Relatório Cinética Enzimática

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
Departamento de Química
Físico-Química Experimental
Professora Vera Lúcia Azzolin Frescura Bascuñan
Curso de graduação em Farmácia
 
 
 DETERMINAÇÃO DE PARÂMETROS CINÉTICOS DE REAÇÕES CATALISADAS POR ENZIMAS
EXPERIMENTO 10
Alunos: Flávia Regina Hillesheim
 Maria Terezinha Rohling
 Tais Cristina da Silva.
 Turma: 03102 C 
Florianópolis,
07 de Novembro de 2017.
1. INTRODUÇÃO
As enzimas são proteínas, normalmente, responsáveis por catalisar reações no organismo em condições biológicas estáveis em pH neutro, temperaturas amenas e ambiente aquoso, diferente de um catalisador químico normal que necessita de condições extremas para que possa aumentar a velocidade de uma reação diminuindo a energia de ativação. Realizam atividades como digestão de alimentos, envio de sinais nervosos ou contração muscular, estas não seriam possíveis sem a atividade das enzimas.
Catálise é um processo cinético que ocorre sob efeito de um catalisador, processo que ocorre com maior rapidez sem mudanças na natureza química.
Existem dois tipos de catálise, a homogênea, onde o catalisador e sistema reacional estão no mesmo estado físico e a heterogênea, onde o catalisador está em um estado físico diferente do meio reacional.
O exemplo biológico mais interessante são as enzimas, catalisadores específicos e baratos, em relação aos catalisadores químicos. 
Na catálise enzimática, uma enzima (proteína com sítio ativo) é responsável pela ligação do substrato, transformando este em produto.
A estrutura do sítio ativo é específica para a reação que ele catalisa, e os grupos de substratos interagem com os grupos do sítio ativo por meio de ligações de hidrogênio, formando uma relação chave-fechadura (ATKINS, 2008).
 
1.2 Aspectos Cinéticos 
Ao medir-se a velocidade inicial de uma reação de transformação de substrato → produto, quando catalisada por uma determinada concentração de enzima em condições constantes de reação, pode-se observar que a velocidade inicial varia com a concentração do substrato. O gráfico obtido da velocidade inicial vs concentração do substrato, é formado por uma curva hiperbólica
. 
 O gráfico demonstra que em baixas concentrações de substrato a velocidade inicial é diretamente proporcional e a altas concentrações de substrato, a velocidade atinge um máximo, onde seu valor passa a ser independente da concentração do substrato.
 Equação de Michaelis-Menten:
 A equação de Michaelis–Menten descreve como a velocidade de reação v depende da posição
do equilíbrio ligado ao substrato e da constante de velocidade.
 A constante de Michaelis, Km, é definida como a concentração para a qual a velocidade da reação enzimática é metade de Vmax. Isto pode verificar-se ao substituir Km = [S] na equação de Michaelis-Menten. Se o passo para determinação da velocidade for lento, quando comparado com a dissociação do substrato, então a constante de Michaelis Km é aproximadamente à constante de dissociação do complexo ES, embora tal situação seja relativamente rara.
O gráfico de Lineweaver-Burk, ou representação de duplo recíproco, é a forma mais comum e simples, de mostrar os dados cinéticos, apesar de não ser a mais viável. Para tal, tomam-se os valores inversos de ambos os lados da equação de Michaelis-Menten.
Fazendo um gráfico de 1/VO versus 1/[S], obtém-se uma reta cujo coeficiente angular é Km/Vmax. O coeficiente linear é 1/Vmax.
No experimento, usou-se a enzima polifenoloxidase (enzima pertencente ao grupo de oxidação e redução), extraída da batata, e água oxigenada na reação de oxidação do catecol.
A polifenoloxidase vai catalisar a remoção do hidrogênio do catecol, formando água e quinona, que apresenta uma forte absorção no comprimento de onda de 430 nm.
 
2. OBJETIVOS
Determinar os parâmetros cinéticos de reações catalisadas por enzimas e acompanhar um procedimento espectrofotométrico.
3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
3.1 MATERIAIS E REAGENTES
Reagentes: ½ de batata crua (no caso de batata pequena), solução aquosa 0,05mol/L de catecol, água deionizada, peróxido de hidrogênio ~10%, cubos de gelo.
Vidraria: 5 cubetas de 3mL para espectrofotômetro, 1 béquer de 100mL, 1 pipeta de 1mL, 1 pipeta de 5mL, 1 proveta de 10mL.
Equipamentos: Cronômetro, termômetro, espectrofotômetro UV-visível, balança.
Outros: 1 ralador/amassador de batatas, 1 faca para legumes, 1 recipiente para banho de gelo, frasco lavador para água deionizada.
	
3.2 PROCEDIMENTOS:
Iniciou-se com a preparação do extrato de batata. Ralou-se meia batata pequena e espremeu-se recolhendo o líquido em uma proveta. Colocou-se a proveta dentro de um béquer de 100mL e adicionou-se gelo ao redor, para retardar a oxidação do extrato. Após foram preparadas as soluções nas cubetas, contendo catecol 0,05mol/l e água destilada e 1 gota de peróxido de oxigênio.
Ligou-se o espectrofotômetro e acertou-se o zero (feito para cada cubeta) de absorbância no comprimento de onda máximo de absorção da quinona (430nm).
Preparou-se as cubetas com as medidas de acordo com a tabela 1, deixando o extrato para adicionar em cada cubeta no momento antes de cada leitura, após acertar o zero. Foram feitas leituras a cada 20 segundos, por 3 minutos.
4. RESULTADOS
Tabela 1 – Tempo versus Absorbância:
	Tempo (s)
	Cubeta 1
 (0,5mL de catecol + 2,5mL de água + 1 gota de H2O2 10%)
ABSORBÂNCIA
	Cubeta 2 (0,75mL de catecol + 2,25mL de água + 1 gota de H2O2 10%)
ABSORBÂNCIA
	Cubeta 3 (1,0mL de catecol + 2,0mL de água + 1 gota de H2O2 10%)
ABSORBÂNCIA
	Cubeta 4 
 (1,25mL de catecol + 1,75mL de água + 1 gota de H2O2 10%)
ABSORBÂNCIA
	Cubeta 5 
(1,5mL de catecol + 1,5mL de água + 1 gota de H2O2 10%) 
 
ABSORBÂNCIA
	20
	0,105
	0,107
	0,110
	0,114
	0,137
	40
	0,132
	0,134
	0,121
	0,135
	0,160
	60
	0,152
	0,153
	0,135
	0,148
	0,176
	80
	0,170
	0,169
	0,148
	0,159
	0,184
	100
	0,183
	0,180
	0,154
	0,166
	0,191
	120
	0,197
	0,188
	0,160
	0,171
	0,194
	140
	0,206
	0,195
	0,166
	0,176
	0,197
	160
	0,213
	0,200
	0,169
	0,178
	0,199
	180
	0,220
	0,205
	0,172
	0,181
	0,201
Tabela 2 – Espectro da quinona (360-500nm)
	𝞴 (nm)
	360
	370
	380
	390
	400
	410
	420
	430
	440
	450
	460
	470
	480
	490
	500
	Abs
	0,636
	0,620
	1,041
	0,123
	0,076
	0,050
	0,047
	0,202
	0,101
	0,066
	0,041
	0,011
	-0,025
	-0,086
	-0,153
4.1.1 Calcule as concentrações de catecol usadas nos 5 experimentos, ou seja, a concentração final dentro da cubeta de 3mL.
Temos a seguinte equação:
Onde:
M1= Concentração inicial da solução de catecol (0,05mol/L);
V1= Volume usado da solução de catecol;
M2= concentração que desejamos descobrir;
V2= Volume final da solução (no caso, 3mL)
Sendo assim, teremos:
4.1.2 Faça cinco gráficos e calcule as velocidades iniciais (V0) para cada uma das cinco cinéticas realizadas.
Gráficos 1,2,3,4 e 5 em anexo.
Tendo a seguinte equação para o cálculo de V0:
Onde:
A = Absorbância;
t = tempo;
Ambos os valores são obtidos graficamente, V0 é o coeficiente angular da reta nos primeiros 20 segundos.
4.1.3 Determine Km e Vmáx graficamente. Verifique as unidades e discuta os resultados obtidos.
Tendo os valores de V0 e a concentração das soluções, obteve-se o gráfico 6 (1/V0 vs. 1/[s]). 
De acordo com o método de Lineweaver-Burk, Temos que quando x=0 (coeficiente linear), podemos obter o valor de 1/Vmáx, e extrapolando a reta, quando y=0, temos o valor de -1/Km. 
Deste modo podemos obter os valores desejados, segue equação:
4.1.4 Faça um gráfico com os dados obtidos na tabela 2, absorbância vs. comprimento de onda e discuta o resultado.
Com o gráfico (7) obtido, podemos observar que em torno de 380nm é o pico de absorbância, visto que o experimento foi realizado no comprimentode onda de 430nm, o erro nessa análise-medida foi relativamente alto.
5. QUESTIONÁRIO
5.1 Como podem ser definidas as enzimas? O que é substrato?
Enzimas são proteínas catalisadoras que aumentam a velocidade das reações sem serem consumidas ou alteradas durante este processo. Substrato é o composto que sofrerá, de alguma forma, a catalisação por uma enzima específica.
5.2 Quais fatores podem explicar a alta eficácia das enzimas como catalisadores?
Um dos principais motivos para a alta eficiência das enzimas como catalisadores se deve à formação do complexo enzima-substrato, o qual apresenta uma conformação bem próxima ao estado de transição da reação, reduzindo desta forma a energia de ativação da reação.
 
5.3 Qual a definição e o significado de Km e Vmax na reação. Veja as unidades.
Vmáx é a velocidade máxima de catálise de uma enzima. É um valor teórico de velocidade de reação, onde toda a enzima está catalisando um substrato.
Km é a concentração de substrato necessária para que a velocidade enzimática seja metade da velocidade total. O Km é uma forma de medir a afinidade da enzima pelo substrato, sendo, quanto menor o Km, maior a afinidade da enzima pelo substrato.
 
5.4 O que é um inibidor enzimático e quais os principais fatores que diminuem atividade de uma enzima para atuar como catalisador?
Um inibidor enzimático é qualquer substância que, de alguma forma, possa diminuir a velocidade de uma reação catalisada por uma enzima. Há alguns fatores que alteram a velocidade de reação catalisada, logo, alteram a atividade enzimática: A concentração do substrato (que tem efeito na Vmáx), a temperatura (toda a reação enzimática tem uma temperatura ótima, mas é comum que com a diminuição da temperatura haja declínio da velocidade de reação), pH (as reações também possuem um pH ótimo, mas uma variação pode ionizar o sítio ativo ou desnaturar a enzima).
 
5.5 O que acontece se você mudar o pH ou a temperatura do meio reacional e mantiver a concentração de enzima e substrato constantes? Explique.
Cada enzima possui um pH e temperatura ideais para o funcionamento.
A variação de pH e temperatura mudam levemente a conformação da enzima, de modo a expor mais ou menos o sítio ativo. O efeito da mudança de pH e temperatura é único para cada enzima, sendo assim, quanto mais próximo do seu pH/temperatura ideais de funcionamento, maior afinidade a enzima terá pelo substrato. Quando o limite da mudança de pH ou temperatura forem extrapoladas, a enzima perde sua conformação tridimensional, perdendo sua funcionalidade. Quando a enzima perde a funcionalidade, diz-se que ela desnaturou-se por alterarem as ligações químicas que mantêm sua estrutura.
5.6 Cite dois exemplos de enzimas que atuam em sistemas biológicos e explique a sua atuação.
Pepsina: Atua no estômago, com o pH ótimo próximo de 2. Sua forma inativa, o pepsinogênio, torna-se ativa quando entra em contato com o ácido clorídrico do estômago. A pepsina atua sobre a as proteínas quebrando-as em peptídeos menores, auxiliando na digestão das mesmas e no processo de quimificação.
Tripsina: Produzida pelo pâncreas, age tanto nas proteínas do estômago e do intestino delgado. Chega ao duodeno na sua forma inativa, o tripsinogênio, e torna-se ativa quando entra em contato com a enteroquinase presente no suco intestinal. 
5.7 Que tipos de resíduos químicos foram gerados neste experimento, e como foram tratados? Explique.
Neste experimento, gerou-se resíduo químico não tóxico, com faixa de pH possível de descarte. Entre os componentes dos resíduos químicos estavam a quinona, a enzima polifenoloxidase, catecol e água oxigenada.
6. CONCLUSÃO
Através do experimento realizado, analisamos aspectos cinéticos catalisados por enzimas, através de diferentes concentrações de substrato. Percebeu-se uma boa eficiência catalítica da enzima.
A velocidade da reação enzimática também está relacionada com a concentração do substrato, cujo comportamento cinético é descrito através da equação de Michaelis-Menten para a grande maioria das enzimas.
Observa-se ainda, que a absorbância varia de acordo com o tempo, sendo que é diretamente proporcional até aproximadamente 60 segundos tendendo a se manter constante conforme o tempo de reação aumenta. 
Pode-se concluir que nesse experimento obteve-se um valor de Km 0,019mol/L e de Vmáx 9,6x10^-3. Algumas diferenças podem ter ocorrido devido a erros durante a realização do experimento. Concluiu-se também que conforme maior o volume de catecol utilizado, menor é a sua velocidade inicial (Vo).
 
7. BIBLIOGRAFIA
ATKINS, P.W.; DE PAULA, Julio. Fisico-química biológica. Rio de Janeiro (RJ): LTC, 2008 597p. ISBN 9788521616238.