Cromatografia princpios Bruno Cortez

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Introdução aos Métodos Cromatográficos
ANÁLISE INSTRUMENTAL
Prof. Bruno Cortez
1º semestre - 2008
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DEFINIÇÃO
Conjunto de técnicas de separação cujo princípio depende da distribuição diferenciada dos componentes de uma mistura entre duas fases, uma considerada estacionária, e a outra, móvel.
 KROMA + GRAPH
 (COR) (ESCREVER)
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DEFINIÇÃO
Diferenças nas propriedades das fases móvel e estacionária possibilitam com que os componentes da amostra se desloquem através do material cromatográfico com velocidades desiguais, gerando a separação
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ANÁLISE CROMATOGRÁFICA
AFINIDADE  SEPARAÇÃO
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PRINCIPAIS FATOS HISTÓRICOS
1897-1903
David Talbot Day
Separação de HC do petróleo
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LÍQUIDA
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TIPOS DE CROMATOGRAFIA
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TIPOS DE SEPARAÇÃO
Os princípios físico-químico básicos de separação são:
Adsorção: O soluto é retido pela superfície da fase estacionária através de interações químicas ou físicas.
Partição: O soluto se dissolve na parte líquida que envolve a superfície do suporte sólido.
Troca iônica: O íon da amostra se liga à carga fixa (grupo funcional) da fase estacionária.
Exclusão moléculas: As moléculas são separadas por tamanho, havendo retenção das maiores.
Bioafinidade: Ocorre uma ligação molecular específica e reversível entre o soluto e o ligante fixado à fase estacionária.
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CROMATOGRAFIA PLANAR
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CROMATOGRAFIA PLANAR
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CROMATOGRAFIA PLANAR
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CROMATOGRAFIA PLANAR
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CROMATOGRAFIA PLANAR
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CROMATOGRAFIA PLANAR
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CROMATOGRAFIA CIRCULAR
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ANÁLISE CROMATOGRÁFICA
Separação em colunas convencionais
Considere a aplicação de uma mistura de compostos orgânicos no topo de uma coluna cromatográfica
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ANÁLISE CROMATOGRÁFICA
Separação em colunas convencionais
Estabelecida a percolação da FE com o eluente (FM), os componentes da mistura passarão a migrar com velocidades desiguais caso o sistema seja adequado para a separação
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ANÁLISE CROMATOGRÁFICA
Separação em colunas convencionais
Uma boa seletividade cromatográfica garantirá uma boa separação entre os componentes da amostra
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ANÁLISE CROMATOGRÁFICA
Separação em colunas convencionais
Cada componente da amostra poderá ser coletado isoladamente, através de um coletor de frações (neste caso, um simples frasco coletor)
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ANÁLISE CROMATOGRÁFICA
Separação em coluna
O monitoramento do eluato da coluna pode ser feito através de um detector, cujo sinal identifica a “saída” de cada componente da mistura, isoladamente
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ANÁLISE CROMATOGRÁFICA
Separação em coluna
A resposta do detector é traduzida em um gráfico, ou CROMATOGRAMA, que relaciona o seu sinal com o tempo necessário para a eluição de cada componente.
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ANÁLISE CROMATOGRÁFICA
Separação em coluna
As moléculas de cada componente também migram com velocidades desiguais devido a fenômenos de difusão e transferência de massa
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ANÁLISE CROMATOGRÁFICA
Eluição típica em cromatografia líquida
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DEFINIÇÃO DE TERMOS
Tempo de retenção
O tempo gasto desde o ato de injeção até a saída do ponto máximo do pico do sistema
O tempo de retenção engloba todo o tempo que o componente em questão fica no sistema cromatográfico, quer na fase móvel quer na fase estacionária
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DEFINIÇÃO DE TERMOS
Tempo de retenção corrigido
Quando as moléculas do soluto ficam na fase móvel, elas devem movimentar-se com a mesma velocidade das moléculas da própria fase móvel.
Parte do tempo em que as moléculas do soluto estão na fase móvel é igual ao tempo gasto para as moléculas da fase móvel percorrerem a coluna, tm
SENDO ASSIM, PARTE DO TEMPO EM QUE AS MOLÉCULAS DO SOLUTO FICAM RETIDAS NA FASE ESTACIONÁRIA É CALCULADA PELA DIFERENÇA
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DEFINIÇÃO DE TERMOS
Seletividade
Para a cromatografia em coluna, o fator de separação (SELETIVIDADE) é calculado pela razão entre os respectivos fatores de retenção que, por sua vez, são relacionados aos tempos de retenção corrigidos
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DEFINIÇÃO DE TERMOS
Seletividade
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DEFINIÇÃO DE TERMOS
Capacidade
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MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
TEORIAS
Martin e Synge – Biochem. J. 35, 1358 (1941)
Meio descontínuo análogo às colunas de destilação fracionada, constituído por um grande número de estágios de equilíbrio ou PRATOS TEÓRICOS (TEORIA DOS PRATOS TEÓRICOS)
Van Deemerter, Zuiderweg e Klinkenberg – Chem. Eng. Sci. 5, 271 (1956)
Meio contínuo através do qual a separação ocorre por fenômenos de difusão e transporte de massa (TEORIA DA VELOCIDADE)
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TEORIA DOS PRATOS TEÓRICOS
Número de pratos teóricos
Coluna cromatográfica definida como uma série de estágios independentes onde acontece um quase-equilíbrio entre o analito dissolvido na fase estacionária (FE) e o gás de arraste
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TEORIA DOS PRATOS TEÓRICOS
Número de pratos teóricos
O coeficiente Kc determina a distribuição da amostra (A) entre as fases móvel (M) e estacionária (S) em um determinado estágio do equilíbrio, obviamente hipotético.
Quanto mais efetiva for a presença de A na fase móvel (M) menor será o seu tempo de retenção
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TEORIA DOS PRATOS TEÓRICOS
Número de pratos teóricos
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TEORIA DOS PRATOS TEÓRICOS
Número de pratos teóricos
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TEORIA DOS PRATOS TEÓRICOS
Cálculo do número de pratos teóricos
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TEORIA DOS PRATOS TEÓRICOS
Altura equivalente à um prato teórico
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DEFINIÇÃO DE TERMOS
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RESOLUÇÃO CROMATOGRÁFICA
Equação geral
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RESOLUÇÃO CROMATOGRÁFICA
Otimização de Separações
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DETECTORES
Definições Gerais
Dispositivos que geram um sinal elétrico proporcional à quantidade eluída de um analito
~60 detectores já usados em CG
~15 equipam cromatógrafos comerciais
4 respondem pela maior parte das aplicações
Detector por Condutividade Térmica DCT
Detector por Ionização em Chama DIC
Detector por Captura de Elétrons DCE
Detector Espectrométrico de Massas EM
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DETECTORES
Parâmetros Básicos de Desempenho
Quantidade Mínima Detectável
Massa de um analito que gera um pico com altura igual a três vezes o nível de ruído
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DETECTORES
Parâmetros Básicos de Desempenho
Limite de Detecção
Quantidade de analito que gera um pico com S/N=3 e wb=1 unidade de tempo
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DETECTORES
Parâmetros Básicos de Desempenho
Velocidade de Resposta
Tempo decorrido entre a entrada do analito na cela do detector e a geração do sinal elétrico
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DETECTORES
Parâmetros Básicos de Desempenho
Sensibilidade
Relação entre o incremento de área do pico e o incremento de massa do analito.
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DETECTORES
Parâmetros Básicos de Desempenho
Faixa Linear Dinâmica
Intervalo de massas dentro do qual a resposta do detector é linear
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DETECTORES
CLASSIFICAÇÃO
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DETECTORES
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA
Princípio: Variação na condutividade térmica do gás quando da eluição de um analito
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DETECTORES
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA
SELETIVIDADE
SENSIBILIDADE/ LINEARIDADE
VAZÃO DO GÁS DE
ARRASTE
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DETECTORES
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA
Configuração tradicional do DCT: bloco metálico com quatro celas interligadas em par – por duas passa o efluente da coluna e por duas, o gás de arraste puro
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DETECTORES
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA
Quando da eluição de um composto com condutividade térmica menor que a do gás de arraste puro:
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DETECTORES
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA
Os filamentos do DCT são montados numa ponte de Wheatstone que transforma a diferença de resistência
quando da eluição de amostra numa diferença de voltagem:
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DETECTORES
CARACTERÍSTICAS OPERACIONAIS DO DCT
SELETIVIDADE: Observa-se sinal para qualquer substância eluída diferente do gás de arraste = UNIVERSAL
SENSIBILIDADE/LINEARIDADE: Dependendo da configuração particular e do analito: QMD=0,4 ng a 1 ng com linearidade de 104 (ng = dezenas de g)
VAZÃO DO GÁS DE ARRASTE: O sinal é proporcional à concentração do analito no gás de arraste que passa pela cela de amostra
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DETECTORES
Características Operacionais do DCT
Natureza do Gás de Arraste: Quanto maior a diferença de Δ entre a condutividade térmica do gás de arraste puro, A, e do analito X, MAIOR A RESPOSTA.
Δ = A - X
Como  ≈ 1/M 
(M=massa molecular)
QUANTO MENOR A MASSA MOLECULAR DO GÁS DE ARRASTE, MAIOR A RESPOSTA
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DETECTORES
Características Operacionais do DCT
FATORES DE RESPOSTA: Quanto menor a condutividade térmica do analito, maior o sinal
Os fatores de resposta dependem da condutividade térmica do analito
Quantidades iguais de substâncias diferentes geram picos cromatográficos com áreas diferentes!!!
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DETECTORES
Características Operacionais do DCT
TEMPERATURAS DE OPERAÇÃO: Quanto maior a diferença entre a temperatura dos filamentos e do bloco metálico maior a resposta.
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DETECTORES
APLICAÇÕES
Separação e quantificação de compostos que não geram sinal em outros detectores (gases nobres, gases fixos)
Por ser um detector NÃO-DESTRUTIVO, pode ser usado em CG preparativa ou detecção seqüencial com dois detectores em “tandem”.
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DETECTORES
CONDUTIVIDADE TÉRMICA DE ALGUNS GASES
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DETECTORES
DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA
PRINCÍPIO: Formação de íons quando um composto é queimado em uma chama de hidrogênio e oxigênio.
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DETECTORES
DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA
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DETECTORES
DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA
Região de quebra: Mistura dos gases, pré-aquecimento, início da quebra das moléculas de H2, O2 e outros analitos
Zona de reação: Reações exotérmicas com produção e/ou consumo de radicais H, O, OH, HO2 (provenientes do H2), CH e C2 (proveniente do analito) e íons CHO+ (analito)
Zona de incandescência: Emissão de luz por decaimento de espécies excitadas: OH (luz UV), CH e C2 (visível)
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DETECTORES
DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA
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DETECTORES
Características Operacionais do DIC
SELETIVIDADE: Seletivo para substâncias que contém ligações C-H em sua estrutura química
Como virtualmente todas as substâncias analisáveis por CG são orgânicas, na PRÁTICA o DIC é UNIVERSAL)
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DETECTORES
Características Operacionais do DIC
SENSIBILIDADE/LINEARIDADE: QMD típicas = 10 pg a 100 pg com linearidade entre 107 e 108 (pg a mg)
VAZÕES DE GASES: Além do gás de arraste, as vazões de alimentação de ar (comburente) e hidrogênio (combustível) devem ser otimizadas.
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DETECTORES
Características Operacionais do DIC
TEMPERATURA DE OPERAÇÃO: O efeito da temperatura sobre o sinal do DIC é negligenciável.
TRATAMENTO DO SINAL: Por causa da baixa magnitude da corrente elétrica gerada (pA a nA), ela deve ser amplificada para poder ser registrada.
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DETECTORES
Características Operacionais do DIC
FATORES DE RESPOSTA: O fator de resposta de um determinado composto é aproximadamente proporcional ao número de átomos de carbono. Presença de heteroelementos diminui o fator de resposta.
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DETECTORES
DETECTOR DE NITROGÊNIO-FÓSFORO
Modificação do DIC altamente seletiva para compostos orgânicos nitrogenados e fosforados
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DETECTORES
DETECTORES POR CAPTURA DE ELÉTRONS
PRINCÍPIO: Supressão de um fluxo de elétrons lentos (termais) causada pela sua absorção por espécies eletrofílicas
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DETECTORES
DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS
MECANISMO DE CAPTURA DE ELÉTRONS
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DETECTORES
Características Operacionais do DCE
FONTE RADIOATIVA: O ânodo deve estar dopado com um isótopo radioativo β ou α emissor
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DETECTORES
Características Operacionais do DCE
Polarização dos eletrodos: Vários modos de polarização possíveis
VOLTAGEM CONSTANTE: Pouco usada modernamente	 picos cromatográficos podem ser deformados
VOLTAGEM PULSADA: Menos anomalias elétricas	 maior sensibilidade e linearidade
Temperatura do detector: Dependência do sinal com temperatura de operação bastante significativa 
Variação de ± 3 ºC na temperatura  Erro ~10% na área dos picos
Magnitude e sinal do erro depende do composto analisado!
TEMPERATURA DO DCE DEVE SER RIGOROSAMENTE CONTROLADA
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DETECTORES
Características Operacionais do DCE
GÁS DE ARRASTE: Funcionamento do DCE é muito dependente da natureza do gás de arraste
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DETECTORES
Características Operacionais do DCE
SENSIBILIDADE/LINEARIDADE: 
QMD=0,01 pg a 1 pg (organoclorados), linearidade ~104 (pg a ng)
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DETECTORES
Características Operacionais do DCE
SELETIVIDADE/FATORES DE RESPOSTA
Valores de S maximizados para compostos eletrofílicos
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DETECTORES
Detector de Captura de Elétrons
APLICAÇÃO
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DETECTORES
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CROMATOGRAFIA GASOSA
Compostos voláteis de pontos de ebulição de até 350 ºC e pesos moleculares menores que 500
Compostos que possam produzir derivados voláteis
Compostos termicamente estáveis na condições de trabalho
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CROMATOGRAFIA GASOSA
ALGUMAS APLICAÇÕES
Indústria Petroquímica
Alimentos e Bebidas
Biocidas
Medicamentos
Meio ambiente
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CROMATOGRAFIA GASOSA
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CROMATOGRAFIA GASOSA
GÁS DE ARRASTE
FASE MÓVEL EM CG: NÃO interage com a amostra – apenas a carrega através da coluna. Assim é usualmente referida como gás de arraste
INERTE: Não deve reagir com a amostra, fase estacionária ou superfícies do instrumento
PURO: Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária
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CROMATOGRAFIA GASOSA
Impurezas típicas em gases e seus efeitos:
H2O, O2  oxida/hidrolisa algumas FE, incompatíveis com DCE
Hidrocarbonetos  ruído no sinal de DIC
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CROMATOGRAFIA GASOSA
GASES - FILTROS
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CROMATOGRAFIA GASOSA
CUSTO: Gases de altíssima pureza podem ser muito caros
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CROMATOGRAFIA GASOSA
COMPATÍVEL COM UM DETECTOR:
Cada detector demanda um gás de arraste específico para melhor funcionamento
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CROMATOGRAFIA GASOSA
Alimentação do gás de arraste
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CROMATOGRAFIA GASOSA
Dispositivos de Injeção de Amostra
Os dispositivos para injeção (INJETORES ou VAPORIZADORES) devem prover meios de introdução INSTANTÂNEA da amostra na coluna cromatográfica
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CROMATOGRAFIA GASOSA
SISTEMAS DE INJEÇÃO
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CROMATOGRAFIA GASOSA
INJETOR “ON-COLUMN” CONVENCIONAL
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CROMATOGRAFIA GASOSA
Injeção “on-column” de líquidos
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CROMATOGRAFIA GASOSA
INJETORES SPLIT/SPLITLESS
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CROMATOGRAFIA GASOSA
SPLIT
Amostras concentradas onde a diluição com solvente é impossível particularmente devido a co-eluição
SPLITLESS
Amostras diluídas ou análise de traços
Análise em ampla faixa de ponto de ebulição e polaridade
Adequado para análide de amostras complexas (multicomponentes)
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CROMATOGRAFIA GASOSA
Parâmetros de Injeção
TEMPERATURA DO INJETOR: Deve ser suficientemente elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem decomposição
REGRA GERAL: Tinj=50 ºC acima da temperatura de ebulição do componente menos volátil
VOLUME INJETADO: Depende do tipo de coluna e do estado físico da amostra
Sólidos: convencionalmente se dissolve em um solvente adequado e injeta-se a solução
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CROMATOGRAFIA GASOSA
MICROSSERINGAS PARA INJEÇÃO
LÍQUIDOS: capacidades típicas  1μL, 5 μL e 10 μL
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CROMATOGRAFIA GASOSA
COLUNAS CROMATOGRÁFICAS
Colunas empacotadas
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CROMATOGRAFIA GASOSA
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CROMATOGRAFIA GASOSA
COLUNAS CROMATOGRÁFICAS
Coluna Empacotada
VANTAGENS
Simples preparação e uso
Tecnologia clássica
Grande número de fases líquidas
Capacidade alta e longa durabilidade
Usada para análise de gases com DCT
DESVANTAGENS
Número de pratos limitado
Exige controle da vazão da fase móvel
Análises relativamente demoradas
Baixa resolução para amostras complexas
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CROMATOGRAFIA GASOSA
Temperatura da Coluna
Além da interação da FE, o tempo que um analito demora para percorrer a coluna depende de sua PRESSÃO DE VAPOR (p0)
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CROMATOGRAFIA GASOSA
Temperatura da Coluna
CONTROLE CONFIÁVEL 
DA TEMPERATURA DA 
COLUNA É ESSENCIAL
PARA OBTER BOA 
SEPARAÇÃO EM CG
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CROMATOGRAFIA GASOSA
FORNO DA COLUNA
Características desejáveis de um forno:
Ampla faixa de temperatura de uso: Pelo menos de Tamb até 400 ºC. Sistemas criogênicos (T < Tamb) podem ser necessários em casos especiais
Temperatura independente dos demais módulos: Não deve ser afetado pela temperatura do injetor e detector
Temperatura uniforme em seu interior: Sistemas de ventilação interna muito eficientes para manter a temperatura homogênea em todo forno
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CROMATOGRAFIA GASOSA
FORNO DA COLUNA
Características desejáveis de um forno:
Fácil acesso à coluna: A operação de troca de coluna pode ser freqüente
Aquecimento e resfriamento rápido: Importante tanto em análises de rotina e durante o desenvolvimento de metodologias analíticas novas
Temperatura estável e reprodutível: A temperatura deve ser mantida com precisão e exatidão de ± 0,1 ºC
EM CROMATÓGRAFOS MODERNOS (DEPOIS DE 1980) O CONTROLE DE TEMPERATURA DO FORNO É TOTALMENTE OPERADO POR MICROCOMPUTADORES
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CROMATOGRAFIA GASOSA
Programação Linear de Temperatura
Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE:
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CROMATOGRAFIA GASOSA
Programação Linear de Temperatura
A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separação:
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CROMATOGRAFIA GASOSA
Programação Linear de Temperatura
POSSÍVEIS PROBLEMAS ASSOCIADOS À PLT
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CROMATOGRAFIA GASOSA
DETECTORES: Dispositivos que examinam continuamente o material eluído, gerando sinal quando da passagem de substâncias que não o gás de arraste
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CROMATOGRAFIA GASOSA
DETECTORES MAIS IMPORTANTES:
Detector por condutividade térmica (DCT ou TCD): Variação da condutividade térmica do gás de arraste
Detector por Ionização de Chama (DIC ou FID): Íons gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de H2 + ar
Detector por Captura de Elétrons (DCE ou ECD): Supressão de corrente causada pela absorção de elétrons por eluatos altamente eletrofílicos
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CROMATOGRAFIA GASOSA
FASES ESTACIONÁRIAS
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CROMATOGRAFIA GASOSA
Características de uma FE ideal
SELETIVA: Deve interagir diferencialmente com os componentes da amostra
REGRA GERAL: A FE deve ter características tanto quanto possível próximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar, aromático...)
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CROMATOGRAFIA GASOSA
Características de uma FE ideal
AMPLA FAIXA DE TEMPERATURAS DE USO: Maior flexibilidade na otimização da separação
BOA ESTABILIDADE QUÍMICA E TÉRMICA: Maior durabilidade da coluna, não reage com componentes da amostra
POUCA VISCOSIDADE: Colunas mais eficientes (menor resistência à transferência do analito entre fases)
DISPONÍVEL EM ELEVADO GRAU DE PUREZA: Colunas reprodutíveis; ausência de picos “fantasma” nos cromatogramas 
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CROMATOGRAFIA GASOSA
FASES ESTACIONÁRIAS SÓLIDAS: ADSORÇÃO
O fenômeno físico-químico responsável pela interação do analito + FE sólida é a ADSORÇÃO
A adsorção ocorre na interface entre o gás de arraste e a FE sólida
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CROMATOGRAFIA GASOSA
FASES ESTACIONÁRIAS SÓLIDAS: ADSORÇÃO
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CROMATOGRAFIA GASOSA
FASES ESTACIONÁRIAS SÓLIDAS
Características Gerais:
Sólidos finamente granulados (diâmetros de partículas típicos de 105 m a 420 m)
Grandes áreas superficiais (até 102 m2/g)
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CROMATOGRAFIA GASOSA
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CROMATOGRAFIA GASOSA
FASES ESTACIONÁRIAS LÍQUIDAS: ABSORÇÃO
O fenômeno físico-químico responsável pela interação do analito + FE sólida é a ABSORÇÃO
A ABSORÇÃO OCORRE NO INTERIOR DO FILME DE FE LÍQUIDA (FENÔMENO INTRAFACIAL)
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CROMATOGRAFIA GASOSA
FASES ESTACIONÁRIAS LÍQUIDAS: ABSORÇÃO
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CROMATOGRAFIA GASOSA
FASES ESTACIONÁRIAS
FAMÍLIAS DE FE LÍQUIDAS
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CROMATOGRAFIA GASOSA
FASES ESTACIONÁRIAS
FAMÍLIAS DE FE LÍQUIDAS
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CROMATOGRAFIA GASOSA
FASES ESTACIONÁRIAS
FAMÍLIAS DE FE LÍQUIDAS
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CROMATOGRAFIA GASOSA
FASES ESTACIONÁRIAS
QUIRAIS
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CROMATOGRAFIA GASOSA
FASES ESTACIONÁRIAS
QUIRAIS
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CROMATOGRAFIA GASOSA
FASES ESTACIONÁRIAS
QUIRAIS
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CROMATOGRAFIA GASOSA
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CROMATOGRAFIA GASOSA
COLUNAS EMPACOTADAS
Tubo de material inerte recheado com FE sólida granulada ou FE líquida depositada sobre um suporte sólido
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CROMATOGRAFIA GASOSA
COLUNAS EMPACOTADAS
FE Líquidas: SUPORTE
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CROMATOGRAFIA GASOSA
COLUNAS CAPILARES
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CROMATOGRAFIA GASOSA
COLUNAS CAPILARES
DIÂMETRO INTERNO
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cromatografia