enzimas de restricao.doc

Prévia do material em texto

Enzimas de restrição. 
Foram descobertas como mecanismo de defesa de bactérias por infecções virais. E o conceito foi usado para técnicas moleculares. O fenômeno de restrição foi descoberto em bactérias que clivavam o DNA exógeno. Mas a questão era como ela clivavam o DNA viral sem danificar o seu próprio. Já que a constituição do DNA é feita da mesma forma. Descobriu se então que havia um mecanismo de proteção ao próprio DNA.
Fora descoberto a existência de duas enzimas, uma de clivagem e outra de modificação. Então o DNA bacteriano modificava o DNA no sítio de ligação da enzima para que o próprio DNA não fosse clivado. A modificação era feita por metilacoes, modificações no próprio DNA e como o viral não sofrem a modificação eles são clivados. 
Existem vários tipos de enzimas de restrição, mas em laboratório, as mais recorrentes são quatro tipos. 
A do tipo I, são enzimas com atividades de restrição e modificações no mesma subunidade. Porém o corte efeito de maneira randômica, ou seja, distante do sítio de reconhecimento. Ela reconhece uma determinada sequência de DNA, mas a clivagem é feita fora desse sítio então ela pode cortar em vários pedaços e não há um tamanho específico de onde isso acontece. Depende da estrutura que ela irá montar no sítio ativo dela. 
A do tipo II, são as enzimas comercializadas atualmente desenvolvidas de forma artificial e não mais extraídas de bactérias. Existem atividades de restrição e modificação em subunidades protéicas distintas. É mais interessante pois reconhece sítios menores e a clivagem é feita dentro desse sítio reconhecido. Dependendo da variedade, é muito próximo ao sítio. Não mais de forma randômica. A maioria corta no interior do sítio. Ligam se ao DNA como monômeros, mas clivam o DNA de modo cooperativo, através da dimerização com uma subunidade contendo um domínio de clivagem. Após a ligação irão clicar a dupla fita de DNA, dos dois lados. O tipo II s, já são menos utilizadas por serem mais raras. Apresentam unidades de modificação e restrição diferentes, semelhante a do tipo II normal, porém irão cortar próximo ao sítio de reconhecimento. Elas não clivam dentro do sítio, apenas próximo. 
A do tipo III, possui atividade de clivagem e modificação na mesma subunidade. Como a do tipo I. Clivam fora do sítio de reconhecimento e requerem duas sequências em sítios opostos dentro da molécula de DNA. Então ela reconhece dois sítios praticamente, para poder fazer a clivagem. 
A do tipo IV, e bem semelhante a do tipo III. 
Dos quatro tipos de enzimas a mais utilizada é a do tipo II, por que clivam e modificam em sítios diferentes. 
Enzimas de restrição em E.coli
A dam metila em uma sequência específica de adenina e a dcm metila em uma citosina. Normalmente as sequências reconhecidas têm entre 4 e 8 nucleotídeos. E são palíndromas, ou seja, independente da direção de leitura a sequência será a mesma. 
Izoesquisomeros - diferentes enzimas de restrição que reconhecem a mesma sequência.