02 - Eletroforese e espectrofotometria

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Eletroforese
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Eletroforese é um termo abrangente que se refere à migração de partículas ou solutos carregados em meio líquido sob a influência de um campo elétrico.
Eletroforese de zona é a técnica mais comumente usada em aplicações clínicas. Nesta técnica, as moléculas carregadas migram em zonas, normalmente em um meio de suporte poroso, como um gel de agarose, após a amostra ter sido misturada a uma solução tampão. É gerado um eletroferograma, uma representação de zonas de proteínas, cada uma finamente separada das zonas vizinhas, sobre o material de suporte. As zonas de proteína são visualizadas quando o meio de suporte é corado com um corante específico para proteína; o meio é, então, seco, e as zonas são quantificadas em um densitômetro. O meio de suporte seco é mantido como um registro permanente.
ELETROFORESE
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ELETROFORESE
Definições:
1. Catodo (eletrodo negativo)
2. Anodo (eletrodo positivo)
3. Anfólito (molécula carregada positivamente ou negativamente)
O anfólito adquire carga positiva (liga prótons) em uma solução mais ácida que seu ponto isoelétrico (pI) e migra em direção ao catodo. Em uma solução mais alcalina, o anfólito está negativamente ionizado (libera prótons) e migra em direção ao anodo.
A velocidade de migração depende de fatores tais como: (1) carga elétrica líquida da molécula, (2) tamanho e forma da molécula, (3) força do campo elétrico, (4) propriedades do meio de suporte e (5) temperatura da operação. A mobilidade eletroforética é definida como a velocidade de migração (cm/s) por unidade de força de campo (volts/cm).
→ mobilidade eletroforética
Q → carga elétrica do anfólito
r → raio iônico do soluto
 → viscosidade da solução tampão na qual a migração está ocorrendo
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ELETROFORESE
Instrumentação:
1. Dois reservatórios com placas lisas para controlar o fluxo de energia contendo tampão usado no processo;
2. Dois eletrodos (um em cada reservatório) feito de platina ou carbono, cuja polaridade é determinada pelo modo de conexão à fonte de energia;
3. Suporte eletroforético, no qual a separação ocorre;
4. Fitas de contato que podem contactar o suporte eletroforético ao tampão (opcional);
5. Tampa, utilizada para evitar evaporação do tampão e proteger o sistema.
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ELETROFORESE
Fontes de Energia:
A função de uma fonte de energia em um processo eletroforético é fornecer força elétrica. As fontes de energia disponíveis comercialmente permitem a operação em condições constantes de (1) corrente, (2) voltagem ou (3) potência, sendo todas ajustáveis.
O fluxo de corrente através de um meio que oferece resistência elétrica está associada à produção de calor:
E → força eletromotriz (EMF) em volts (V);
I → corrente em ampéres (A);
t → tempo em segundos.
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ELETROFORESE
Tampões:
O tampão serve como um componente multifuncional no processo eletroforético já que ele (1) conduz a corrente aplicada, (2) estabiliza o pH no qual a eletroforese é aplicada, e (3) determina a carga elétrica do soluto.
A força iônica do tampão influencia: (1) a condutância do suporte, (2) a densidade da nuvem iônica em torno da molécula carregada, (3) a velocidade de migração e (4) nitidez das zonas eletroforéticas.
ci → concentração iônica em mol/L;
zi → carga do íon.
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ELETROFORESE
Meios de Suporte:
A separação é baseada nas diferenças das razões carga/massa de proteínas e, dependendo do tamanho do poro do meio, possivelmente no tamanho molecular.
Gel de Amido;
Acetato de Celulose (para CAE – eletroforese em acetato de celulose);
Agarose (para AGE – eletroforese em gel de agarose) → separação de proteínas do soro (carga/massa), da urina, do líquor, procura de variantes de hemoglobina, diferenciação de isoenzimas, separação de lipoproteínas; separação de fragmentos de DNA (tamanho da molécula e forma molecular);
Poliacrilamida (para PAGE – eletroforese em gel de poliacrilamida) → separação de proteínas em geral (carga/massa e tamanho molecular), separação de misturas de fragmentos menores de DNA.
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ELETROFORESE
Procedimento Geral:
Separação;
Coloração;
Quantificação (Densitometria).
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ELETROFORESE
Tipos de Eletroforese Importantes:
Eletroforese de Zona → produz zonas de proteínas que são heterogêneas e fisicamente separadas umas das outras. São classificadas de acordo com o tipo e a estrutura do material de suporte usado e são comumente designadas como CAE, AGE, PAGE, etc.
Eletroforese em Placa de Gel (gel retangular, independente da espessura);
Eletroforese em Disco;
Eletroforese por Focalização Isoelétrica (IEF);
Eletroforese Bidimensional (2-D).
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Eletroforese na qual são introduzidas descontinuidades na voltagem e gradiente de pH pelo uso de tampões de diferentes composições e pH, em locais diferentes da coluna de gel. O termo 'disc' foi originalmente utilizado como uma abreviação para 'descontínuo' se referindo aos tampões empregados, e não tem nenhuma relação com a forma das zonas separadas. 
O meio para esta eletroforese é a poliacrilamida. O método original de Ornstein e Davis (1964) estabelece duas descontinuidades de pH e uma descontinuidade de reticulação do meio electroforético.
A eletroforese de disco pode distinguir famílias de proteínas, isômeros de carga ou isômeros de tamanho. 
ELETROFORESE
Eletroforese em Disco
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ELETROFORESE
Eletroforese em Disco
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As moléculas migram sob a ação de um campo elétrico em um gel contendo um gradiente de pH. A migração se interrompe ao atingirem seu ponto isoelétrico (o ponto isoelétrico de uma molécula é o pH no qual ela não tem carga líquida e não se moverá em um campo elétrico).
Aplicada a moléculas que possam ser tanto positivamente ou negativamente carregadas (anfotéricas).
Cadeias laterais das proteínas possuem grupos ionizáveis carboxílicos (Asp,Glu), aminos (Lys), imidazóis (His) e guanidino (Arg):
R-COO- + H+	 R-COOH
R-NH3+ + OH- R-NH2 + H2O
A carga líquida de uma proteína é função da soma de suas cargas negativas e positivas. A carga é zero no seu ponto isoelétrico (pI).
O pI de uma proteína pode ser alterado por modificações químicas como fosforilações.
O pré-requisito para uma boa IEF é a formação de gradiente de pH estável e reprodutível.
ELETROFORESE
Focalização Isoelétrica
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ELETROFORESE
Focalização Isoelétrica
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Paba et al (2003)
ELETROFORESE
Eletroforese Bidimensional
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Espectrofotometria
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Fotometria é a medida da intensidade luminosa ou a quantidade de luminosidade incidente em uma superfície.
Espectrofotometria é a medida da intensidade da luz em comprimentos de onda selecionados.
O termo medida fotométrica foi originalmente definido como o processo utilizado para medir a intensidade de luz independente do comprimento de onda. Os instrumentos modernos, no entanto, isolam uma faixa estreita do comprimento de onda do espectro para as medições. Aqueles que utilizam filtros para este fim são referidos como fotômetros de filtro, enquanto aqueles que utilizam prismas ou grades são chamados espectrofotômetros.
Espectrofotometria
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http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php?term=Eletroforese+Descont%C3%ADnua&lang=3 
http://www.dbio.uevora.pt/LBM/Foco/Electroforese/electrofores.html