Seminário Cinética enzimática

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DETERMINAÇÃO DE PARÂMETROS CINÉTICOS DE REAÇÕES CATALISADAS POR ENZIMAS
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
Alunas: Flávia R. Hillesheim
		Maria T. Rohling
		Tais C. da Silva
Curso de Graduação em Farmácia
INTRODUÇÃO 
⦁Enzimas são catalisadores de origem proteica que atuam em uma série de reações biológicas que ocorrem em organismos vivos.
⦁Ocorrem em condições favoráveis de temperatura e pH, aumentando a velocidade das reações químicas.
⦁São formadas por longas cadeias de aminoácidos ligados entre si através de ligações peptídicas.
⦁	Uma das explicações para a eficiência das enzimas é que estas formam com o substrato um complexo (es), reduzindo desta forma a energia de ativação do processo. A região da molécula onde a enzima e o substrato interagem é dominada sítio ativo.
 
⦁	Cada enzima combina-se com o substrato bem específico, sugerindo que a enzima e o substrato encaixem-se num sistema chave-fechadura.
Velocidade inicial vs concentração do substrato
O gráfico demonstra que em baixas concentrações de substrato a velocidade inicial é diretamente proporcional e a altas concentrações de substrato, a velocidade atinge um máximo, na qual seu valor passa a ser independente da concentração do substrato.
Nesta experiência foi utilizada a enzima polifenoloxidase (enzima oxidoredutase), mais água oxigenada na reação de oxidação de catecol.
Polifenoloxidase oxida fenóis a o-quinonas na presença de oxigênio molecular
 Materiais 
Reagentes:
* ½ batata crua;
* Água deionizada;
* Peróxido de hidrogênio 10%;
* Cubos de gelo.
* Solução preparada de Catecol 0,05mol/L
Vidraria:
* 5 Cubetas para espectrofotômetro;
* 2 Pipetas graduadas de 2 mL.
* Funil 
* Proveta 
Materiais
Equipamentos:
* Cronômetro;
* Termômetro;
* Espectrofotômetro.
 
Outros:
* Faca para legumes;
* Recipiente para banho de gelo;
* Ralador/amassador de batatas;
* Frascos lavadores;
* Papel filtro.
Procedimentos
* Preparação extrato da batata;
* Preparação das soluções nas cubetas, contendo catecol 0,05 mol/L, águas destilada e uma gota de peróxido de hidrogênio;
* Leitura de absorbância no comprimento de onda máximo de absorção da quinona (430nm)
Resultados
Tabela 1 - Tempo versus Absorbância
Gráfico 1 - Variação de Absorbância vs tempo (s)
Gráfico 1 - Variação de Absorbância vs tempo (s)
Gráfico 2 - Variação de Absorbância vs tempo (s)
 
Gráfico 2 - Variação de Absorbância vs tempo (s)
Gráfico 3 - Variação de Absorbância vs tempo (s)
 
Gráfico 3 - Variação de Absorbância vs tempo (s)
Gráfico 4 - Variação de Absorbância vs tempo (s)
Gráfico 4 - Variação de Absorbância vs tempo (s)
Gráfico 5 - Variação de Absorbância vs tempo (s)
Gráfico 5 - Variação de Absorbância vs tempo (s)
V. (coeficiente angular) 
Para o gráfico de Determinação de Km e Vmáx:
Eixo y = 1/V.
Concentrações de catecol usadas nos 5 experimentos, ou seja, a concentração final dentro da cubeta de 3mL.
Para o gráfico de Determinação de Km e Vmáx:
Eixo x: 1/[S] 
Gráfico 6 - Determinação de Km e Vmáx:
Cálculos para determinação de Km:
Cálculos para determinação de Vmáx:
Gráfico 7 - Absorbância versus Comprimento de onda 
Gráfico 7 - Absorbância versus Comprimento de onda 
Tabela 2 – Espectro da quinona (360-500nm)
Com o gráfico (7) obtido, podemos observar que em torno de 380nm é o pico de absorbância, visto que o experimento foi realizado no comprimento de onda de 430nm, o erro nessa análise-medida foi relativamente baixo.
Questionário
Como podem ser definidas as enzimas? O que é substrato?
Enzimas são proteínas catalisadoras que aumentam a velocidade das reações sem serem consumidas ou alteradas durante este processo. Substrato é o composto que sofrerá, de alguma forma, a catalisação por uma enzima específica
2. Quais fatores podem explicar a alta eficácia das enzimas como catalisadores?
Alta eficiência das enzimas como catalisadores se deve à formação do complexo enzima-substrato, o qual apresenta uma conformação bem próxima ao estado de transição da reação, reduzindo desta forma a energia de ativação da reação.
3. O que é um inibidor enzimático e quais os principais fatores que diminuem atividade de uma enzima para atuar como catalisador?
Um inibidor enzimático é qualquer substância que, de alguma forma, possa diminuir a velocidade de uma reação catalisada por uma enzima. Há alguns fatores que alteram a velocidade de reação catalisada, logo, alteram a atividade enzimática: A concentração do substrato, a temperatura e o pH .
4. O que acontece se você mudar o pH ou a temperatura do meio reacional e mantiver a concentração de enzima e substrato constantes? Explique.
A variação de pH e temperatura mudam levemente a conformação da enzima, de modo a expor mais ou menos o sítio ativo. O efeito da mudança de pH e temperatura é único para cada enzima, sendo assim, quanto mais próximo do seu pH/temperatura ideais de funcionamento, maior afinidade a enzima terá pelo substrato. Quando o limite da mudança de pH ou temperatura forem extrapoladas, a enzima perde sua conformação tridimensional, perdendo sua funcionalidade. Quando a enzima perde a funcionalidade, diz-se que ela desnaturou-se por alterarem as ligações químicas que mantêm sua estrutura.
5. Cite dois exemplos de enzimas que atuam em sistemas biológicos e explique a sua atuação.
Pepsina: Atua no estômago, com o pH ótimo próximo de 2. Sua forma inativa, o pepsinogênio, torna-se ativa quando entra em contato com o ácido clorídrico do estômago. A pepsina atua sobre as proteínas quebrando-as em peptídeos menores, auxiliando na digestão das mesmas e no processo de quimificação.
Tripsina: Produzida pelo pâncreas, age tanto nas proteínas do estômago e do intestino delgado. Chega ao duodeno na sua forma inativa, o tripsinogênio, e torna-se ativa quando entra em contato com a enteroquinase presente no suco intestinal. 
6. Que tipos de resíduos químicos foram gerados neste experimento, e como foram tratados? Explique.
Neste experimento, gerou-se resíduo químico não tóxico, com faixa de pH possível de descarte. Entre os componentes dos resíduos químicos estavam a quinona, a enzima polifenoloxidase, catecol e água oxigenada.
Conclusão
Através do experimento realizado, analisamos aspectos cinéticos catalisados por enzimas, através de diferentes concentrações de substrato. Percebeu-se uma boa eficiência catalítica da enzima.
A velocidade da reação enzimática também está relacionada com a concentração do substrato, cujo comportamento cinético é descrito através da equação de Michaelis-Menten para a grande maioria das enzimas.
Observa-se ainda, que a absorbância varia de acordo com o tempo, sendo que é diretamente proporcional até aproximadamente 60 segundos tendendo a se manter constante conforme o tempo de reação aumenta.