Roteiro Determinação proteínas (1)
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Roteiro Determinação proteínas (1)


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BROMATOLOGIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS
Profs. Maria Lucia Cocato 
DETERMINAÇÃO DO TEOR DE PROTEÍNA ATRAVÉS DA FRAÇÃO NITROGENADA (MÉTODO DE KJELDAHL)
A - INTRODUÇÃO
As proteínas são substâncias orgânicas complexas compostas de hidrogênio, carbono, nitrogênio, oxigênio combinados entre si em diferentes proporções, ligados ou não a outros elementos como ferro, fósforo, iodo e enxofre. 
Os aminoácidos são as unidades básicas de uma proteína.Todos os aminoácidos possuem um grupamento carboxílico livre e um grupo amino livre no átomo de carbono (. Eles diferem uns dos outros na estrutura de suas cadeias laterais distintas denominadas grupamentos R.
	 H
			 I
		R \u2013 C \u2013 C - COOH	 	Porção comum a todos os aminoácidos
		 I
			 NH2
As proteínas são os maiores constituintes de toda célula viva, e cada uma delas, de acordo com sua estrutura molecular, tem uma fração biológica associada às atividades vitais. 
Nos alimentos, além da função nutricional, as proteínas têm propriedades organolépticas. Podem vir combinadas com lipídeos e carboidratos. 
O processo mais correntemente empregado para estimar a quantidade de proteína presente nos alimentos é o método de Kjeldahl, para o qual, inúmeras modificações de técnica têm sido propostas. A tabela abaixo apresenta as quantidades de proteína nos vários tipos de alimentos (o conteúdo de proteína = N x 6,25%):
Origem animal
	Carne Assada
Ovo Integral
Leite integral
	25%
13%
3,5%
Origem vegetal
	Soja
Amendoim
Farinha de trigo
Batata
Arroz integral
Milho
Arroz polido
Maçã:
	33-42%
25-28%
9,8-13,5%
10-13%
7,5-9,0%
7 \u2013 9,4%
5,2-7,6%
0,3%
Metodologia
O procedimento mais comum para a determinação de proteína é através da determinação de um elemento ou um grupo pertencente à proteína. A conversão para o conteúdo de proteína é feita através de um fator. Os elementos analisados geralmente são carbono ou nitrogênio, e os grupos são aminoácidos e ligações peptídicas.
	A análise de nitrogênio é a determinação mais utilizada. O método foi proposto por Kjeldahl na Dinamarca em 1883, quando estudava proteínas em grãos. O método original sofreu várias modificações, mas continua sendo ainda o mais utilizado. Este método quantifica o teor de nitrogênio de origem orgânica, isto é, o N protéico e não protéico orgânico. Assim, o nitrogênio proveniente de fontes além da proteína, tais como ácidos nucléicos, alcalóides, lipídeos nitrogenados, carboidratos nitrogenados, porfirinas ou pigmentos nitrogenados, também é quantificado. Estes, no entanto, são, geralmente, componentes menores. A razão entre o nitrogênio medido e a proteína estimada depende do tipo de amostra e de outros fatores. Por exemplo, no trigo esta razão é afetada pela variedade, condições de crescimento e quantidade e tipo de fertilizante utilizado. Considera-se que o teor de nitrogênio presente em uma proteína represente em média 16% do seu peso. Desta forma, o valor do nitrogênio total obtido é multiplicado pelo fator 6.25 para estimar a % de proteína na amostra analisada. 
 16 g N 	 100 g proteínas
 			 n g N	 x g proteínas	
x = n . 100 = n . 6,25 g proteínas
				 16
Pode-se usar fatores específicos para cada tipo de amostra:
	Fator geral
Ovos
Produtos lácteos
Carnes
	6,25
6,68
6,38
6,25
	Soja
Arroz
Farinha de trigo
Gelatina
	6,00
5,95
5,70
5,55
Se o resultado for dado em % de proteína, o fator usado deverá ser indicado. Atualmente, costuma-se expressar a % de nitrogênio nos relatórios de análises, em lugar da % de proteína. 
Os alimentos protéicos, de um modo geral, são aqueles que apresentam um teor alto deste nutriente. As carnes e pescados são os principais alimentos protéicos apresentando entre 10 e 20% desta fração.
As leguminosas em geral podem conter até cerca de 20% de proteína, entretanto, as hortaliças e frutas são geralmente pobres e com um teor oscilando em torno de 0,1 a 1,5%.
B \u2013 FUNDAMENTO
	O método baseia-se na transformação do nitrogênio orgânico das substâncias nitrogenadas em sulfato de amônio, por ebulição em ácido sulfúrico (digestão ácida) e na presença de catalisadores (compostos que aumentam a velocidade da reação e não são consumidos). O sulfato de amônio é tratado com hidróxido de sódio em excesso, liberando amônia sob a forma de hidróxido de amônio. A amônia é destilada, recolhida em ácido bórico (que forma um complexo instável de dihidroborato de amônio) e titulada com solução padrão de ácido clorídrico.
Digestão - Durante a fase de digestão, coloca-se no tubo de kjeldahl a amostra embrulhada, de preferência, em papel impermeável, juntamente com a mistura digestora e o ácido sulfúrico concentrado. Faz - se o aquecimento em chapa elétrica, e, provavelmente as seguintes reações são observadas:
 Amostra 	 H2SO4							 || 
Matéria orgânica	 			SO2 + CO2 + H2O + R - NH2 + R-C \u2013 NH2
 (N orgânico)		 (								
			 H2SO4
R - NH2 + H2O				 R - OH + NH3
			 (
 || 			 [H + ]		 ||
R \u2013 C- NH2 + H2O 			R - C - OH + NH3
 		 (		 
2 NH3 + H2SO4 				(NH4)2 SO4 
O carbono contido na matéria orgânica é oxidado e o CO2 produzido se desprende. No final da digestão o material fica completamente claro depois de passar por uma fase bastante escura, no início da digestão. Além dos grupamentos protéicos, existe nitrogênio sob a forma de amina, amida e nitrila, que é transformado em NH3. Esta NH3 formada reage com o H2SO4, formando (NH4)2 SO4, conforme acima representado. O sulfato de amônio, que fica no tubo, ao se esfriar forma cristais.
Destilação - É a fase que sucede à digestão. Pode ser realizada por aquecimento direto ou por arraste a vapor, sendo preferível este último. O sulfato de amônio é tratado com NaOH 50%, em excesso, ocorrendo à liberação de amônia, conforme abaixo representado:
(NH4)2 SO4 + 2 NaOH 		 2NH4OH + Na2SO4
				 (
NH4OH NH3 + H2O
		 (
Ao se adicionar o NaOH a 50%, pode-se usar algumas gotas de fenolftaleína, no destilador, para garantir um ligeiro excesso de base. A amônia desprendida é então recebida em um erlenmeyer contendo ácido bórico com indicador, previamente adaptado ao conjunto de destilação.
NH3 + H3BO3 		 NH4H2BO3
Considera - se terminado o processo, quando toda a amônia já se desprendeu. O ácido bórico + indicador que, no início, era cor de rosa, adquire cor verde, à medida que vai se formando o NH4H2BO3.
 
Titulação - É a última fase. O NH4H2BO3 ,é titulado com uma solução padronizada de HCl 0,02 Mol/L até o ponto de viragem do indicador.
NH4H2BO3 + HCl 			 H3BO3 + NH4Cl
Teste em branco - sempre se faz um teste em branco, usando-se ou não a sacarose no lugar da amostra com a finalidade de descontar a presença de qualquer resíduo de nitrogênio proveniente do papel no qual a amostra está embrulhada ou de quaisquer um dos reagentes utilizados.. 
C \u2013 MATERIAL
tubo de micro-Kjeldahl de 100 mL.			
espátula para pesagem
pinça metálica
2 provetas de 25 mL
papel de pesagem (papel vegetal livre de nitrogênio) \u2013 dimensão 5 x 5 cm
provetas de 50, 100 e 250 mL
erlenmeyer de 125 mL
bureta de 25 mL
suporte para bureta
garra para bureta
béquer de 50 mL
béquer de 250 mL
pipetas volumétricas de 2, 10 e 50 mL
pró-pipeta
pipeta graduada de 1 mL
estante para tubos de micro \u2013 Kjeldahl
pisseta com água destilada
barra