Estudo dirigido microbiologia para engenharias

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MBI 102 – Microbiologia Básica Aplicada às Engenharias 
 
ESTUDO DIRIGIDO (Valor = 4,0 pontos) 
 
Thalles Mercês Carreiro - 83020 - Turma teórica 1 
 
1. Discuta como você desenvolveria um meio seletivo ou um meio mínimo 
para um microrganismo em particular. Suponha uma bactéria Gram positiva 
e formadora de esporos originária de solo. 
 
R: 
Um meio seletivo poderia ser utilizado a partir de substâncias que inibissem o 
crescimento de bactérias gram negativas. Para o caso de bactérias gram positivas 
esporulantes, além de se utilizar o meio seletivo, poderiam ser utilizados métodos de 
seleção como o choque térmico. Expor o meio de cultura a uma diferença brusca de 
temperatura faria com que as bactérias de interesse esporulassem e portanto, 
sobrevivesse à condição de estresse, enquanto outras morreriam. 
 
2. Discuta e exemplifique a afirmação: “A taxa de crescimento microbiano 
depende da qualidade do meio, mas o produto do crescimento (a biomassa 
máxima que uma cultura atinge) depende da quantidade de nutrientes no 
meio”. 
 
A taxa de crescimento microbiano depende, conforme a equação de Michaelis–
Menten (que descreve o crescimento de células de uma cultura), da concentração 
de substratos no meio, e não da sua quantidade absoluta. Já a quantidade de 
biomassa produzida está associada ao coeficiente estequiométrico da reação de 
síntese de células, que relaciona essencialmente a massa de substrato disponível 
com a quantidade de células produzidas. 
 
O exemplo mais conhecido é da Escherichia coli que cresce até 10 vezes mais 
rápido em um meio rico, ou seja, com alta concentração de nutrientes. No pobre ela 
tem de sintetizar maior número de células pequenas e isso caracteriza uma 
diminuição da sua taxa de crescimento. 
 
3. Com relação aos métodos para enumeração de microrganismos, responda: 
 
a) Por que a contagem de colônias em placas resulta em números muito 
menores (Ex. 106 UFC/g) que a contagem direta ao microscópio (Ex. 109 
células/ g) para uma mesma amostra? 
 
A contagem direta ao microscópio também contabiliza microorganismos mortos, 
além de ter uma incerteza sobre a contagem de microorganismos móveis. A 
contagem em placas apenas contabiliza microorganismos que formam colônias 
(ou seja, vivos). Por isso há uma divergência entre os resultados. 
 
b) Discuta sobre a denominada “Grande Anomalia da Contagem de Colônias 
em Placas” e sobre as principais fontes de erro da técnica de contagem de 
colônias em placas? 
 
 A Grande Anomalia da Contagem de Colônias em Placas consiste no fato de que 
muitos microorganismos numa amostra não sobrevivem nas condições in vitro. Seja 
pelo seu baixo número ou concentração, seja por exigirem condições especiais de 
crescimento, é notável a divergência entre os resultados obtidos em laboratório com 
os esperados para uma população microbiana de uma amostra de água ou solo. 
Estima-se que uma contagem de células de uma amostra diversificada represente 
apenas 0.1% do número de células real. 
 Possíveis fontes de erro são: contagem errada por parte do indivíduo que conta, 
sendo que este erro pode ser reduzido utilizando um contador e algo para marcar as 
colônias contadas, como por exemplo, uma caneta. Além disso, a diluição da 
amostra pode subestimar o número de unidades formadoras de colônia. Outra fonte 
de erro é a não homogeneização das amostras e diluições, que podem superestimar 
ou subestimar a quantidade de unidades formadoras de colônia, devido a ocorrência 
de gradientes de concentração. 
 
c) Compare as vantagens e desvantagens dos métodos de contagem de 
colônias em placas por spread plate e por pour plate e contagem direta ao 
microscópio. (se preferir, faça uma quadro comparativo) 
 
Spread plate: consiste em se fazer a inoculação do microrganismo por esfregaço na 
superfície do meio. O esfregaço é feito na superfície sólida do meio, muitas vezes 
com a ajuda de uma alça de Drigalski, enquanto a segunda é realizada por meio de 
um esfregaço em uma placa de Petri esterilizada e em sequência derramamento do 
meio de cultura em estado líquido sobre os microrganismos. Apresenta erros devido 
ao manuseio inadequado da alça de Drigalski o que causa muitas vezes o 
rompimento da película do meio de cultura. Outro fator é o não resfriamento da alça 
após a esterilização e contato direto com os microrganismos causando a morte dos 
mesmos. Erros de contagem podem ser associados à não diferenciação das células. 
 
 
Por plate: consiste na inoculação de culturas por profundidade. A cultura é 
despejada na placa de Petri, seguidamente do meio de cultura em estado semi-
líquido. Sua homogeinização é feita em seguida com movimentos circulares (em 
forma de oito). Os erros mais comuns são relativos as técnicas de assepsia, 
resfriamento da alça replicadora e do movimento inadequado na finalização do 
método, o que pode causar derramamento de material etc. Neste método há 
crescimento de células tanto na superfície quanto no fundo da placa. Alguns 
organismos que são menos tolerantes a temperaturas um pouco mais elevadas, 
acabam sofrendo dano quando se despeja o meio de cultura na forma líquida 
(geralmente na temperatura de 50ºC). A presença de células tanto na superfície 
quando no fundo da placa pode causar muitas vezes confusão na hora da 
contagem, gerando duplicação de resultados ou algumas vezes omissão. 
 
Ambas as técnicas de anteriores apresentam a desvantagem de necessitar de um 
tempo longo de incubação (24h ou mais, dependendo do tipo de microrganismo). 
 
Na contagem direta ao microscópio, uma quantidade conhecida de volume é 
colocada em lâminas especiais e é feito uma contagem no aparelho. Para este 
método não há a necessidade de incubação da amostra e, portanto, os resultados 
podem ser obtidos na hora. No entanto, há dificuldade para se contabilizar células 
que possuem movimento e algumas células mortas podem ser confundidas com 
viáveis e entrarem na contagem. Outro problema é a necessidade de uma 
quantidade grande de células para se realizar a contagem (cerca de 10 milhões de 
células por ml). 
 
 
4. Considere os dados da tabela. 
Organismo Condições Taxa de 
crescimento (h
-1
) 
Tempo de geração 
(h) 
 
 
Bactéria 
Ótima (meio rico e 
temperatura 37°C) 
2,3 0,3 
Limitação de nutrientes 0,23 3,46 
Meio rico e temperatura 5ºC 0,023 30 
Fungos 
Filamentosos 
Ótima (meio rico e 
temperatura 25°C) 
0,1-0,3 6,9-20 
 
a) Considerando um número inicial de células de bactéria de 100 na condição 
ótima de crescimento qual seria a população alcançada após 6 horas de 
crescimento? 
 
O crescimento bacteriano segue a seguinte expressão exponencial: 
 
 
 
Onde: 
 
 
 
 
 
 
Assim: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
b) Por que os fungos crescem mais lentamente que a maioria das bactérias? 
 
Os fungos diferentemente das bactérias não crescem por bipartição. Esses 
microrganismos dependem da esporulação para se reproduzir. Já as bactérias 
são seres unicelulares e não possuem grande complexidade morfológica. Sendo 
assim, o metabolismo mais simples e rápido das bactérias permite que estas 
cresçam mais rapidamente que fungos. 
 
c) Represente num gráfico semilogarítmico a curva de crescimento desta 
bactéria na condição ótima e em limitação de nutrientes, considere o N0 
igual a 10 células. 
 
O gráfico que ilustra o crescimento bacteriano em questão segue abaixo:d) Explique porque o crescimento de bactéria em temperatura de refrigeração 
como a 5°C é muito mais lento mesmo em meio rico. 
Observação: Meio rico significa uma meio com ingredientes que fornecem 
vários fatores orgânicos de crescimento como vitaminas e aminoácidos 
como ocorre pela adição de extratos de carne, leveduras ou peptonas. 
 
Esta bactéria em específico não apresenta alta taxa de metabolismo quando exposta 
a temperaturas de refrigeração. Podemos dizer não só que esta bactéria não faz 
parte dos Psicrófilos, como também que a temperatura influencia mais no 
metabolismo microbiano que a disponibilidade de nutrientes. 
 
 
5. Após a realização de uma análise microbiológica de duas amostras de 
alimentos por contagem de colônias em placas obteve-se os resultados 
mostrados na tabela abaixo. Calcule a densidade populacional de 
microrganismos: 
 Nº de colônias UFC/g 
Diluições 
10
-1
 10
-2
 10
-3
 10
-4
 10
-5
 
Amostras 
1 > 300 > 300 > 300 245 16 
> 300 > 300 > 300 257 23 
2 438 38 3 0 0 
394 42 6 0 0 
3 > 300 > 300 159 21 0 
> 300 > 300 163 18 2 
4 > 300 296 32 4 0 
> 300 282 22 5 0 
Observação: Para pelo menos uma das amostras mostrar como o cálculo foi feito. 
 
Para o cálculo de unidades formadoras de colônia numa amostra, devemos utilizar o 
valor dentro da faixa aceita (25-300 colônias) na menor diluição. Os cálculos 
devidos seguem abaixo (valores em UFC/g): 
 
 
 
 
 
 
 
 
1) 
 
 
 
 
 
 
2) 
 
 
 
 
 
 
3) 
 
 
 
 
 
 
4) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6. Estima-se que um frasco de leite fermentado (tipo Yakult) apresente 10
7 
de 
Lactobacillus vivos por mL. 
a) Qual seria a diluição decimal que possibilitaria a contagem pelo método 
de contagem de colônias em placas pela técnica pour plate utilizando 
alíquota de 1 mL se a informação do rótulo estiver correta? 
 
Sendo o máximo de colônias por mL na análise igual a 300, temos, com segurança: 
 
UFC máximo = 250 UFC/mL 
UFC da amostra = 10 000 000 UFC/mL 
FD = 
 
 
 = 
Como sabemos que o fator de diluição (FD) é , a diluição deve ser de . 
 
 
b) Suponha que você tenha somente seis placas com meio de cultura e 
faça o plaqueamento em duplicata para confirmar esta informação. Que 
outras duas diluições você utilizaria para estimar a população de 
Lactobacillus? 
 
Diluições de e de . para que ainda seja possível a contagem dos 
microrganismos na amostra dentro da faixa aceita (25-300). A fim de evitar erros, os 
plaqueamentos seriam feitas em duplicata. 
 
7. Explique o princípio da técnica da determinação da densidade óptica para 
se construir a curva de crescimento de uma espécie de bactéria e discuta a 
necessidade de uma curva padrão para se utilizar esta técnica na 
determinação da densidade populacional.. 
 
A utilização da densidade óptica consiste em analise o grau de turbidez de uma 
amostra líquida contendo microoganismos. Quanto maior a concentração de 
microorganismos, mais turva a solução e maior sua absorbância, quando lida num 
espectrofotômetro. Através de uma relação logarítmica, é possível relacionar-se o 
crescimento bacteriano com a turbidez da solução. Sua importância se dá porque 
através de várias medições de absorbância (o suficiente para se padronizar uma 
curva) é possível estimar a concentração de células de uma amostra desconhecida 
por regressão linear. 
 
 
8. Desenhe o gráfico resultante de uma curva de crescimento de Escherichia 
coli em caldo nutriente a 37°C por 8 horas, considerando uma população 
inicial de 20 células e tempo de geração de 20 minutos. Dados de curva 
padrão de E. coli determinada por DO a 600 nm X Contagem em placa: 
a) Elabore com os dados abaixo uma regressão linear e mostre a equação da 
correlação entre D.O. e Log UFC/mL 
b) Qual é a taxa de crescimento da bactéria nesta condição? 
UFC/mL D.O. 
1 x 102 0,12 
6 x 102 0,25 
2 x 103 0,42 
8 x 103 0,54 
5 x 104 0,65 
2,4 x 105 0,78 
6,4 x 106 0,94 
 
a) O gráfico linearizado segue abaixo. 
 
b) Taxa de crescimento = 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
y = 5.5962x + 1.1659 
R² = 0.9766 
0 
1 
2 
3 
4 
5 
6 
7 
8 
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 
UFC/mL x DO