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estrategias de purificacao e analises protenas

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Fundamentos de Proteínas
Aula 3 – Estratégias de Purificação e 
Análises de Proteínas
BCM13042
Principais componentes moleculares da bactéria Principais componentes moleculares da bactéria E. coliE. coli
Componentes Nº de moléculas diferentes Componentes Nº de moléculas diferentes % peso total% peso total
H2O 1 70
Proteínas 3.000 15
Ac. Nucléico 1 - DNA e 1000-RNA 7
Carbohidratos 50 3
Lipídeos 40 2
Outros Íons - 12 3
 Mol. Monoméricas - 500
O isolamento ou purificação de uma proteína é uma etapa que precede 
os estudos de suas características físico-químicas, de sua estrutura 3D 
e a compreensão de suas propriedades biológicas. 
Inicialmente, a estratégia de purificação de uma proteína é empírica, ou 
seja, baseada em tentativa-erro, e deve ser desenhada para cada 
proteína individualmente. Não há como prever quais métodos serão os 
mais eficientes para se purificar uma proteína pela primeira vez.
 Métodos baseados em características físico-químicas das biomoléculas:
1. Tamanho – Massa – Densidade (ex: centrifuação, diálise, gel-filtração)
 2. Carga elétrica (ex: cromatografia de troca iônica, eletroforese)
 3. Solubilidade ou hidrofobicidade (ex: cromatografia em papel, fase reversa) 
 Métodos baseados em afinidade biológica, que exploram a interação entre duas 
 moléculas:
 
 4. Cromatografia de afinidade (pressupõe que uma das moléculas do par que 
 interage é um “reagente” de fácil obtenção, disponível comercialmente)
 
Métodos de Isolamento de BiomoléculasMétodos de Isolamento de Biomoléculas
Existe uma grande variedade de métodos visando a separação de biomoléculas. 
Como na maioria das vezes o que se pretende purificar é uma proteína, o grupo 
de moléculas com maior diversidade, as metodologias de separação de proteínas 
tiveram um grande desenvolvimento, com muitas opções disponíveis.
Os métodos de separação de biomoléculas são agrupados em duas categorias:
ORGANELAS
LisossomosLisossomos
MitocôndriaMitocôndria
GolgiGolgi
NúcleoNúcleo
SOBRENADANTE
F 1 F 2 F 3 F 4
F 2 .1 F 2 .2 F 2 .3
F 2 .3.1 F 2 .3.2 . . . . . . F 2. 3.N
Precipitação com Sal/Solvente
Precipitação com Sal/Solvente
Cromatograf ia Troca Iônica
Cromatograf ia Troca Iônica
(pH ou resina diferente)
F 2 .3.N.X
 
1 Proteína apenas
 (0.001g) - 0.1 a 0.5% total
Gel Filt ração
MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g) 
O fluxograma ao lado representa a 
“marcha” de purificação de uma proteína, 
mostrando as etapas sucessivas, cada 
uma consistindo de método, que levam ao 
isolamento de uma proteína presente 
numa mistura complexa.
Observe a quantidade de proteínas 
(100g) presente no material inicial e 
quanto da proteína purificada se obtém no 
final (0,001g). Esses números são típicos 
para a purificação da maioria das 
proteínas, em especial enzimas. 
Em cada etapa, a proteína de interesse é 
separada das demais com base em uma 
propriedade diferente. Consequente-
mente, as proteínas ainda misturadas com 
aquela que está sendo isolada são cada 
vez mais semelhantes em suas 
características físico-químicas, exigindo 
métodos cada mais sensíveis, capazes 
de explorar pequenas diferenças, para se 
chegar à proteína pura. 
• Medida da atividade biológica
 - particular para cada proteína
 - deve ser quantitativa, para estimar quanto 
da proteína de interesse há em cada fração.
• Medidas do conteúdo proteico (diversos)
 - absorbância de luz UV de 280 nm
 - métodos colorimétricos 
 (ex: Lowry, Bradford, BCA, etc)
Além dos métodos de purificação, análises 
complementares devem ser feitas ao longo da 
purificação, para verificar se o processo de 
separação está sendo eficiente.
A medida da atividade biológica da proteína 
de interesse e do conteúdo de proteínas de 
cada fração resultante do processo de 
separação devem ser feitas a cada passo. 
Assim, apenas a fração que contém a 
proteína de interesse, marcada com um 
círculo vermelho no fluxograma, é submetida 
à próxima etapa de purificação.
ORGANELAS
LisossomosLisossomos
MitocôndriaMitocôndria
GolgiGolgi
NúcleoNúcleo
SOBRENADANTE
F 1 F 2 F 3 F 4
F 2 .1 F 2 .2 F 2 .3
F 2 .3.1 F 2 .3.2 . . . . . . F 2. 3.N
Precipitação com Sal/Solvente
Precipitação com Sal/Solvente
Cromatograf ia Troca Iônica
Cromatograf ia Troca Iônica
(pH ou resina diferente)
F 2 .3.N.X
 
1 Proteína apenas
 (0.001g) - 0.1 a 0.5% total
Gel Filt ração
MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g) 
Métodos para medida do conteúdo de proteína:
A absorbância de uma solução de proteínas a 280 nm é diretamente proporcional ao seu conteúdo 
proteico, desde que essas contenham esses aminoácidos aromáticos na sua composição, 
especialmente triptofano. 
A vantagem desse método é que ele não é destrutivo para a proteína. Em geral, considera-se que uma 
leitura de 1,0 A280 equivale a uma concentração de 1 mg/mL.
Ácidos nucleicos também absorvem luz UV – máxomo 260 nm. Proteína: razão A280/A260 > 1
Comprimento de onda
Ab
so
rt
iv
id
ad
e 
m
ol
ar
, ε
BCA = ácido 2,2'-Bicinchonínico ou 
4,4'-Dicarboxy-2,2'-biquinoline
Reagente Bradford 
= Coomassie 
Brilliant Blue G-250
 Método baseado em uma mudança espectral do 
reagente, em que dá absorção máxinma a 595 nm (cor 
azul), quando interage com proteínas.
 Interação com proteínas se dá através de 
forças de Van der Waals e ligações iônicas, 
especialmente com arginina, mas também com 
resíduos de histidina, lisina, tirosina, triptofano e 
fenlialanina.
Ìons Cu2+ reduzidos a Cu+ em presença de 
proteínas reagem fortemente com o BCA 
formando um composto azul, 
Reagente de Biureto: sulfato de Cu2+ em tartarato 
 Cu2+ reage com as ligações peptídicas e produz um 
complexo púrpura com absorção máxima em 540 nm 
 
1. Cu2+ é chelado pela proteína
 [Cu2+-proteina]
2. Reação redox 
 Cu2+ + (ligações peptídicas) —> [Cu+ -proteína] 
Ìons Cu2+ reduzidos a Cu+ em presença de 
proteínas e cadeias laterais de aminoácidos 
aromáticos, Tyr e Trp, e de Cys, reduzem o 
reagente de Folin-Ciocalteu (ácido fosfo- 
mobidênio-tungstênio), dando um composto 
de cor azul.
Método de Lowry
Métodos para medida do conteúdo de proteína:
Para iniciar a purificação, inicialmente é necessário extrair a proteína de interesse 
para um meio líquido, exceto se ela já estiver naturalmente presente em um meio 
líquido (sangue, suor, água do mar, meio de cultura, seiva de planta, etc). 
 
tecidos
células
Homogeneização 
(para romper tecidos e células)
por pressão
(prensa francesa)
liquefação
(Potter)
Homogenado
ou
Extrato bruto
Material 
de 
partida
Material na 
fonte
por ultra-som com
detergente
Vários métodos são 
possíveis para transformar 
células, órgãos, tecidos em 
um homogenado, ou extrato 
bruto, como mostra a figura.
Sendo a proteína de interesse 
uma proteína de membrana, é 
necessário solubilizá-la. Para 
esse fim são utilizados 
detergentes, que dissolvem a 
membrana plasmática e 
formando complexos solúveis 
com as proteínas.
Proteínas 
integrais da 
membrana
detergente micelas
Complexos 
não micelares
Dependendo da concentração
Detergentes podem ser 
iônicos e nãoiônicos
Detergentes 
não iônicos
Triton X-100
(polyoxyethylene (9,5) p-t-octylphenol)
SDS
Dodecil sulfato de 
sódio
Cetab
Cetyltrimethylammonium 
bromide
Deoxicolato de sódio
Detergentes iônicos
Octilglicosídeo
(octyl-b-D-glucopyranoside)
sangue centrifugado: separação de plasma e células
 A centrifugação frequentemente é uma das primeiras 
etapas de purificação aplicado a um extrato bruto. Através 
do movimento de rotação do rotor da centrífuga, uma força 
centrífuga é aplicada à amostra, separando seus compo-
nentes através de suas massas e/ou densidade, conforme 
a técnica. 
 Através de sucessivas etapas de centrifução com 
velocidades (rotações por minuto, rpm) crescentes, pode-
se obter diferentes frações de um homogenado de células 
ou tecidos.
centrifugação diferencial
homogenado
células intactas
pedaços de membrana
núcleos
mitocôndrias
lisossomos
ribossomos
fração
citoplasmática
A centrífuga
Câmara blindada Amostra sedimentando
refrigeração vácuo
rotor
ângulo
fixo
R$ 3.000 US$ 70,000
Centrífuga
Clínica
Ultracentrífuga
Força centrífuga
1,200g por 15 minutos 
separa plasma de 
células sanguíneas
200,000 g por 24 
horas para separar 
organelas menores 
ou complexos 
proteicos
(necessitam vácuo 
para evitar atrito do ar, 
além de refrigeração)
Relação entre o raio do rotor, velocidade angular (rpm) e a força centrífuga (g)
Preço aproximado
Existem centrífugas para diferentes tipos de aplicações, 
dependendo da força centrífuga que são capazes de gerar.
Centrifugação em gradiente de densidade
Solucões de sacarose com 
densidades diferentss são 
colocadas no tubo, uma 
sobre a outra Amostra é colocada no 
topo do gradiente
5% sacarose
20% sacarose
centrifugação
Baixa densidade
Média densidade
Alta densidade
A centrifugação em um 
meio com gradiente de 
densidade melhora a 
eficiência da separação. As 
partículas se deslocarão 
através do gradiente até 
encontrarem uma região 
com densidade equivalente 
a sua, quando param de se 
mover, formando “bandas”.
Gradientes podem ser 
utilizados para separar 
diferentes tipos de células, 
organelas, ácidos 
nucléicos, complexos 
proteicos, etc.
Gradiente separação de:
Ficoll-Hypaque leucócitos
Sacarose mitocôndrias
Cloreto de césio ácidos nucléicos 
As mais potentes ultracentrífugas atuais ainda não são capazes de sedimentar proteínas.
Processos que diminuem a solubilidade e provocam a precipitação fracionada de proteínas 
são utilizados como etapas preliminares de purificação. Uma das vantagens desses métodos 
é o baixo custo e capacidade de processar grandes volumes/massas.
A precipitação de proteínas pode ser induzida por:
- adição de sais (Precipitação salina)
- adição de solventes
- variação de pH (Precipitação isoelétrica)
So
lu
bi
lid
ad
e 
da
 h
em
og
lo
bi
na
 (S
/S
’)
KCl
NaCl
MgSO4
(NH4)2SO4
K2SO4
 
Concentração do Sal,, Molar
Salting-in X Salting-out
O gráfico ao lado ilustra o efeito de 
diferentes sais sobre a solubilidade 
da hemoglobina.
Em baixa concentração salina, a 
solubilidade das proteínas aumenta, 
pois os íons do sal ajudam a reforçar 
a camada de solvatação.
Em alta concentração salina, a 
solubilidade das proteínas diminue 
pois os íons do sal competem pelas 
moléculas de água disponíveis para 
formar a sua própria camada de 
solvatação.
Sais com ânions divalentes são mais 
eficientes do que os monovalentes 
na precipitação de proteínas.
So
lu
bi
lid
ad
e,
 lo
g
Fibrinogênio Pseudoglobulina
MioglobinaAlbumina
Hemoglobina
Concentração do Sal (NH4)2SO4,, Molar
Sais se dissociam em solucão aquosa e competem com as proteínas pela água de solvatação.
Considere uma solução com fibrinogênio, 
albumina, hemoglobina, pseudoglobulina e 
mioglobina e observe o gráfico.
Usando o sal sulfato de amônio (NH4)2SO4, 
pode-se purificar completamente o 
fibrinogênio a partir de uma mistura das 5 
proteínas, pois este precipita totalmente em 
uma saturação de 2,8 M do sal.
Neste ponto, centrifuga-se a solução e o 
fibrinogênio é coletado como um precipitado.
Numa próxima etapa, adicionando-se mais 
sal à solução até uma saturação de 7 M, 
pode-se obter um novo precipitado contendo 
albumina, hemoglobina e pseudoglobulina.
E teremos também purificada a mioglobina, 
ainda em solúvel na presença de 7M do sal, 
e que ficou sozinha no sobrenadante.
Proteínas apresentam diferente sensibilidade 
para a precipitação salina.
- precipitam primeiro:
 proteínas maiores
 proteínas mais hidrofóbicas
 possuem camadas de solvatação maiores 
 ou menos organizadas, mais fáceis de pertubar. 
Solventes miscíveis com a água diminuem a constante 
dielétrica do meio e desorganizam a camada de solvatação 
das proteínas. 
Os mais utilizados são etanol e acetona. 
Proteínas também podem ser precipitadas com adição de solventes ao meio ou 
 quando colocadas em meio com pH próximo ao seu ponto isoelétrico. 
Água 
Dimetilformamida
Metanol
Etanol
Acetona
Clorofórmio
Benzeno
78.5 1.85
48.9 3.96
32.6 1.66
24.3 1.68
20.7 2.72
4.8 1.15
2.3 0.00
Solvente ConstanteDielétrica 
Momento
Dipolar
Proteína P.I.
Pepsina <1,0
Ovalbumina galinha 4,6
Albumina sérica humana 4,9
Tropomiosina 5,1
Insulina bovina 5,4
Fibrinogênio humano 5,8
Gama-globulina 6,6
Colágeno 6,6
Mioglobina equina 7,0
Hemoglobina humana 7,1
Ribonuclease A bovina 7,8
Citocromo C equino 10,6
Histona bovina 10,8
Lisozima, galinha 11,0
Salmina, salmão 12,1
 
Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas
Proteínas colocadas em meio com pH igual ao seu PI 
tendem a precipitar, pois tendo carga neutra, 
apresentam a camada de solvatação menos organizada. 
Para remover o excesso de sal ou do solvente no precipitado, utiliza-se a diálise.
-amostra é colocada dentro de um saco feito com uma membrana de celofane com poros 
 tratados, que permite a passagem de moléculas até 10,000 d.
- o saco contendo a amostra é imerso em um recipiente contendo o solvente que se deseja
- excesso de sal ou de solvente se difunde para o solvente
- após várias trocas de solvente, todo o excesso de sal/solvente terá sido retirado.
Para obter as proteínas precipitadas em solução novamente, é 
necessário reverter as condições que levaram à precipitação.
Membrana 
de celofane
solvente
solução a 
ser dialisada
Aos precipitados obtidos com sal ou 
solvente, adiciona-se água.
Ao precipitado obtido com variação 
de pH, retornar ao pH original.
início final∆t
ORGANELAS
LisossomosLisossomos
MitocôndriaMitocôndria
GolgiGolgi
NúcleoNúcleo
SOBRENADANTE
F 1 F 2 F 3 F 4
F 2 .1 F 2 .2 F 2 .3
F 2 .3.1 F 2 .3.2 . . . . . . F 2. 3.N
Precipitação com Sal/Solvente
Precipitação com Sal/Solvente
Cromatograf ia Troca Iônica
Cromatograf ia Troca Iônica
(pH ou resina diferente)
F 2 .3.N.X
 
1 Proteína apenas
 (0.001g) - 0.1 a 0.5% total
Gel Filt ração
MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g) Até o momento, exploramos as 
etapas iniciais de purificação de 
proteínas, como a centrifugação 
diferencial e precipitação 
fracionada.
Esses métodos, apesar de terem 
baixo poder de resolução (exploram 
diferenças grosseiras entre as 
proteínas), permitem processar 
grandes volumes ou massas, típicos 
das etapas iniciais de isolamento. 
Quando já houve redução significa-
tiva dos montantes de proteínas a 
serem processados, iniciam-se as 
cromatografias, que irão explorar as 
diferenças mais sutis entre as 
moléculas.
Não esquecerque todas as frações 
obtidas devem ter o conteúdo de 
proteínas e de atividade biológica 
medidos, para se decidir qual/quais 
deverão passar para o passo 
seguinte da purificação.
Que características devem ter as resina cromatográficas para possibilitar 
separações de moléculas baseadas em diferentes propriedades ?
Cromatografia de permeação em gel ou gel-filtração: 
separação de moléculas pela massa molecular
géis são porosos, funcionando como peneiras ou filtros
Cromatografia de troca iônica:
separação de moléculas pela carga elétrica
géis apresentam grupos carregados positiva- ou negativamente
Cromatografia de partição (fase reversa ou hidrofóbica):
separação de moléculas pela solubilidade relativa em meio aquoso
géis possuem carácter hidrofóbico
Cromatografia de afinidade:
separação de moléculas pela capacidade de interagir com um ligante 
géis possuem ligante específico ligado covalente à resina
 Como se avalia se o processo de purificação de uma proteína foi eficiente ?
Três parâmetros permitem avaliar a eficiência do processo de purificação de uma proteína:
- Atividade específica (AE): é a razão entre a quantidade da proteína de interesse, medida 
 através de sua atividade biológica, e a quantidade total de proteínas presentes 
 em cada etapa de purificação. Esse índice aumenta ao longo da purificação.
- Índice de purificação: indica quantas vezes em relação ao material de partida a proteína 
 de interesse foi “concentrada”. Calcula-se como a razão entre as atividades 
 específicas inicial (material de partida) e final (proteína pura).
- Rendimento: indica quanto (em %) da proteína de interesse ativa presente no material de 
 partida foi recuperado ao final da purificação. Um certo grau de perda é 
 inerente do processo de purificação (em cada etapa só devem ser proces- 
 sadas as frações mais ricas em atividade biológica, desprezando-se aquelas 
 que apresentam pouca atividade). 
 
 Também podem ocorrer perdas por desnaturação das proteínas devido às 
 diferentes condições (pH, sais, etc) a que são submetidas nas diferentes 
 etapas de purificação. Espera-se recuperar o máximo possível da proteína de 
 interesse. 
 
 Purificação da Glicoquinase hepática de Rato
EtapaEtapa Atividade Atividade EspecíficaEspecíficabb( U ( U.mg -1) .. - a
Rendimentoc
( % )( % )
0.17 100 1
2.0 85 12
23 45 140
44 33 260
80 15 480
Marcha A: somente cromatografias convencionais
1. Sobrenadantede pâncreas
2. (NH4)2 SO4, precipitado 25 -55%
3. troca iônica, coluna DEAE-Sephadex, pH 7.0, eluição KCl
4. troca iônica, coluna CM-cellulose, pH 5.5, eluiçãoNaCl
6. interação hidrofóbica, coluna Butyl~Sepharose
7. gel-f i ltração, coluna Sephacryl S-300 130 
 
 
15 780
Marcha B: com cromatografia de afinidade
1. Sobrenadantede pâncreas 0.09 100 1
2. troca iônica, coluna DEAE- Sephadex, pH 7.0, eluição KCl 18 84 195
3. Afinidade cromatográfica ( benzamidina~agarose ) 420 83 4.500
ÍndiceÍndicebb
Purif icaçãoPurif icação
a Unidade de enzima (1 unidade de atividade enzimática é definida como a quantidade de enzima que cataliza
a transformação de 1 micromol de substrato em produto, em condições pre-estabelecidas
bAtividade específica: medida da atividade biológica (em U) expressa por miligramas de proteína
c Rendimento: percentual da atividade biológica inicial (100%) recuperada em cada etapa de purificação
d Índice de Purificação : razão entre a atividade específica inicial e aquela determinada em cada etapa.
C
on
ce
nt
ra
çã
o
Tempo ou volume
Coletor de 
frações 
Funcionamento Básico de uma Coluna Cromatográfica 
Uma coluna é um tubo cilindríco aberto nas duas extremidades e preenchido com a resina ou 
matriz ou gel cromatográfico. A coluna é constantemente alimentada com líquido (tampão), 
banhando a resina e forçando o contacto desta e as moléculas que estão sendo analisadas. 
Abaixo está representado o esquema geral de uma cromatografia:
Tempo 1
Mais tampão é 
colocado na 
coluna, 
forçando os 
componentes 
da amostra a 
interagirem 
com a resina
Componentes da 
amostra se 
separam e saem 
da coluna com 
diferentes 
volumes de 
tampão
Tempo 2 Tempo n
Líquido 
que sae 
da coluna 
é 
recolhido 
em tubos 
de um 
coletor de 
frações
Os componentes da mistura são 
separados por interação diferenciada 
com a resina, com base em 
propriedades moleculares como:
• massa molecular
• carga elétrica
• solubilidade
• afinidade
 
Amostra com 
diferentes 
componentes 
Resina 
embebida 
em 
tampão 
Tempo zero
Um cromatograma, como o 
gráfico ao lado, é a maneira 
usual de se representar o 
resultado de uma 
cromatografia.
Cromatografia de gel filtração ou peneira molecularCromatografia de gel filtração ou peneira molecular 
 grãos (beads) da 
resina com poros 
grão da resina poroso
proteína grande
proteína pequena
Tampão 
“empurra” 
moléculas 
através da 
resina
tubos
 Na gel-filtração, as proteínas que penetram nos poros da resina precisam diferentes 
volumes de tampão para saírem da coluna, conforme suas massas moleculares, percorrendo os 
canais internos dos grãos. Quanto maior o número de grãos que cada molécula entrar durante o 
percurso através da coluna, maior o volume necessário para sua saída. 
 Proteínas maiores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com 
pouco tampão, correspondente apenas ao volume da coluna externo aos grãos, também chamado de 
volume morto (Vo). 
 Proteínas menoresProteínas menores que o diâmetro dos poros não são separadasnão são separadas e saem da coluna com um 
volume de tampão correspondente ao volume interno (Vi, volume total menos o volume do próprio gel).
Moléculas com massas diferentes
Fluxo do tampão
A
bs
or
bâ
nc
ia
 a
 2
80
 n
m
volume
M
ed
id
a 
da
 a
tiv
. b
io
ló
gi
ca
Moléculas 
maiores
Moléculas 
menores
Kav
M
as
sa
 m
ol
ec
ul
ar
 (k
D
)
 20 40 60 80 100 120 mL 
 25 50 75 100 125 mL 
 volume de eluição
A cromatografia de gel-filtração possibilita estimar a massa molecular de 
uma proteína em seu estado nativo
Além de purificar, por ser realizada em condições de pH, força iônica 
e temperatura que preservam a atividade biológica da proteína, a 
gel-filtração fornece a Mr do seu estado nativo.
Para isso, é necessário “calibrar” a coluna com proteínas de massa 
molecular conhecida, construindo-se uma curva de calibração. 
O volume de saída (eluição) de uma proteína numa coluna de gel-
filtração é proporcional ao logaritmo de sua massa molecular.
Curva de calibração
traçado da medida de atividade 
biológica nas frações
Medir o volume de eluição 
da fração mais ativa. 
Transportar para a curva de 
calibraçao.
Ler a massa 
correspondente
Observa
r a 
escala 
log
 Resinas para Gel-Filtração 
Sephadex G-10 Dextrana 0.05 - 0.70
Sephadex G-25 Dextrana 1 - 5
Sephadex G-50 Dextrana 1 - 30
Sephadex G-100 Dextrana 4 - 150
Sephadex G-200 Dextrana 5 - 600
Bio-Gel P- 2 Policrilamida 0.1 - 1.8
Bio-Gel P- 6 Policrilamida 1 - 6
Bio-Gel P- 10 Policrilamida 1.5 - 20
Bio-Gel P- 30 Policrilamida 2.4 - 40
Bio-Gel P-100 Policrilamida 5 - 100
Bio-Gel P-300 Policrilamida 60 - 400
Sepharose6B Agarose 10 - 4.000
Sepharose 4B Agarose 60 - 20.000
Sepharose 2B Agarose 70 - 40.000
NOME TIPO FAIXA DE RESOLUÇÃO
(kD)
*Sephadex e Sepharose: Amersham Pharmacia Biotech; Bio -Gel: Bio -Rad Laboratories
Moléculas pequenas
Moléculas pequenas
Proteínas
Proteínas
Células, partículas sub-celulares
Existem diferentes tipos de resinas para gel-filtração, conforme o tipo 
de moléculas ou partículas a serem separadas
indica quais os tamanhos 
das partículas que podem 
entrar nos poros da resina e 
serem fracionados. Acima ou 
abaixo da faixa, não há 
separação.
Para comparar calibrações com a mesma resina cromatográfica em colunas de 
dimensões diferentes utiliza-se o Kav, que é proporcional ao log de Mr. 
Kav = Ve-Vo
 Vt-Vo
Ve – volume de eluição de uma certa proteína
Vt – volume total da coluna
Vo – volume morto da coluna, em que saem moléculas com 
 
 massa acima da resolução da resina 
onde:
O gel nessa coluna é o 
Sephadex G-200, cuja 
faixa de resolução de 
proteínas é de 5.000 a 
600.000 d.
Observe como proteínas 
nos extremos da faixa 
de resolução tendem a 
“sair” da parte linear da 
curva.
Esta é uma outra forma de representar a calibração de uma coluna de 
gel-filtração.
Cromatografia de troca iônicaCromatografia de troca iônica 
A resina para cromatografia de troca iônica apresenta carga elétrica, positiva ou 
negativa, em uma ampla faixa de pH.
Trocadora de ânions Trocadora de cátions 
DEAE CM
Existem dois tipos básicos: resinas trocadoras de ânions (possuem carga positiva), 
como o dietilaminoetil (DEAE)-celulose e resinas trocadoras de cátions (possuem 
carga negativa), como o carboxi-metil (CM)-celulose
--
-
----
DEAE-celulose - pH < 10
CM-celulose - pH > 4
Cromatografia de troca iônicaCromatografia de troca iônica 
Proteína P.I.
Pepsina <1,0
Ovalbumina galinha 4,6
Albumina sérica humana 4,9
Tropomiosina 5,1
Insulina bovina 5,4
Fibrinogênio humano 5,8
Gama-globulina 6,6
Colágeno 6,6
Mioglobina equina 7,0
Hemoglobina humana 7,1
Ribonuclease A bovina 7,8
Citocromo C equino 10,6
Histona bovina 10,8
Lisozima, galinha 11,0
Salmina, salmão 12,1
 
PIácido
+
básico
-neutro
Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas
Como funciona a Cromatografia de Troca IônicaComo funciona a Cromatografia de Troca Iônica 
Adsorção
Eluição
+
+
+
+
+
+
+
+
Moléculas com a mesma carga, 
ou sem carga, não interagem com a resina, 
sendo as primeiras a sair da coluna
Adição de sal ao tampão resulta em 
competição entre os íons em solução 
e as moléculas adsorvidas na resina.
Na+Cl- +
A cromatografia de troca iônica compreende duas etapas: 
1) adsorção das proteínas com carga contrária à 
resina, e saída da coluna das proteínas com a 
mesma carga; 
2) eluição das proteínas adsorvidas.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+ +
No exemplo ao lado, como funciona uma resina catiônica ou 
trocadora de ânions, como o DEAE-celulose):
Para a eluição, as condições de adsorção da coluna 
(pH ou força iônica) são alteradas para neutralizar a 
interação entre as proteínas e a resina. 
Mais frequentemente utiliza-se um aumento da 
concentração do sal no tampão, pois alterações de pH 
podem desnaturar proteínas, levando-as a precipitar 
dentro da coluna.
Carboximetil~celulose
(trocadora de cátions)
Dietilaminoetil~celulose
(trocadora de ânions)
Duas Modalidades de Cromatografia de Troca IônicaDuas Modalidades de Cromatografia de Troca Iônica
 Gradientes de sal podem fracionar as proteínas adsorvidas na resina de acordo 
com a intensidade de suas cargas, que é dada pela diferença entre seus PIs e o pH do 
tampão de eluição. 
 As proteínas não retidas (com a mesma carga da resina) não são separadas, 
sendo simplesmente “arrastadas” pelo tampão (ou seja, não são repelidas pela resina).
_
=
=
_
+
++
++
(+)
(+)
(+)
(+)
0. 10 M
0. 15 M
0. 20 M
Eluição NaCl
Não retidas
DEAEDEAE
++
0. 10 M
0. 15 M
0. 20 M
Eluição NaCl
+
(-)
(-)
(-)
+ ++
_ =
=
_(-)
Não retidas
CMCM
Tipos de Resina de troca Iônica
 Tipos de Resina de troca iônica 
NOME TIPO GRUPO IONIZÁVEL OBSERVAÇÕES
Dowex 1 Fortemente básica Ø - CH2N+(CH3)3 Troca aniônica
resina de polistireno
Dowex 50 Fortemente básica Ø - SO3-H Troca Catiônica
resina de polistireno 
DEAE-celulose Básica Dietilaminoetil Fracionamento de proteínas 
- CH2CH2N+(C2H5)2 ácidas e neutras 
CM-celulose Ácida Carboximetil Fracionamento de proteínas 
- CH2COOH básicas e neutras 
 Q-Sepharose Gel de dextrano Combinação de gel filtração 
básico e troca iônica de proteínas 
ácidas e neutras
SP -Sepharose Gel de dextrano Combinação de gel filtração
ácido e troca iônica de proteínas 
básicas e neutras
* Dowex: Dow Chemical Co.; Sepharose e Source: GE LifeSciences Bio- Gel: Bio Rad Laboratories
Existem vários tipos de resinas de troca iônica disponíveis no mercado.
−Ο−CH2CHOHCH2OCH2CHOHCH2N+(CH3)3
—CH2-SO3-
Cromatografia de afinidade:
Eluição: condições que interferem na ligação da proteína ao 
 ligante, como mudanças no pH e/ou força iônica, ou 
 por competição com o ligante livre
Desprezar 
proteínas não 
retidas 
Lavagem 
Eluição
pH 2,0 ou sal
Antígeno A 
puro 
Anti-A 
interage 
apenas 
com a 
proteína A
-
Mistura de proteínas
Coluna 
empacotada 
com ess gel 
Partículas de 
gel recobertas 
de anticorpos 
anti-A
Adsorção 
Complexo 
Ag-AC é 
desfeito
Um dos métodos mais 
eficientes para a 
purificação de proteínas, 
possibilitando um alto 
rendimento com número 
reduzido de etapas. 
A separação de 
moléculas tem como 
base a interação 
específica do analito 
(molécula-alvo) com um 
ligante imobilizado na 
matriz. Forças 
envolvidas nessa 
interação podem ser não 
covalentes 
(eletrostáticas, 
hidrofóbica, pontes de H) 
ou covalentes (p.e., 
ponte dissulfeto). 
Ex: cromatografia de imunoafinidade
Ligante 
grupo-específico
Especificidade
Proteína A Região Fc de IgG
Proteína G Região Fc de IgG
Concanavalina A Grupos glicosil- ou manosil-
Cibacron Blue Várias enzimas, albumina
lisina Plasminogênio, RNA ribossomal
arginina proteinases tipo tripsina
benzamidina proteinases tipo tripsina
calmodulina Proteínas reguladas por calmodulina
heparina Fatores de coagulação, lipases, 
hormônios, receptores estoróides, etc
Metais de transição Proteínas e peptídeos com resíduos 
de His expostos
1. Mono-específicos - ligação específica da molécula-alvo
- análogos de substratos ou inibidores de enzimas
- agonistas ou antagonistas de receptores
- haptenos ou determinantes antigênicos de anticorpos
- ligantes com “tag” ou “marcação”
- glutationa-S-transferase
- poli-Histidina
2. Grupo-específico: ligantes para separação de grupos:
Tipo de ligantes em cromatografia de afinidade
8-AEA-cAMP
8-(2-aminoethyl)aminoadenosine-3',5'-cyclic 
monophosphate
(ligante para proteínas com afinidade por cAMP 
ou cGMP)
 Sítios de ligação das 
proteínas A, G e L à 
imunoglobulina, que permitem 
a purificação de anticorpos por 
cromatografia de afinidade 
Para ligantes pequenos (Mr < 1.000) há o risco de impedimento 
estérico entre a matriz e a molécula-alvo, que causa dificuldade 
ou impede sua ligação à resina. 
 A introdução de um braço espaçador diminue esse risco.
Estratégias para acoplamento de ligantes à resina
 Reagente Alvo no ligante
Braço espaçador covalente entre 
a resina e o ligante
Ligação reversível não covalente
liganteMolécula-alvo (analito)
Preparo da resina de afinidade: 
Passo 1. Ativação da resina
 
 Passo 2. Acoplar 
 o ligante 
Papel
ou placa 
de sílica
Amostra 
na origem
tempo 0 t 1 t2 tn 
direção do 
fluxo do 
solvente
Compostos 
separados
Cuba com solvente (fluxo por capilaridade)
Cromatografia de Partição
Princípio: Explora diferenças de solubilidade dos compostos em solventes com grau de hidrofobicidade 
diferentes, um polar e outro apolar.
Aplicável especialmente á moléculas pequenas, como compostos orgânicos, aminoácidos, peptídeos, 
açúcares, lipídeos, etc.
Apresenta limitações para uso com proteínas acima de 20-30kda, que são desnaturadas em presença 
de solvente orgânico.
Fase estacionária
 (suporte sólido) X
 Fase móvel
(líquido ou gás)
Consiste de 2 sistemas:
CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA
Fase Estacionária: sílica (mineral apolar)
Fase Móvel: Solvente aquoso ou água
Suporte: SÍLICA (camada delgada ou TLC)
Suporte: PAPEL
Fase Estacionária: Aquosa (H20 na celulose)
Fase Móvel: Solvente orgânico (hidrofóbico)
CROMATOGRAFIA EM PAPEL
distância de migração da substância
distância de migração do solvente
Rf =
HPLC: high performance (pressure) liquid chromatography
Inicialmente desenvolvida para cromatografia de fase reversa em coluna, hoje em dia 
abrange aplicações para todos os tipos de cromatografias. 
Característica diferencial da cromatografia convencional: 
• partículas de resina com diâmetro muito pequeno (poucos microns) 
• aumento da eficiência da separação em função do número maior de partículas 
 de resina em um mesmo volume da coluna 
• fase móvel - necessita bomba de alta pressão para ter fluxo através da coluna
Desenho básico de um HPLC
bombas Injetor de 
amostra
Coluna e 
forno
Coletor de 
frações
Detector
Controle e 
análise dos 
dados
Duas bombas permitem eluição em gradiente
Detector: índice de refração, absorbância UV 
ou Vis, fluorescência, etc.
Coluna pode ser aquecida para melhorar a 
eluição diferencial na fase reversa
 CN Fenil NH2 C4 C8 C18 
 Retenção na coluna: aumenta com o tamanho da cadeia 
Condição de equilíbrio: em meio ácido 
(0.1% de ácido trifluoroacético) para 
aumentar hidrofobicidade (protonar as 
carboxilas)
Eluição com gradiente crescente de solvente 
orgânico miscível com água
- acetonitrila, metanol, propanol
Fase reversa: resinas de sílica derivatizadas com hidrocarbonetos de 2 C a 18 C
Fase estacionária Função 
C18 –Si (CH3)2 C18 H37 
C8 –Si (CH3)2 C8 H17 
tC2 –Si C2 H5 
Aminopropyl –Si (CH2)3 NH2 
Cyanopropyl –Si (CH3)2 (CH2)3CN 
Diol –Si (CH2)3 OCH2CH(OH)CH2OH 
A
bs
or
bâ
nc
ia
 a
 2
14
 n
m
Tempo ou volume de retenção
%
 d
e 
ac
et
on
itr
ila
100Moléculas não retidas Moléculas retidas
Cromatograma de uma coluna de fase reversa, com eluição por um gradiente de acetonitrila
aminoácido
 Para determinar a estrutura primária de uma proteína, 
é necessário primeiro conhecer a composição (número 
e tipos) de seus aminoácidos. 
A posição do pico no cromatograma identifica o aminoácido. 
 A área do pico quantifica o aminoácido. 
A proteína pura é tratada com 
HCl 6N fervente para quebrar 
(hidrólise) as ligações peptídicas.
A mistura resultante é submetida 
a métodos cromatográficos (fase 
reversa, troca iônica) para separar 
os diferentes aminoácidos. Tempo de retenção (min)
flu
or
es
cê
nc
ia
Existem vários métodos para se determinar a sequência de aminoácidos de 
uma proteína. Aqui veremos como funcionam os dois métodos 
atualmente mais utilizados:
a) Método de Edman: reação do aminoácido N-terminal da proteína com 
fenil-isotiocianato . A proteína modificada é submetida a 
hidrólise ácida liberando o aminoácido N-terminal modificado, e este é 
identificado por cromatografia. Segue-se novo ciclo de reação com o 
próximo aminoácido na proteína, que se tornou o novo N-terminal. 
b) Espectrometria de massa: determinação das massas de fragmentos 
correspondendo a aminoácidos, retirados sequencialmente da proteína.
 Veremos mais sobre esse método na aula sobre eletroforese e 
proteômica. 
Método de Edman - 
sequenciamento de proteínas com 
PITCPITC (fenil-isotiocianato)
ciclo 1
ciclo 2
hidrólise com ácido 
trifluoroacético
hidrólise ácida
vai para novo ciclo
análise cromatográfica (troca iônica ou fase reversa)
(1)
(2)
(3)
acoplamento
acoplamento
Cada ciclo de reação compreende 3 etapas:
1. Reação da proteína com PITC, que se 
acopla ao grupo amino NH2- livre do 
aminoácido 1 (no exemplo, uma lisina, K);
2. Hidrólise ácida da proteína conjugada 
com PITC libera a feniltiohidantoína (PTH) 
do aminoácido 1 e o restante da proteína, 
tornando o aminoácido 2 o novo resíduo 
N-terminal (no exemplo uma serina, S);
3. Análise cromatrográfica do PTH-
aminoácido e novo ciclo de reação com o 
novo N-terminal da proteína. 
Sequenciadores automatizados fazem 
todas as etapas, com capacidade 
para realizar 30 ciclos por dia, a partir 
de 100-200 picomoles de proteína. 
Quando uma proteína possui mais de 20-30 resíduos de aminoácidos, não 
é possível sequenciá-la diretamente pelo método de Edman. 
Para obter a sequência completa de uma proteína, é necessário sequenciar vários peptídeos 
da mesma proteína, obtidos por diferentes tipos de quebra da cadeia, até haver sobreposição 
de suas sequências.
Proteína
Total 150 a.a
sequência obtida a partir da proteína intacta
30 aa
Diferentes métodos são utilizados para obter-se diferentes peptídeos da proteína: A) enzimas 
proteolíticas, como tripsina (quebra em resíduos de Lys ou Arg) e quimotripsina (quebra em 
resíduos de Phe); B) tratamento com brometo de cianogênio (quebra em Met); e outros.
proteína 
inteira
peptídeos 
método A
peptídeos 
método B
Sequenciamento de novo de proteínas por espectrometria de massas
Para sequenciar 
proteínas é preciso 
obter o espectro MS/MS 
de seus peptídeos.
Isso significa 2 etapas 
de MS acopladas. 
Depois de fazer o MS 
da molécula inteira, 
esta é fragmentada 
dentro do aparelho por 
colisão com gases.
Os fragmentos são 
então separados e 
analisados por MS.
hélio ou argônio
A ligação peptídica se quebra formando fragmentos típicos, como os 
íons b e y mostrados na figura acima, que terão massas diferentes de 
acordo com o radical R de cada aminoácido.
Espectro MS/MS do peptídeo 
tríptico 
GLSDGEWQQVLNVWGK. 
AA Codes Mono. AA Codes Mono.
Gly G 57.021464 Asp D 115.02694
Ala A 71.037114 Gln Q 128.05858
Ser S 87.032029 Lys K 128.09496
Pro P 97.052764 Glu E 129.04259
Val V 99.068414 Met M 131.04048
Thr T 101.04768 His H 137.05891
Cys C 103.00919 Phe F 147.06841
Leu L 113.08406 Arg R 156.10111
Ile I 113.08406 CMC 161.01467
Asn N 114.04293 Tyr Y 163.06333
- - - Trp W 186.07931
Analiza-se o espectro 
buscando diferenças de 
m/z equivalentes a um 
resíduo de aminoácido, 
que permitem conhecer 
a seqüência do 
peptídeos
Síntese de peptídeos Quim. Nova, Vol. 27, No. 5, 781-789, 2004
COOH
bloq
H2N
bloq
1. DNA recombinante
1. Química: uso de reagente químico para 
ativar o ácido carboxílico de um Nα-acil-
aminoácido, o qual sofre o ataque nucleofílico 
do grupo α- amino de outro aminoácido 
 - indicado para sequências de até 20 aa. 
 - estereo-isômeros, purificação dos produtos
3. Biocatálise: reversão da proteólise
 - diminuição da atividade daágua no meio 
reacional reverte a ação de enzimas 
proteolíticas
 - termolisina, pepsina, subtilisina, tripsina, etc
 - vantagens:, não forma misturas racêmicas e 
 
 sub-produtos, condições brandas 
Síntese de peptídeos
Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonila) - protetor do grupo α- amino dos doadores de acila, 
estável ao ácido trifluoroacético (TFA) e lábil a bases orgânicas – todas as outras 
carboxilas são protegidas por reagentes lábeis ao TFA e estáveis a bases orgânicas
Boc (t-butiloxicarbonila) - protetor do grupo α- amino dos doadores de acila lábil ao 
(TFA) – todas as outras carboxilas são protegidas por reagentes estáveis a este ácido e 
lábeis a ácidos inorgânicos fortes ou hidrogenólise.
Síntese de peptídeos
Robert B. Merrifield – Prêmio Nobel em Química em 1984
Síntese de peptídeos
ELETROFORESE ELETROFORESE
1. pH / tampão
2. Suporte
- papel : corrente alta (calor)
uso para peptídeos e aminoácidos
- agarose: ácidos nucléicos 
Imunoeletroforese
Proteínas nativas
- poliacrilamida: proteínas
ac. nucleicos
não desnaturante ou nativa
desnaturante e redutor
peso molecular
composição de subunidades 
focalização isoelétrica: PI
bidimensional
CONDIÇÕES QUE DETERMINAM A SEPARAÇÃO
SUPORTE X pH MEIO
++
++
++
++
∆ Τ∆ Τ
+
_
Reação de eletrólise da água
• Uso de tampão concentrado
• Uso de indicador de pH como 
marcador de corrida: 
 azul de bromofenol
Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE)
polyacrylamide
persulfate
+
• 7 a 15% [acrilamida] – maioria das proteínas
• [ ] mais baixas – gel muito mole – 
 suporte com agarose
• Gradiente de acrilamida – aumenta poder de 
resolução
cuba vertical para mini-gel (10 X 8 cm)
ProteínaProteína Ponto Isoelétrico
Pepsina < 1.0
Ovalbumina (galinha) 4.6
Albumina Sérica (humana) 4.9
Tropomiosina 5.1
Insulina (bovina) 5.4
Fibrinogênio (humano) 5.8
γ −Globulina 6.6
Colágeno 6.6
Mioglobina (cavalo) 7.0
Hemoglobina (humana) 7.1
Ribonuclease A (bovina) 7.8
Citocromoc (cavalo) 10.6
Histona (bovina) 10.8
Lisozima (galinha) 11.0
Salmina(salmon) 12.1
155.000
330.000
18.000
64.000
 Separação na 
eletroforese nativa é 
influenciada pela carga, 
massa e forma da 
molécula
A B
C
C
C
A
A
B
B
SDS (dodecil sulfato de sódio
 +
 2-mercaptoetanol
Efeitos do SDS
• desnaturação uniformiza a forma 
das proteínas; 
• mascara a carga natural das 
proteínas no pH da corrida, fazendo 
com que todas moléculas migrem 
para o anôdo;
• facilita o efeito de redutores 
SDS-PAGE 
Salmonella tiphymurium
Determinação da massa molecular de proteínas
Curva de calibração de SDS-PAGE a 15%
Mobilidade relativa (Rf)
M
as
sa
 m
ol
ec
ul
ar
 (k
D
)
Mobilidade relativa = 
distância percorrida pela banda X
distância percorrida pelo marcador da corrida
97.4
87.0
45.0
29.0
21.0
12.5
 6.5
(-)
(+)
• migração através de um gradiente de pH
• proteínas “focalizam” nos seus P.I.
Anfólitos: Misturas de compostos poliaminados/policarboxilados (patenteados)
Gel não tamponado polimerizado com anfólitos
1ª corrida: anfólitos criam gradiente
2ª corrida: amostras são aplicadas
Após a corrida: pedaços do gel são 
analisados quanto ao seu pH.
3.0
4.0
5.0
6.0 pH
pH
+
Marcadores de P.I. conhecidos
_
Aplicações:
-Determinação do PI
-Isoformas da mesma proteína:
- glicosilação
- fosforilação
- mutações pontuais
 Eletroforese – focalização isoelétrica 
1a.dimensão: focalização isoelétr ica
2a.dimensão: SDS-PAGE (perpendicular a 1a.)
PM x 103 
Eletroforese Bidimensional
-
P IP I
+
3
3.5
4
4.5
5
5.5
Origem
5 4 3 2678910
PROTEOMA:
• análise simultânea de até 5.000 proteínas
• permite comparação de todas as proteínas expressas 
por uma célula em dois momentos diferentes: 
• análise do efeito de hormônios, 
• análise do efeito de drogas; 
• estados fisiológicos (desenvolvimento);
• condições patológicas diversas (vírus, 
 bactérias,etc.) 
 
Eletroforese 2D de proteínas totais 
(proteoma) de Escherichia coli
Proteínas com mesmo pI
Proteínas com a 
mesma massa
sem fervura das amostras
pode ter SDS no gel de separação
•Conformação nativa, oligomerização
•Zimogramas: estudos de enzimas, afinidade
• Gel copolimerizado (gelatina, amido, etc)
• Gel overlay (gel de agarose)
• Proteínas nativas ou renaturadas no gel por 
remoção lenta do SDS por troca com detergente 
não iônico
Gel nativo: 
Antígeno B do Echinococcus granulosus
Multímeros de subunidades de 8 kDa
15% SDS-PAGE
Monteiro et al., 2011
PLoS Neglected Tropical Diseases
Urease de Canavalia ensiformis 
 (hexâmero de 90 kDa)
3% PAGE
Efeito de Cu2+ - precipitação 
Follmer & Carlini, 2005
Arch. Biochem. Biophys.
Ni2+ Cu2+ Zn2+ Hg2+ 
Rhipicephalus microplus Cys-endopeptidase
12% SDS-PAGE- copolimerizado com 0.1 % hemoglobina
 - após corrida, retirada do SDS troca por Triton X-100 (3h)
 - incubação a pH 4,0, 18h/37oC.
 Estrela et al, 2010 
Comp. Biochem. Physiol
 Tolfo Bittencourt et al., 2004 Res. Microbiol 
 8.5% non-denaturing gels
- atividade das SODs revelada Inibição da redução do NBT em 
presença de TEMED e riboflavina 
Superoxide dismutases from Metarhizium. anisopliae
Métodos imunoquímicos aplicados a proteínas 
 estrutura e propriedades de imunoglobulinas
 anticorpos policlonais e monoclonais: produção e purificação
 
 imunodiagnóstico: aglutinação X lise
 imunoprecipitação: difusão em gel, imunoeletroforese
 ELISA, Western blot
 imunohistoquímica e imunofluorescência
Anticorpos são imunoglobulinas.
Cadeia H (pesada) – 50.000 d
Cadeia L (leve) – 25.000 d
Porção N-terminal das cadeias L e H
 
 ~ 120 aminoácidos variáveis
 restante da cadeia é constante
Cadeia H Cadeia L
Imunoglobulina
classe Sub-classe
γ1 κ ou λ IgG IgG1
γ2 κ ou λ IgG2
γ2 κ ou λ IgG3
γ4 κ ou λ IgG4
α1 κ ou λ IgA IgA1
α2 κ ou λ IgA2
µ κ ou λ IgM
δ κ ou λ IgD
ε κ ou λ IgE
Função Estrutura
anticorpo
antígeno
Complexo antígeno-anticorpo
Mecanismos 
através dos quais 
os anticorpos 
executam as 
funções de defesa:
- Neutralização (Ag solúveis)
- Opsonização (Ag particulados)
- Imunecomplexo (todos Ags)
Produção de Anticorpos: imunização ativa
Propagação clonal de linfócitos B ou plasmócitos
Um linfócito B sempre produzirá 
imunoglobulinas para o mesmo 
antígeno, mas poderá variar a 
classe de anticorpos produzidos
Anticorpos policlonais versus Anticorpos monoclonais
Há vários determinante antigênico ou epitopo em uma proteína
 - tamanho: 5 a 6 aminoácidos
 - podem ser sequenciais ou conformacionais
 Reconhecimento de 
apenas um determinante 
antigênico 
 tipo único de 
imunoglobulina
 
 Vantagens e desvantagens 
Produção de 
Anticorpos 
Monoclonais
 Imunoprecipitação
Complexos Ag-Ac insolúveis
- Precipitado é máximo na 
Zona de equivalência
- Excesso de Ag ou de Ac
Fazem complexos solúveis
Imunoprecipitação em gel de agarose
Imunodifusão dupla
Permite comparar antígenos e detectar determinantes 
antigênicos em comum
Identidade
total
Identidade 
parcial
Ausência de
identidade
 Recombinant
 Protein L
 Native
 Protein A
 Recombinant
 Protein A
 Recombinant 
Protein G
 Protein 
 A/G
 Source Peptostreptococci Staphylococcus
 aureus 
 Bacillus Streptococci Bacillus
 Molecular Weight 35,800 42,000 44,600 22,000 50,449Number of Binding
 Sites for IgG
 4 4 5 2 4
 Albumin Binding Site no no no no no
 Optimal Binding pH 7.5 8.2 8.2 5 5-8.2
 Binds to VLκ Fc Fc Fc Fc
Proteínas bacterianas com afinidade por Imunoglobulinas
- Servem como ligantes em matrix de afinidade
- Servem como 2º.ligantes em testes imunoenzimáticos
bead
Imunobeads: adsorção complexo Ag:Ac
Ensaios Imunoenzimáticos ou ELISA
+ 1º.Ac + Ag
placa Ag
Ac 1º.
Ac 2º.
ES
cor
ELISA
sandwich + 2º.Ac + S cor
Padronização do ELISA
Concentração do Ag ou Ac
Abs (intensidade da cor)
 
ELISA Competitivo é adequado para identificação e 
quantificação tanto do antígeno como do anticorpo.
Para a determinação de Ag, o Ag presente na amostra 
compete com Ag marcado com uma enzima, para se ligar ao 
Ac imobilizado. A cor desenvolvida na revelação é 
indiretamente proporcional à concentração de Ag na 
amostra. 
O Radioimunoensaio (RIA) baseia-se no mesmo 
princípio, utilizando Ag marcado com um radioisótopo para 
competir com o Ag frio presente na amostra. 
(1)
(2)
- Quanto maior a concentração do antígeno a ser medido, maior será 
o deslocamento do antígeno marcado, permitindo a quantificação.
Variante para 
pesquisa do Ac
Western blot
Anticorpo secundário marcado com:
 - enzima
 - radioativo
 - fluorescente 
MAP2-(neurons) and GFAP-(astrocytes) positive 
cells in hippocampal cell culture 
GluR1 clusters in hippocampal cultured neurons 
Presynaptic terminals showned by immunostainig of 
specifically presynaptic protein Synapsin in cultured 
hippocampal neuron 
Imunofluorescência:
-anticorpos marcados com diferentes fluoróforos
 
 vermelho (rodamina), verde (fluoresceína)

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