Roteiro Determinação proteínas (1)

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BROMATOLOGIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS
Profs. Maria Lucia Cocato 
DETERMINAÇÃO DO TEOR DE PROTEÍNA ATRAVÉS DA FRAÇÃO NITROGENADA (MÉTODO DE KJELDAHL)
A - INTRODUÇÃO
As proteínas são substâncias orgânicas complexas compostas de hidrogênio, carbono, nitrogênio, oxigênio combinados entre si em diferentes proporções, ligados ou não a outros elementos como ferro, fósforo, iodo e enxofre. 
Os aminoácidos são as unidades básicas de uma proteína.Todos os aminoácidos possuem um grupamento carboxílico livre e um grupo amino livre no átomo de carbono (. Eles diferem uns dos outros na estrutura de suas cadeias laterais distintas denominadas grupamentos R.
	 H
			 I
		R – C – C - COOH	 	Porção comum a todos os aminoácidos
		 I
			 NH2
As proteínas são os maiores constituintes de toda célula viva, e cada uma delas, de acordo com sua estrutura molecular, tem uma fração biológica associada às atividades vitais. 
Nos alimentos, além da função nutricional, as proteínas têm propriedades organolépticas. Podem vir combinadas com lipídeos e carboidratos. 
O processo mais correntemente empregado para estimar a quantidade de proteína presente nos alimentos é o método de Kjeldahl, para o qual, inúmeras modificações de técnica têm sido propostas. A tabela abaixo apresenta as quantidades de proteína nos vários tipos de alimentos (o conteúdo de proteína = N x 6,25%):
Origem animal
	Carne Assada
Ovo Integral
Leite integral
	25%
13%
3,5%
Origem vegetal
	Soja
Amendoim
Farinha de trigo
Batata
Arroz integral
Milho
Arroz polido
Maçã:
	33-42%
25-28%
9,8-13,5%
10-13%
7,5-9,0%
7 – 9,4%
5,2-7,6%
0,3%
Metodologia
O procedimento mais comum para a determinação de proteína é através da determinação de um elemento ou um grupo pertencente à proteína. A conversão para o conteúdo de proteína é feita através de um fator. Os elementos analisados geralmente são carbono ou nitrogênio, e os grupos são aminoácidos e ligações peptídicas.
	A análise de nitrogênio é a determinação mais utilizada. O método foi proposto por Kjeldahl na Dinamarca em 1883, quando estudava proteínas em grãos. O método original sofreu várias modificações, mas continua sendo ainda o mais utilizado. Este método quantifica o teor de nitrogênio de origem orgânica, isto é, o N protéico e não protéico orgânico. Assim, o nitrogênio proveniente de fontes além da proteína, tais como ácidos nucléicos, alcalóides, lipídeos nitrogenados, carboidratos nitrogenados, porfirinas ou pigmentos nitrogenados, também é quantificado. Estes, no entanto, são, geralmente, componentes menores. A razão entre o nitrogênio medido e a proteína estimada depende do tipo de amostra e de outros fatores. Por exemplo, no trigo esta razão é afetada pela variedade, condições de crescimento e quantidade e tipo de fertilizante utilizado. Considera-se que o teor de nitrogênio presente em uma proteína represente em média 16% do seu peso. Desta forma, o valor do nitrogênio total obtido é multiplicado pelo fator 6.25 para estimar a % de proteína na amostra analisada. 
 16 g N 	 100 g proteínas
 			 n g N	 x g proteínas	
x = n . 100 = n . 6,25 g proteínas
				 16
Pode-se usar fatores específicos para cada tipo de amostra:
	Fator geral
Ovos
Produtos lácteos
Carnes
	6,25
6,68
6,38
6,25
	Soja
Arroz
Farinha de trigo
Gelatina
	6,00
5,95
5,70
5,55
Se o resultado for dado em % de proteína, o fator usado deverá ser indicado. Atualmente, costuma-se expressar a % de nitrogênio nos relatórios de análises, em lugar da % de proteína. 
Os alimentos protéicos, de um modo geral, são aqueles que apresentam um teor alto deste nutriente. As carnes e pescados são os principais alimentos protéicos apresentando entre 10 e 20% desta fração.
As leguminosas em geral podem conter até cerca de 20% de proteína, entretanto, as hortaliças e frutas são geralmente pobres e com um teor oscilando em torno de 0,1 a 1,5%.
B – FUNDAMENTO
	O método baseia-se na transformação do nitrogênio orgânico das substâncias nitrogenadas em sulfato de amônio, por ebulição em ácido sulfúrico (digestão ácida) e na presença de catalisadores (compostos que aumentam a velocidade da reação e não são consumidos). O sulfato de amônio é tratado com hidróxido de sódio em excesso, liberando amônia sob a forma de hidróxido de amônio. A amônia é destilada, recolhida em ácido bórico (que forma um complexo instável de dihidroborato de amônio) e titulada com solução padrão de ácido clorídrico.
Digestão - Durante a fase de digestão, coloca-se no tubo de kjeldahl a amostra embrulhada, de preferência, em papel impermeável, juntamente com a mistura digestora e o ácido sulfúrico concentrado. Faz - se o aquecimento em chapa elétrica, e, provavelmente as seguintes reações são observadas:
 Amostra 	 H2SO4							 || 
Matéria orgânica	 			SO2 + CO2 + H2O + R - NH2 + R-C – NH2
 (N orgânico)		 (								
			 H2SO4
R - NH2 + H2O				 R - OH + NH3
			 (
 || 			 [H + ]		 ||
R – C- NH2 + H2O 			R - C - OH + NH3
 		 (		 
2 NH3 + H2SO4 				(NH4)2 SO4 
O carbono contido na matéria orgânica é oxidado e o CO2 produzido se desprende. No final da digestão o material fica completamente claro depois de passar por uma fase bastante escura, no início da digestão. Além dos grupamentos protéicos, existe nitrogênio sob a forma de amina, amida e nitrila, que é transformado em NH3. Esta NH3 formada reage com o H2SO4, formando (NH4)2 SO4, conforme acima representado. O sulfato de amônio, que fica no tubo, ao se esfriar forma cristais.
Destilação - É a fase que sucede à digestão. Pode ser realizada por aquecimento direto ou por arraste a vapor, sendo preferível este último. O sulfato de amônio é tratado com NaOH 50%, em excesso, ocorrendo à liberação de amônia, conforme abaixo representado:
(NH4)2 SO4 + 2 NaOH 		 2NH4OH + Na2SO4
				 (
NH4OH NH3 + H2O
		 (
Ao se adicionar o NaOH a 50%, pode-se usar algumas gotas de fenolftaleína, no destilador, para garantir um ligeiro excesso de base. A amônia desprendida é então recebida em um erlenmeyer contendo ácido bórico com indicador, previamente adaptado ao conjunto de destilação.
NH3 + H3BO3 		 NH4H2BO3
Considera - se terminado o processo, quando toda a amônia já se desprendeu. O ácido bórico + indicador que, no início, era cor de rosa, adquire cor verde, à medida que vai se formando o NH4H2BO3.
 
Titulação - É a última fase. O NH4H2BO3 ,é titulado com uma solução padronizada de HCl 0,02 Mol/L até o ponto de viragem do indicador.
NH4H2BO3 + HCl 			 H3BO3 + NH4Cl
Teste em branco - sempre se faz um teste em branco, usando-se ou não a sacarose no lugar da amostra com a finalidade de descontar a presença de qualquer resíduo de nitrogênio proveniente do papel no qual a amostra está embrulhada ou de quaisquer um dos reagentes utilizados.. 
C – MATERIAL
tubo de micro-Kjeldahl de 100 mL.			
espátula para pesagem
pinça metálica
2 provetas de 25 mL
papel de pesagem (papel vegetal livre de nitrogênio) – dimensão 5 x 5 cm
provetas de 50, 100 e 250 mL
erlenmeyer de 125 mL
bureta de 25 mL
suporte para bureta
garra para bureta
béquer de 50 mL
béquer de 250 mL
pipetas volumétricas de 2, 10 e 50 mL
pró-pipeta
pipeta graduada de 1 mL
estante para tubos de micro – Kjeldahl
pisseta com água destilada
barramagnética
cálice de vidro graduado (capacidade 30 mL)
papel toalha
D – REAGENTES
ácido sulfúrico concentrado d = 1,840 g/L (isento de Nitrogênio)
mistura catalítica:
Sulfato de potássio p.a., sulfato de sódio p.a. ou bissulfato de potássio p.a. (isento de Nitrogênio)
Sulfato de cobre penta hidratado p.a. (isento de Nitrogênio)
Selênio metálico em pó 
Misturar (a), (b) e (c) na proporção de 100:2,5:0,8, triturando em gral de porcelana até obter um pó fino.
solução de hidróxido de sódio a 50 % (p/v). Filtrar, se necessário, usando lã de vidro e acondicionar em frasco de polietileno. Preparar 1000 mL
indicador misto:
 vermelho de metila/verde de bromocresol - Pesar 0,132 g de vermelho de metila e 0,06 de verde de bromocresol. Dissolver em 200 mL de álcool etílico a 70% (v/v). Filtrar, se necessário e guardar em frasco âmbar. Obs.: este indicador poderá ser incorporado à solução de ácido bórico a 5% na proporção de 8 mL por litro
Solução de ácido bórico a 5% (p/v) (Micro-Kjeldahl): pesar em balança semi-analítica 25 g de ácido bórico p.a., transferir para um béquer de 250 mL e adicionar 80 mL de água, aquecer sob agitação branda até dissolução. Resfria e transferir para balão volumétrico de 500 mL. Acrescentar 4 mL de Indicador Misto e completar com água. Filtrar, se necessário.
Solução padrão de ácido clorídrico 0,02 Mol/L padronizada.
Vaselina sólida
E - EQUIPAMENTOS
balança analítica
balança semi-analítica
aparelho ou bloco digestor e destilador de Macro ou Micro-Kjeldahl
agitador magnético
F – PROCEDIMENTO
Micro-Kjeldahl
Digestão 
A tomada de ensaio, deverá ser baseada no teor protéico teórico da amostra. Pese entre 70 a 80 mg de amostra em papel manteiga ou vegetal de 5x5 cm. O peso máximo de matéria orgânica seca recomendado para este método é de 100 mg. (ANOTAR)
Transferir a amostra para o tubo de Kjeldahl embrulhada no papel de pesagem.
Adicionar de 1,8 a 2,0 g da mistura catalítica.
Adicionar 5,0 mL de H2SO4 concentrado.
Obs.: Inserir a amostra e os reagentes no fundo do tubo de kjeldahl sem tocar nas paredes.
Aquecer em bloco digestor, a princípio, lentamente, mantendo a temperatura de 50(C por uma hora ou dependendo das instruções do fabricante do bloco digestor. Em seguida, elevar gradativamente a temperatura até atingir 375( C. 
O tempo gasto na digestão depende da amostra e do digestor, sendo que varia de 1 a 3 horas. O final da digestão é indicado, quando o material contido no tubo de Kjeldahl ficar transparente. Neste momento aguardar mais 30 minutos para desligar o bloco digestor. 
Esfriar, adicionar a mínima quantidade necessária de água destilada para dissolver os sólidos (cerca de 10 mL).
Fechar os tubos com parafilme e guarda-los para a destilação
Obs.: Para produtos muito gordurosos, digerir a amostra com adição de um anti-espumante.
Destilação 
Passar uma fina camada de vaselina na borda do tubo de Kjeldahl.
Proceder ao aquecimento prévio do destilador de nitrogênio.
Verificar se a água de rua está fluindo (pelo condensador e para o dreno).
Verificar o nível da caldeira.
Com a torneira de soda fechada, completar o nível do copo dosador com 20 mL de hidróxido de sódio a 50%.
Colocar um erlenmeyer graduado de 125 mL contendo a solução coletora (10 mL de ácido bórico a 5% com indicador misto) na mesa de destilado.
Abaixar o macaco, ajustar o tubo ao destilador. Não forçar o ajuste para não quebrar o tubo.
Adicionar com cuidado a solução de hidróxido de sódio a 50%, abrindo a torneira dosadora até que a solução do tubo se torne negra (cerca de 20 mL). 
Fechar a torneira de soda e ligar a chave de aquecimento da resistência para iniciar a destilação. Ajustar o potenciômetro para uma posição adequada de destilação.
Proceder à destilação até recolher cerca de 75 mL de destilado. A solução receptora deve ser mantida fria durante a destilação.
Retirar o erlenmeyer, lavando o bico do condensador com água destilada.
Desligar a chave de aquecimento, aguardar até que a ebulição cesse e retire o tubo de Kjeldahl com luva de amianto ou pano.
Obs.: Cuidado entre uma destilação e outra, sempre verificar o nível da caldeira (através da janela de nível da caldeira), operando sempre o comando de nível e o “Led” para enchimento da caldeira.
Titulação
Titule com solução padronizada de ácido clorídrico 0,02 Mol/L até a viragem do indicador para a coloração rósea. 
Faça um branco e calcule a quantidade de N presente na amostra.
Checagem do aparelho
Verificar as condições do aparelho de destilação com solução padrão de sulfato de amônio, cuja recuperação deve ser no mínimo de 99,5% em nitrogênio.
H - RESULTADOS
TABELA - Determinação de Proteínas - Dados e Resultados para cálculo
	
Descrição
	
	
Peso da amostra (g)
	
	
Fator de correção da solução de HCl
	
	
Volume de HCl gasto na titulação do branco (mL)
	
	
Volume de HCl gasto na titulação da amostra (mL)
	
	
Fator de correção (conversão de N ( Proteínas)
	
6,25
	
% de Proteína (Valor Prático)
	
	
% de Proteína (Valor Teórico)
	
	
% de Erro
	
I – BIBLIOGRAFIA
A.O.A.C. Official methods of analysis of A.O.A.C., 14a ed, Washington: Association of Official Analytical Chemists, 1985, p.24-75.
CECCHI, H. M. Fundamentos teóricos e práticos em análise de alimentos. 1a ed. Campinas: UNICAMP, 2001.
INSTITUTO ADOLFO LUTZ – Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. Métodos Químicos e Físicos para Análise de Alimentos, Vol. 1, 3a ed. São Paulo, Inst.Adolfo Lutz, 1985, p.44-45.
POMERANZ, Y. & MELOAN, C.E. Food analysis; theory and practice. The Avi Publishing Company, Inc. 1971.
SILVA, D.J. Análise de alimentos (métodos químicos e biológicos). Viçosa, Imprensa Universitária- UFV, 2004.
J - QUESTIONÁRIO – DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNA
Quais os objetivos (em itens) do experimento?
Qual o método empregado?
Qual é o fundamento da prática realizada?
Especificar a função do branco e de cada reagente empregado.
Qual a refeição analisada? Enumerar alimentos e preparações.
Calcular o teor de proteínas teórico (% proteínas p/p na amostra integral): baseado nos dados de tabelas de composição centesimal de alimentos (Anexo A).
Calcular o teor de proteínas prático obtido no experimento (% proteínas p/p na amostra seca e % de proteínas p/p na amostra integral).
Comparar os teores de proteína: teórico (baseado nos dados de tabelas de composição centesimal) e prático (obtido no experimento). Calcular a % de Erro.
Discutir sobre os prováveis fatores que acarretam discrepâncias entre os resultados teórico e prático.
11. Referências bibliográficas (conforme normas da ABNT). 
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 O
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