1. Amostras biológicas, diluição e concentração

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Universidade Federal de Pernambuco
Centro de Ciências da Saúde
Departamento de Patologia
Imunologia e Sorologia
Amostras biológicas utilizadas em 
inumoensaios e cálculos de diluição e 
concentração
Patrícia Areias Feitosa Neves 
AMOSTRAS UTILIZADAS EM 
IMUNOENSAIOS
� Principais amostras utilizadas:
� Plasma.
� Soro.
� Sangue total (fenotipagem e testes rápidos).� Sangue total (fenotipagem e testes rápidos).
� PBMC (citometria de fluxo).
� Tecidos.
� Fatores que podem interferir no resultado dos
exames:
� Idade, sexo, etnia, gravidez, período do ciclo menstrual, exercício
físico, uso de medicamentos e janela imunológica.
AMOSTRAS UTILIZADAS EM 
IMUNOENSAIOS
� Jejum recomendado:
� Quatro a oito horas. Quilomícrons e amostras hiperlipêmicas
podem interferir nos resultados.
AMOSTRAS UTILIZADAS EM 
IMUNOENSAIOS
� Gravidez
� No plasma de gestantes há aumento de hCG, lactogênio placentário
(hPL), cortisol e hormônios tireoidianos.
� Nos imunoensaios de detecção de anticorpos, são observadas� Nos imunoensaios de detecção de anticorpos, são observadas
algumas interações inespecíficas em maior freqüência em gestante
do que na população não-gestante.
� Além de informações sobre gravidez ou possibilidade dela, é
importante anotar a semana gestacional.
AMOSTRAS UTILIZADAS EM 
IMUNOENSAIOS
� Idade
� Parâmetro importante na interpretação de resultados de exames
de determinação de hormônios, proteínas e imunoglobulinas.
� Em amostras de idosos se observam mais frequetemente� Em amostras de idosos se observam mais frequetemente
gamopatias, ativação policlonal de linfócitos B, doenças auto-imunes,
e com isso há maior freqüência de resultados falso positivos.
AMOSTRAS UTILIZADAS EM 
IMUNOENSAIOS
� Coleta de sangue
� Deve-se evitar hemoconcentração. O torniquete não deve ser
usado por mais de 1 minuto.
� Deve-se evitar hemólise e formação de microtrombos no� Deve-se evitar hemólise e formação de microtrombos no
sangue coletado.
� Para centrifugação do sangue coagulado, o prazo de espera ideal é
de 30-60 minutos.
PLASMA
� É o componente líquido do sangue, no qual as células vermelhas
estão suspensas. É constituído principalmente por água e proteínas
(fibrinogênio, globulinas e albumina).
Coleta de 
sangue em 
tubos com
Centrifugação:
3500 rpm por 
Obtenção do 
plasmatubos com
anticoagulante
3500 rpm por 
15-20 min à 22º
plasma
PRESENÇA DE 
FIBRINOGÊNIO
LEUCÓCITOS E 
PLAQUETAS
SORO
� Se refere ao plasma sanguíneo no qual os fatores de coagulação
foram removidos naturalmente.
Coleta de 
sangue em 
tubos sem
anticoagulante
Centrifugação: 
3000 rpm por 
10 minutos.
Obtenção do 
soro.
anticoagulante 10 minutos.
PLASMA -
FIBRINOGÊNIO
AMOSTRAS UTILIZADAS EM 
IMUNOENSAIOS
� Fatores que interferem com a qualidade do soro ou
plasma obtido:
� Tempo entre coleta e centrifugação.
� Centrífuga: velocidade de rotação, temperatura e tempo de� Centrífuga: velocidade de rotação, temperatura e tempo de
centrifugação.
� Separação do soro ou plasma após a centrifugação.
Outros espécimes biológicos utilizados em 
imunoensaios
� Urina: determinação hormonal ou de drogas
� Líquido cefalorraquidiano (LCR): pesquisa de antígenos
bacterianos, virais e parasitários; pesquisa de anticorpos.
� Líquido amniótico: pesquisar presença de patógenos no� Líquido amniótico: pesquisar presença de patógenos no
estudo de infecções congênitas.
� Fezes: pesquisar a presença de antígenos.
� Saliva: determinação de hormônios
� Sêmen: pesquisa de anticorpos antiespermatozoides.
OBTENÇÃO DE UMA SOLUÇÃO MENOS CONCENTRADA A 
PARTIR DE UMA MAIS CONCENTRADA
Obter 26 mL da solução B, com a 
concentração de 3µg/mL, a partir da 
solução A
C1 = 200 µg/ mLC1 = 200 µg/ mL
V1 = ???
C2 = 3 µg/ mL
V2 = 26 mL ou 26000 µL
Para preparar a solução B a 3µg/mL com 
volume final de 26 mL:
25610 µL de PBS + 390 µL da solução A
DILUIÇÃO
� Uma solução diluída contém soluto (ou alíquota) e um
solvente (diluente).
� Pode-se identificar uma diluição de solução pela quantidade
de soluto no volume total, expresso como uma proporção.
� Por exemplo: uma substância química pode ser preparada em
um diluição de álcool 1/10, ou seja, um frasco de 10 ml da
solução contém 1mL do soluto e 9mL do álcool (diluente).
COMO CALCULAR O FATOR DE DILUIÇÃO
� Exemplo:
� Qual o fator da diluição se você adicionar 2 mL de uma
amostra a 18 mL de diluente?
Alíquota + diluente = volume final 
2mL + 18 mL = 20 mL
� O fator de diluição é o volume final dividido pelo volume da
alíquota.
20 mL/ 2mL = 10 ou seja 1/10
2mL + 18 mL = 20 mL
DILUIÇÃO DE AMOSTRAS
� Exemplo: diluição 1:100, volume final 50 µL (poço de
ELISA).
1 ----- 100 
X ----- 50 µL 0,5 µl de amostra + 49,5 
µL de tampão 
� Diluições em porcentagem
DILUIÇÃO SERIADA: UTILIZADA EM 
TITULAÇÕES DE AMOSTRA E REAGENTES
� Exemplo: diluição seriada fator 2 e volume final 200 µL.
200 µL da 
amostra
+
200 µL de 
PBS
1) Quanto de uma amostra de sangue é necessária para se preparar 40 mL de
uma diluição de 1/10 e quanto de diluente você precisaria?
R: 4 mL de sangue e 36 mL do diluente
2) Qual o fator de diluição quando 0,2 mL de alíquota é adicionado a 3,8 mL de
diluente?
QUESTÕES
R:1/20
3) Como você prepararia 20mL de uma diluição de 1/400?
R: 0,05 da alíquota e 19,95 do diluente
4) Qual o fator da diluição quando se adiciona 2mL de alíquota em 8mL de
diluente?
R: 1/5