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FACULDADE DE MEDICINA – CENTRO DE CIÊNCIAS DA VIDA – PUC-Campinas DISCIPLINA DE BASES MORFOFISIOLÓGICAS DO SISTEMA NERVOSO, SENSORIAL E LOCOMOTOR BIOQUÍMICA A – AULA PRÁTICA 9 – (16 e 18 de maio) Profa. Dra. Celene Fernandes Bernardes AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DA ENZIMA AMILASE SALIVAR – EFEITO DO pH E DA TEMPERATURA A enzima -amilase salivar, em condições específicas de pH 6.8 e temperatura 37 C, catalisa a hidrólise das ligações osídicas -1-4 da cadeia glicosídica do polissacarídeo amido. A hidrólise do amido, catalisada pela -amilase, é considerada parcial e os produtos resultantes são uma mistura de moléculas de glicose, maltose e dextrina limite. Dextrina limite é um tipo de glicosana não degradável pela ação catalisadora da -amilase salivar devido apresentar ligações osídicas do tipo -1,6 nas extremidades das cadeias. A hidrólise das ligações osídicas -1,6 pode ser catalisada pela enzima intestinal específica amilo-1,6-glicosidase. A hidrólise do amido pode ser evidenciada na presença de iodo. Devido à hidrólise, o tamanho da cadeia glicosídica do amido diminui e a reação com o iodo não ocorre, deixando de ser evidente a coloração azul arroxeada característica de amido na presença de iodo. Amido + iodo – cor azul Amilodextrina + iodo – cor roxa Eritrodextrina + iodo – cor vermelha Acrodextrina + iodo – cor amarela escuro Maltose + iodo – cor amarela Glicose + iodo – cor amarela A atividade enzimática de hidrólise do polissacarídeo amido, pela enzima amilase salivar, pode ser evidenciada em condições ideais de temperatura (37 C) e pH 6,8. O efeito da temperatura sobre a velocidade das reações enzimáticas é duplo. A velocidade da reação aumenta com o aumento da temperatura até que um máximo seja atingido, num mecanismo denominado de ativação térmica. Acima da temperatura de atividade enzimática máxima, ocorre diminuição da velocidade da reação devido ao processo de desnaturação protéica. As enzimas apresentam atividade máxima em um determinado valor ou faixa de pH, denominado de pH ótimo. A variação do pH afeta o caráter iônico dos grupos carboxila e amina dos aminoácidos, o que pode acarretar alteração da conformação da molécula e impedir a ligação do substrato no sítio ativo da enzima, alterando a atividade. Reagentes Procedimentos e resultados Parte A - Coleta da enzima: Coletar 1,0 mL de saliva e diluir na proporção 1:4 com tampão fosfato pH 6.8 (1,0 mL de saliva + 3,0 mL de tampão). Reservar a saliva diluída para ser utilizada em etapas posteriores. Parte B - Caracterização de padrões: 1. Identificar 2 tubos de ensaio e proceder conforme esquema abaixo: RESULTADOS Tubo 1 Padrão de não hidrólise 2,0 mL de amido 2 gotas do Reativo de Lugol Tubo 2 Padrão de hidrólise total 2,0 mL de glicose 2 gotas do Reativo de Lugol 3. Homogeneizar e observar. 4. Coloração azul-arroxeada evidencia a formação de complexo de iodo com o polissacarídeo amido, caracterizando um padrão indicativo de que não ocorreu hidrólise . 5. Coloração amarela caracteriza padrão de hidrólise total do amido. 6. Reservar os tubos para comparação com a análise das amostras a seguir. Parte C - Avaliação do efeito do pH na atividade enzimática 1. Identificar 3 tubos de ensaio e proceder conforme esquema abaixo: Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 2,0mL amido 2,0mL amido 2,0mL amido 2,0mL tampão fosfato pH6,8 2,0mL HCl 2,0mL NaOH 500 L saliva 500 L saliva 500 L saliva 20 minutos em banho-maria a 37 C 2 gotas reativo lugol 2 gotas reativo lugol 2 gotas reativo lugol (ou quantidade suficiente para observar coloração) 2. Agitar e observar a coloração. 3. Comparar com a coloração das soluções padrões e verificar a hidrólise de cada amostra. Tubos Condições Experimentais RESULTADOS 1 amido + enzima – pH 6,8 – 37 C 2 amido + enzima – pH ácido - 37 C 3 amido + enzima – pH básico – 37 C Parte D - Avaliação do efeito da temperatura na atividade enzimática 1. Identificar 3 tubos de ensaio e proceder conforme esquema abaixo: Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 2,0mL amido 2,0mL amido 2,0mL amido 2,0mL tampão fosfato pH6,8 2,0mL tampão fosfato pH6,8 2,0mL tampão fosfato pH6,8 5 minutos a 37 C 5 minutos gelo 5 minutos água fervente 500 L saliva 500 L saliva 500 L saliva 20 minutos a 37 C 20 minutos gelo 20 minutos água fervente 2 gotas reativo lugol 2 gotas reativo lugol 2 gotas reativo lugol 2. Agitar e observar a coloração. 3. Comparar com a coloração das soluções padrões e verificar a hidrólise de cada amostra. Tubos Condições Experimentais RESULTADOS 1 amido + saliva - 20 minutos – pH 6,8 – 37 C 2 amido + saliva - 20 minutos – pH 6,8 – gelo 3 amido + saliva - 20 min. – pH 6,8 – água fervente
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