maior energia de ativação e essa etapa é denominada etapa limitante da velocidade. 
O equilíbrio da reação está ligado à variação da energia livre padrão da reação (∆G'°), e a velocidade da reação está ligada à energia de ativação (∆G++). Um equilíbrio como S P é descrito por uma constante de equilíbrio (Keq) e Keq é dada pela razão [P]/[S]. Segundo a termodinâmica, a relação entre Keq e ∆G'° pode ser descrita pela expressão ∆G'°=-RT ln Keq. Essa relação demonstra que a constante de equilíbrio é diretamente relacionada com o total da energia livre padrão da reação. Quanto maior o valor da constante de equilíbrio da reação, mais exergônica (energia livre negativa) e favorável a reação será. Isso não significa que ela ocorrerá com uma velocidade alta. Para saber se a velocidade da reação tem que se conhecer a energia de ativação. A velocidade de uma reação é determinada pela concentração dos reagentes e por uma constante de velocidade (k), segundo a equação V=k[S]. A expressão k=(kT/h)e∆G++/RT derivada a partir da teoria do estado de transição mostra que a relação entre a constante de velocidade k e energia de ativação é inversa e exponencial, assim quanto mais baixa for a energia de ativação mais rápida é a velocidade da reação. 
As enzimas são catalisadores que promovem um aumento da velocidade e são altamente específicas para seus substratos. Existem duas fontes de energia para a grande diminuição nas energias de ativação e especificidade das reações catalisadas por enzimas.
A primeira fonte fundamenta-se em interações não covalentes entre enzima e substrato. Muito da energia necessária para diminuir a energia de ativação provém de interações fracas não covalentes entre substrato e enzima. O que distingue uma enzima de outros catalisadores é a formação de um complexo ES específico. A formação de cada interação fraca no complexo ES é acompanhada pela liberação de uma pequena quantidade de energia livre que estabiliza a interação. A energia proveniente da interação enzima-substrato é denominada energia de ligação, ∆GB. A energia de ligação é a principal fonte de energia livre utilizada pelas enzimas para a diminuição da energia de ativação das reações. Essa energia de ligação contribui tanto para a especificidade como também para a catálise. As interações fracas são otimizadas no estado de transição da reação e esse "pagamento de energia" traduz-se em diminuição efetiva da energia de ativação. 
Os sítios ativos das enzimas são complementares não aos substratos por si mesmos, mas aos estados de transição pelos quais os substratos passam ao serem convertidos em produtos durante a reação enzimática. A especificidade deriva da formação de muitas interações fracas entre a enzima e a molécula específica do substrato. A energia de ligação diminui a energia de ativação e garante especificidade pois proporciona que quatro barreiras físicas e termodinâmicas sejam superadas:
a) Entropia, liberdade de movimento que reduz da possibilidade de um encontro entre as moléculas; as enzimas reduzem a entropia, mantendo o substrato na orientação adequada para que possa reagir. 
b) Solvatação: a água ajuda a estabilizar a molécula de substrato e isso impede que estas moléculas reajam; as enzimas promovem a dessolvatação do substrato, pois ocorre substituição das interaçõeságua-substrato por enzima-substrato.
c) Distorção dos substratos; as enzimas ajudam a compensar termodinamicamente qualquer distorção, principalmente a redistribuição de elétrons, de modo que o substrato pode sofrer a reação. 
d) Necessidade de alinhamento apropriado dos grupos funcionais catalíticos da enzima; a enzima também sofre uma mudança de conformação quando o substrato se liga a ela (ajuste induzido), induzindo múltiplas interações fracas com o substrato.
A segunda fonte baseia-se no rearranjo de ligações covalentes durante a reação catalisada pela enzima. As interações covalentes entre enzimas e substratos ocorrem de forma transitória e diminuem a energia de ativação, acelerando a reação à medida que fornecem condições para que a reação ocorra por uma via alternativa de baixa energia. A catálise também pode envolver a transferência de grupo da enzima ou para a enzima, de modo a proporcionar um caminho novo e com menor energia de ativação para a reação. Uma vez que o substrato esteja ligado a uma enzima, grupos funcionais catalíticos posicionados de modo apropriado ajudam no rompimento e na formação de ligações por vários mecanismos, incluindo catálise geral acidobásica (transferência de prótons), catálise covalente e catálise por íons metálicos. 
3. Cinética enzimática
Uma das abordagens para entender o mecanismo das enzimas é determinar a velocidade da reação e como ela se modifica em respostas a mudanças nos parâmetros experimentais. A velocidade de uma reação catalisada por enzimas depende da concentração do substrato. Entretanto, o estudo dos efeitos da concentração do substrato é complicado, uma vez que a [S] modifica-se durante o curso de uma reação à medida que o substrato é convertido em produto. Uma abordagem para simplificar este problema é medir a velocidade inicial (v0), que corresponde a um consumo de até 10% da concentração de substrato inicial. Dessa forma, a [S] pode ser considerada constante. O efeito da variação de [S] sobre v0 quando a concentração da enzima é mantida constante está mostrada no esquema a seguir. Em concentrações relativamente baixas de substratos, v0 aumenta quase linearmente com o aumento de [S]. Em altas concentrações de substrato, v0 aumenta em pequenas quantidades em resposta ao aumento da [S]. Finalmente, é atingindo um ponto além do qual a aumento de [S] leva a um aumento insignificante pequeno em v0. Essa região de v0 tipo platô está próxima à velocidade máxima, Vmáx ou velocidade limite. A velocidade máxima também é definida como [ET] multiplicada pelo kcat. Michaelis e Menten postularam que a enzima primeiramente se liga de modo reversível com o substrato, formando um complexo enzima-substrato em uma etapa reversível e relativamente rápida. Então o complexo ES é rompido em uma segunda etapa mais lenta, fornecendo a enzima livre e o produto.
A segunda reação por ser mais lenta limita a velocidade da reação total e assim a velocidade deve ser proporcional à concentração das espécies que reagem na segunda etapa, isto é, ES. A enzima pode existir sob duas formas: na forma livre E e na forma combinada com o substrato ES. Em baixa [S], a maior parte da enzima está na forma não combinada E e a velocidade é proporcional à [S] porque o equilíbrio é deslocado na direção de formação de mais ES à medida que [S] aumenta. A velocidade inicial máxima (Vmax) ocorre quando quase toda a enzima estiver presente como complexo ES e a [E] é desprezível. Nessas condições, a enzima está saturada com o substrato, e então um aumento de [S] não produz efeito na velocidade.
Logo que a enzima é misturada com um grande excesso de substrato, há um período inicial, o estado pré-estacionário, durante o qual a concentração de ES aumenta. Esse período é muito curto para ser observado com facilidade. Durante o estado pré-estacionário, as velocidades de muitas das etapas da reação podem ser medidas independentemente e também podem ser observados os eventos que uma única molécula de substrato sofre durante a reação. Experimentos neste estado necessitam de técnicas especiais para fazer misturas e obter amostras muito rapidamente. 
Após este estado, a reação rapidamente atinge o estado estacionário no qual [ES] permanece constante ao longo do tempo. A curva que expressa a relação entre [S] e v0 tem a mesma forma geral para a maioria das enzimas e pode ser expressa algebricamente pela equação de Michaelis-Menten. 
Esta equação define a relação quantitativa entre a velocidade inicial, a velocidade máxima, e a concentração inicial do substrato, todas em relação à constante de Michaelis, KM. KM equivale à concentração do substrato na qual v0 é metade de Vmax. A equação de Michaelis-Menten pode ser transformada algebricamente em versões úteis para a determinação prática de KM e Vmax. Uma transformação comum é deduzida tomando as recíprocas dos dois lados da equação de Michaelis-Mentel. Essa forma é denominada equação de Lineweaver-Burk e o gráfico 1/v0 versus 1/[S] produz uma linha reta. A equação descreve o comportamento cinético da grande maioria das enzimas, sendo que todas as enzimas que exibem uma dependência hiperbólica de v0 sobre [S] são consideradas seguindo a cinética de Michaelis-Mentel. Muitas das enzimas que seguem a cinética de Michaelis-Menten não depende do mecanismo de reação simples de duas etapas, e mesmo enzimas que catalisam reações com seis ou oito etapas identificáveis apresentam o mesmo comportamento cinético do estado estacionário. KM é usado como indicador da afinidade da enzima pelo substrato, quanto menor o valor de KM, maior será afinidade. Também existe o kcat, que descreve a etapa limitante de qualquer reação catalisada por enzimas na saturação. É a constante de primeira ordem da velocidade, tendo como unidade a recíproca do tempo. Ela também é chamada de número de renovação, sendo, quando a enzima estiver saturada pelo substrato, equivalente ao número de moléculas de substrato convertidas em produto por unidade de tempo por uma única enzima. Os parâmetros cinéticos kcat e KM são úteis para estudar e comparar enzimas diferentes, independentemente se os mecanismos de reação são simples ou complexos. Cada enzima tem valores de kcat e KM que refletem o ambiente celular, a concentração de substrato normalmente encontrada pela enzima e a cinética química da reação catalisada. A melhor maneira de comparar as eficiências catalíticas de enzimas diferentes é comparar a relação kcat/KM (constante de especificidade) para as duas reações. Existe um limite superior para kcat/KM, imposto pela velocidade com que E e S podem se difundir em soluções aquosas. O limite determinado pela difusão é de 108 a 109 M-1 s-1 e enzimas que têm valores próximos a essa faixa atingiram a perfeição catalítica. 
Muitas enzimas catalisam reações com dois ou mais substratos. A equação de Michaelis-Menten também é aplicável a reações de bissubstrato, nas quais ocorrem etapas com um complexo ternário, ou pingue-pongue (deslocamento duplo). Cada enzima também tem um pH ótimo (ou um intervalo de pH), no qual a atividade é máxima. A faixa de pH na qual a enzima sofre uma mudança na atividade pode fornecer informações para o tipo de aminoácido envolvido no sítio de ativação. Entretanto, deve se tomar cuidado porque os valores de pKa da cadeia lateral das proteínas podem estar alterados de modo significativo no ambiente proteico. 
4. Inibidores enzimáticos
Inibidores enzimáticos são moléculas que interferem com a catálise, diminuindo ou interrompendo as reações enzimáticas. Existem duas classes de inibidores de enzimas: reversíveis e irreversíveis. A inibição reversível de uma enzima pode ser competitiva, incompetitiva ou não competitiva. Inibidores competiticos competem com o substrato para se ligarem ao sítio ativo, formando um complexo EI, mas não são transformados pela enzima. Dessa forma o inibidor competitivo altera a afinidade da enzima pelo substrato, sendo denominado KM aparente, a afinidade da enzima pelo substrato na presença do inibidor. Inibidores incompetitivos ligam-seapenas ao complexo ES, em um sítio diferente do sítio ativo, formando o complexo ESI e diminuem tanto o valor de Vmax quanto de KM. Inibidores não competitivos ligam-se tanto a E quanto ES, em um sítio distinto do sítio ativo, formando os complexos ESI e EI e diminuindo a velocidade máxima da reação. Na inibição irreversível, o inibidor liga-se permanentemente ao sítio ativo pela formação de uma ligação covalente ou por uma interação não covalente muito estável, neste caso, a molécula de inibidor é análoga ao estado de transição, encaixando-se melhor que o substrato no sítio ativo. Existem também os inibidores suicidas ou inativadores com base no mecanismo, que são compostos que são transformados em um produto que é convertido em composto reativo e que se liga irreversivelmente à enzima. 
5. Regulação enzimática
A atividade das enzimas tem com frequência de ser regulada de modo que elas funcionem em tempo e local adequados e são moduladas de várias maneiras:
a) Regulação alostérica: mudanças conformacionais induzidas por um ou mais moduladores interconvertem formas mais ativas (geralmente denominada de estado R) e menos ativas (estado T) da enzima. Esses moduladores podem ser estimulatórios ou inibitórios e, podem ser o próprio substrato e a enzima é denominada homotrópica ou uma molécula diferente, a enzima é heterotrópica. Os moduladores negativos não podem ser confundidos com inibidores não-competitivos ou incompetitivos, pois embora ao inibidores também se liguem a um segundo sítio da enzima, eles necessariamente não são mediadores de mudanças conformacionais entre formas ativas e inativas da enzima, de modo que os efeitos cinéticos são distintos. Enzimas alostéricas tem propriedades cinéticas e estruturais distintas da demais enzimas. Do ponto de vista estrutural, elas têm um ou mais sítios regulatórios onde o modulador se liga de forma específica e a maioria são maiores e possuem duas ou mais subunidades. A conversão das formas T e R podem ocorrer segundo dois modelos. No modelo tudo ou nada, toda a enzima é convertida de T para R, afetando igualmente todos os centros catalíticos. Isto ocorre porque existe um equilíbrio entre as formas T e R, e a posição do equilíbrio irá depender do número de centro ativos que são ocupados pelo substrato. O segundo modelo, modelo sequencial, supõe que a união do ligante em um sítio de ligação possa afetar os sítios vizinhos sem fazer com que todas as subunidades façam a transição de T para R. O comportamento cinético das enzimas alostéricas desvia-se do modelo de Michaelis-Menten, isto é, a relação entre v0 e [S] são diferentes da observada na cinética michaeliana. Muitas enzimas alostéricas apresentam um gráfico de v0 versus [S] que produz uma curva de saturação sigmoide em vez da curva de saturação hiperbólica. O comportamento sigmoide em geral reflete interações cooperativas entre as subunidades proteicas, isto é, mudanças estruturais em uma subunidade são convertidas em mudanças estruturais nas subunidades adjacentes, efeito mediado por interações não covalentes na interface das subunidades. Os efeitos sobre os parâmetros são mais complexo e requerem um exame mais detalhado. Por ora, de uma forma resumida embora o KM continue sendo a concentração de substrato que produz metade da velocidade máxima, tal constante é denominada K0.5. O efeito de um ativador alostérico diminui o K0.5 de enzima, aumentando a afinidade da enzima. Por outro lado um inibidor alostérico torna mais difícil para o substrato ou os ativadores converterem subunidades para a confirmação mais ativa, e assim, o inibidores alostéricos em geral deslocam a curva para a direita, aumentando apenas o valor de K0.5 ou juntamente com este aumento há uma diminuição na Vmax. 
b) Modificação covalente: algumas enzimas sofrem mudança conformacional e tem atividade modulada por modificações covalentes em um ou mais dos resíduos de aminoácidos da molécula da enzima. Estas modificações incluem mais de 500 tipos, sendo os principais grupos modificadores: fosforil, acetil, adenil, uridil, metil, amida, carboxil, miristoíl, palmitoíl, prenil, hidroxila, sulftato e ribosiladenosina-difosfato. A maioria das modificações covalentes é reversível, entretanto, algumas proteínas ligadas a grupos lipídicos são modificadas de forma irreversível. A fosforilação é o tipo de modificação mais comum. Estima-se que um terço de todas as proteínas de uma célula seja fosforilado. A ligação de grupos fosforil provindo de um nucleotídeo trifosfato a resíduos de serina, treonina, tirosina ou ocasionalmente histidina da proteína alvo é catalisada por proteínas quinases, e a remoção dos mesmos por proteína-fosfatases. A fosforilação geralmente provoca uma mudança a nível de estruturas secundárias, terciárias e quaternárias e portanto altera a atividade catalítica. Outra maneira que a fosforilação pode afetar a catálise é alterando a afinidade pelo substrato. 
c) Ativação por clivagem proteolítica específica: algumas enzimas são inativas até serem ativadas por clivagem de uma ou mais ligações peptídicas específicas. O precursor inativo é chamado de zimogênio ou proenzima. Não é necessária uma fonte de energia, tal como o ATP, para a clivagem. A ativação proteolítica é irreversível. As enzimas digestivas (quimiotripsna e tripsina) que hidrolisam proteínas são sintetizadas como zimogênios no estômago e no pâncreas. A coagulação do sangue é feita por uma cascata de ativações proteolíticas que assegura uma rápida e amplificada resposta ao trauma.
d) Isoenzimas: são enzimas que diferem na sequência de aminoácidos, embora catalisem a mesma reação. Geralmente, estas enzimas exibem parâmetros cinéticos diferentes, tais como KM, ou respondem a diferentes moléculas reguladoras. Elas são codificadas por diferentes genes, que surgem por duplicação e divergência de genes. A existência de isoenzimas permite o ajuste fino do metabolismo por satisfazer as necessidades particulares de um dado tecido ou estágio de desenvolvimento. 
e) Regulação por alterações na quantidade de enzima: os tecidos continuamente ajustam a velocidade na qual diferentes proteínas são sintetizadas para variar a quantidade de diferentes enzimas presentes. A expressão para a velocidade máxima na equação de Michaelis e Mentel incorpora o conceito de que a velocidade da reação é proporcional à quantidade de enzima presente. Assim, a capacidade máxima de um tecido pode mudar com o aumento da síntese proteica ou com o aumento da degradação proteica.
f) Inibição por retroalimentação: existem muitos produtos finais que controlam sua própria síntese, inibindo por retroalimentação uma enzima biossintética inicial.
g) Compartimentalização: a existência de organelas propicia uma forma adicional de controle enzimático. Uma enzima pode ser expressa em dois compartimentos celulares diferentes e ser deslocada de um para o outro. As organelas também proveem microambientes diferenciados nos quais as concentrações de substratos ou efetuadores alostéricos pode ser mais estritamente reguladas, por meio do controle de suas transferências através de membranas. 
As enzimas em pontos de cruzamento importantes de vias metabólicas podem ser reguladas por combinações complexas de efetores, permitindo a coordenação das atividades de vias interconectadas. 
Conclusão
	As enzimas são moléculas que aumentam a velocidade das reações, sem alterar o equilíbrio, mas sim diminuindo a energia de ativação e apresentam especificidade pelo substrato. Várias enzimas seguem o comportamento da equação de Michaelis-Menten que permite determina o Km e o Vmax. O KM e o kcat são constantes úteis para a caracterização e comparação das enzimas, além do que, a relação entre elas é um indicativo da eficiência catalítica. As enzimas podem sofrer o efeito de diferentes inibidores, que são importantes no desenvolvimento de fármacos e também na descoberta do mecanismo de catálise de algumas enzimas. Por fim, as enzimas podem ser reguladas de diversas formas, a fim de garantir a homeostase celular.