Aula_07 genetica

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GENÉTICA
Aula 7 – Fundamentos das Tecnologias do
DNA Recombinante
Tema da Apresentação
Fundamentos das Tecnologias do DNA Recombinante - Aula 7
GENÉTICA
É importante que você saiba que até a década de 70, o DNA era o componente celular mais difícil de ser analisado. Sua sequência de nucleotídeos de enorme tamanho e monotonia química era geralmente analisada por meios indiretos como a sequência de proteínas e análise genética. A partir da década de 70, novas tecnologias foram desenvolvidas permitindo o isolamento e a purificação de genes específicos num processo chamado de clonagem gênica. 
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Na verdade, muitas dessas técnicas são provenientes da Microbiologia, Bioquímica, Imunologia e Genética Microbiana e permitiram que a análise do DNA ganhasse um novo enfoque. O DNA tornou-se, então, a molécula mais fácil de ser analisada sendo possível isolar regiões específicas, obtê-las em grande quantidade e determinar a sua sequência numa velocidade de milhares de nucleotídeos por dia. 
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Conteúdo Programático desta aula:
Definir a tecnologia do DNA Recombinante.
Descrever as principais ferramentas utilizadas na Tecnologia do DNA Recombinante.
Identificar pelo menos três produtos resultantes da Tecnologia do DNA Recombinante.
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Em 1972, quando a possibilidade da manipulação genética foi pela primeira vez demonstrada, novas técnicas foram desenvolvidas e permitiram avanços na análise do DNA que era o componente mais difícil de ser analisado. Sua sequência de nucleotídeos de enorme tamanho e monotonia química eram geralmente analisadas por meios indiretos como a sequencia de proteínas. Esse novo conjunto de técnicas é o que chamamos de Tecnologia do DNA Recombinante.
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TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE
Conjunto de técnicas de clonagem de DNA que pavimentaram o caminho para as áreas modernas da genômica e da proteômica, o estudo dos genes e das proteínas em escala das células e dos organismos inteiros.
A tecnologia do DNA recombinante está transformando a pesquisa básica, a agricultura, a medicina, a ecologia, a medicina forense e muitas outras áreas, embora trazendo ocasionalmente à sociedade escolhas difíceis e dilemas éticos. 
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A Tecnologia do DNA Recombinante ou Engenharia Genética pode ser usada para estudar mecanismos de replicação e expressão gênica, na determinação da sequência de um gene e consequentemente da proteína que ele codifica, ou no desenvolvimento de culturas microbianas capazes de produzir substâncias úteis, tais como a insulina humana, hormônio de crescimento, vacinas e enzimas industriais em grandes quantidades. 
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CAMPOS DE APLICAÇÃO
Comercial
Biotecnológica
Investigação de paternidade
Diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas
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Clonagem do DNA
A clonagem do DNA é o principal processo da Tecnologia do DNA Recombinante. Para compreender este processo, vamos partir da definição da palavra CLONE: Um clone é uma cópia idêntica.
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Envolve a separação de um gene ou um segmento de DNA específico de um cromossomo maior, ligando-o a uma pequena molécula de DNA transportados e depois replicando esse DNA modificado milhares ou milhões de vezes por meio de um aumento no número de células ou da criação de cópias múltiplas do DNA clonado em cada célula. O resultado é a amplificação seletiva de um gene ou segmento particular de DNA. 
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A clonagem do DNA de qualquer organismo envolve cinco etapas gerais:
Cortar o DNA em localizações específicas.
Selecionar uma molécula de DNA capaz de autorreplicação.
Unir os dois fragmentos de DNA de maneira covalente.
Transferir o DNA recombinante para uma célula hospedeira.
Selecionar ou identificar as células hospedeiras que contenham o DNA recombinante.
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FERRAMENTAS DA TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE
Para a realização da Tecnologia do DNA Recombinante podemos contar com diversas ferramentas que nos auxiliam em cada uma das etapas do processo. Entre essas ferramentas temos:
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 ENZIMAS: temos um conjunto de enzimas que nos proporcionam tal evento; entre elas vamos destacar as ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO e as DNA LIGASES. As endonucleases de restrição (também conhecidas como enzimas de restrição) são enzimas encontradas naturalmente em bactérias, utilizadas para realizar cortes nas cadeias de nucleotídeos (tanto do RNA quanto do DNA). 
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Cada enzima de restrição corta o material genético. São partes palíndromas (que apresentam a mesma leitura de trás para frente e de frente para trás). As extremidades das partes cortadas recebem o nome de extremidades de ligação, pois graças ao processo “palíndromo” são antiparalelas e se encaixam perfeitamente, conforme podemos observar abaixo:
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Essas enzimas reconhecem e clivam o DNA em sequencias de DNA específicas, chamadas de sequencias de reconhecimento ou sítios de restrição, para gerar um conjunto de fragmentos menores. Enquanto que as DNA ligases fazem a união entre o fragmento de DNA a ser clonado e o vetor de clonagem, falaremos mais adiante dos vetores.
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 VETORES DE CLONAGEM: Uma molécula de ADN deve dispor de várias características de modo a ser capaz de agir como um veículo para a clonagem de genes. A característica mais importante é que deve ser capaz de se replicar dentro da célula hospedeira, de modo a que se possam produzir numerosas cópias de ADN recombinante, sendo estes capazes de passar para as células filhas. Um veículo de clonagem também precisa ser relativamente pequeno.
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 PLASMÍDEOS: Eles podem ser introduzidos nas células bacterianas (geralmente uma Escherichia coli) por um processo denominado transformação. Algumas células são naturalmente permeáveis para a captação do DNA e não requerem tratamento com cloreto de sódio, contudo a maioria requer um tratamento prévio para que a membrana se torne permeável. Como nem todas as células são capazes de capturar o DNA do plasmídeo, torna-se necessário um método para selecionar aquelas que o fazem. 
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A estratégia usual é usar um plasmídeo que, além do gene de interesse, tenha também um gene que as células hospedeiras também requeiram para o crescimento sob condições específicas, como um gene que confere resistência a um determinado antibiótico. Assim, apenas as células transformadas pelo plasmídeo recombinante podem crescer na presença daquele antibiótico, selecionando, dessa forma, as células de interesse. O gene que confere resistência
ao antibiótico é chamado de um marcador de seleção. 
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Um plasmídeo para ser um bom vetor de clonagem deve conter as seguintes propriedades:
1. Possuir uma origem de replicação (OriR), ou seja, uma sequência de DNA que permita que o vetor seja replicado na célula hospedeira.
2. Apresentar dois ou mais sítios únicos de clivagem para endonucleases de restrição. O conjunto desses sítios, denominado de Múltiplos Sítios de Clonagem (MSC), é o local onde o inserto é incorporado ao vetor de clonagem.
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3. Possuir um gene que codifica um produto que distingue a célula transformada da célula não transformada. Por exemplo, muitos vetores de clonagem carregam o gene que confere resistência à ampicilina (AmpR). As células transformadas com tais vetores são capazes de crescer num meio contendo o antibiótico, enquanto que as células não transformadas acabam morrendo.
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PLASMÍDEOS: São moléculas de DNA circular que se replicam separadamente do cromossomo bacteriano. 
 
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 BACTERIÓFAGOS: São vírus que infectam especificamente as bactérias. Tal como todos os vírus, os fagos têm uma estrutura muito simples, consistindo meramente numa molécula de DNA (ou ocasionalmente RNA) que
transporta determinado número
de genes, nos quais se incluem
 vários para a replicação do fago. 
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Um dos fagos mais utilizados nos processos de clonagem molecular é o denominado bacteriófago . O fago  é um parasita obrigatório da E. coli que necessariamente deve injetar o seu DNA na bactéria hospedeira para a sua multiplicação.
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 COSMIDEOS: São plasmídeos que contêm um fragmento de DNA do fago l que inclui o sítio cos. Podem ser usados como veículos de clonagem molecular empregando o sistema de empacotamento in vitro que reconstitui a estrutura do fago (cabeça e cauda) e assim é usado para infectar a célula hospedeira. O DNA genômico de interesse é clivado com uma enzima de restrição que produz grandes fragmentos de DNA que serão ligados ao cosmídeo, também clivado com a mesma enzima. 
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O DNA do cosmídeo é injetado no interior da célula hospedeira, circulariza igual ao DNA do fago e replica como um plasmídeo normal, sem expressão de
qualquer função do fago.
As células infectadas
serão selecionadas com
base na resistência 
adquirida a um determinado
antibiótico. 
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Observe a sequência de eventos necessários para a produção de um organismo recombinante :
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A expressão de genes clonados produz grandes quantidades de proteína. Frequentemente, é o produto do gene clonado o interesse primário – principalmente quando a proteína possui valor comercial, terapêutico ou de pesquisa. Em alguns casos, os genes clonados são tão eficientemente expressos que seu produto proteico representa 10% ou mais das proteínas celulares. Eles são ditos superexpressos. Os vetores de clonagem com sinais de transcrição e tradução são frequentemente chamados de vetores de expressão. 
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Os genes podem também ser expressos nas células eucarióticas, com várias espécies de levedura como hospedeiras usuais. Dependendo da proteína a ser obtida, faz-se necessário utilizar esse tipo de hospedeira eucariótica, pois muitas proteínas precisam ser processadas após a síntese e serem modificadas para que possam exercer suas funções primárias.
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Os produtos da tecnologia do DNA recombinante variam desde proteínas até organismos construídos. Podemos, através dessa tecnologia, produzir grandes quantidades de proteínas comercialmente úteis, planejar microrganismos para tarefas especiais construir plantas ou animais com características úteis na agricultura e medicina. A engenharia genética transformou-se, em poucos anos, de uma nova tecnologia promissora a uma indústria de muitos bilhões de dólares, com muito do seu crescimento ocorrendo na indústria farmacêutica. 
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Novas aplicações da tecnologia do DNA recombinante
Enzimas recombinantes são usadas na produção de detergentes, açúcares e queijo. 
 Proteínas construídas estão sendo usadas como aditivos alimentares para suplementar a nutrição, o sabor ou fragrância. 
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 Microrganismos estão sendo construídos com vias metabólicas inteiramente novas ou alteradas para extrair óleo e minerais de depósitos subterrâneos, para digerir derramamento de petróleo e para detoxificar depósitos de lixo e esgotos perigosos. 
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 Plantas construídas com resistência aumentada para estiagem, congelamento, pragas e doenças estão aumentando as safras e reduzindo a necessidade de produtos químicos na agricultura. 
 
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 Animais completos podem ser clonados transferindo-se um núcleo inteiro e todo seu material genético para um ovo preparado, onde o núcleo tenha sido removido. 
 
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Esta técnica tem sido cada vez mais desenvolvida e é usada com muitas finalidades. Algumas destas finalidades são:
A produção da insulina, os interferons, a interleucina.
A produção de algumas proteínas do sangue: a albumina e o fator VIII.
A produção do hormônio do crescimento.
A produção de alguns tipos de ativadores das defesas orgânicas para o tratamento do câncer, como o fator necrosante de tumores.
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 A criação de vacinas sintéticas contra: malária e hepatite B.
 A criação e desenvolvimento de biotecnologias para a pesquisa segura de substâncias cuja manipulação envolve alto risco biológico: vacinas que se preparam com vírus infecciosos, onde pode existir o risco de vazamento incontrolado.
 Para a Clonagem.
 Na transgênese, em que se introduz numa espécie uma parte do DNA de outra.
 Teste de paternidade.
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RESUMINDO...
Nesta aula vimos:
Um pouco da história da Tecnologia do DNA Recombinante. 
Como os produtos recombinantes já fazem parte de nossa vida.
A importância da clonagem de genes para o desenvolvimento tecnológico.
Tema da Apresentação
A Psicologia e sua importância nas relações humanas 
A Psicologia e sua importância nas relações humanas