1ª Prova de BioMol.

Prévia do material em texto

Historia do DNA
Em 1865 Mendel realizou os primeiros estudos a cerca do genes, porem mesmo sabendo que os genes que continham as informações fundamentais a todos os seres vivos, não era conhecido pela comunidade cientifica qual molécula continha os genes. A descoberta do DNA ocorreu em 1869 e foi feita pelo bioquímico alemão Johann Friedrich Miescher que mesmo descobrindo tal molécula não tinha ideia de sua estrutura tão pouco de sua função na célula.
Em 1928 um experimento muito interessante feito por Griffith, conhecido como principio transformante, foi fundamental para descoberta de que era o DNA que continha os genes. Esse experimento foi realizado com o pneumococo Streptococcus pneumoniae, que apresentam duas formas, a forma virulenta que causa a morte em camundongos por pneumonia e a forma não virulenta, que não causa pneumonia em camundongos. Sobre a infecção de camundongos por essas bactérias, sabia-se que bactérias do tipo S (virulentas) mortas pelo calor, ao serem injetadas em camundongos, não lhes causavam pneumonia, assim como a injeção de bactérias R (não virulentas). Griffith  injetou então em camundongos uma mistura de bactérias S mortas e bactérias R, e observou que os camundongos desenvolviam pneumonia. Além disso, foi observado também que células S apareciam vivas nos animais mortos e que essas células S eram do mesmo tipo que as células S mortas injetadas. Desse fato a única explicação plausível é a de que as bactérias R haviam sido transformadas em bactérias S por algum tipo de substância liberada pelas bactérias mortas.
No entanto, a elucidação de qual era a substancia responsável pelo principio transformante só aconteceu em 1944, após anos de estudos de Oswald Avery e seus colaboradores.  isolaram, a partir de 75 litros de Streptococcus, 25 miligramas de um extrato com altíssimo poder transformante. Eles trataram esse extrato com diferentes substãncias; amilase (enzima que degrada polissacarídeos); protease (enzima que degrada proteínas); ribonuclease (enzima que degrada RNA); dnase (enzima que degrada DNA). O único tratamento que fez o extrato perder completamente o seu “poder transformante” foi o tratamento com dnase. Assim, em 1944, Avery e seu colaboradores, chegaram à conclusão de que a substância transformante era o DNA.
A partir de então, os pesquisadores começaram a levantar algumas hipóteses. Alguns achavam que se o DNA era capaz de transformar as características hereditárias das bactérias, então que ele mesmo era o próprio material hereditário. Outros, no entanto, acreditavam que mesmo após a purificação, poderiam restar quantidades mínimas de proteínas e que essas eram as responsáveis pela transformação. Por volta de 1952, conseguiu-se obter extratos que continham apenas 0,02% de proteínas, o que eliminava a possibilidade das proteínas serem as responsáveis pela transformação das bactérias. 
Depois de se descobrir que o DNA era o portador da informação genética se iniciou uma corrida para se conhecer mais a cerca dessa molécula. E no ano de 1953 Watson e Crick apresentaram a primeira estrutura do DNA aceitável, sendo ela a simples molécula que nós conhecemos tão bem atualmente. A estratégia empregada por Watson e Crick foi construir um modelo molecular que levasse em conta o tamanho e a configuração espacial dos nucleotídeos. Assim, através de estudos de difração de raios X, Watson e Crick revelaram que a molécula de DNA é um composto formado por duas longas cadeias paralelas, constituídas por nucleotídeos dispostos em sequência. Os nucleotídeos são moléculas compostas por uma pentose (desoxirribose), uma molécula de ácido fosfórico e uma base nitrogenada sendo que essas duas cadeias polinucleotídicas são rigorosamente complementares: se houver uma base nitrogenada do tipo adenina (A) em uma das cadeias, haverá, na outra cadeia, na mesma posição, uma timina (T). Da mesma forma, se houver uma citosina (C) em uma das cadeias, haverá uma guanina(G) na posição correspondente da cadeia complementar. Os nucleotídeos de uma das cadeias da molécula de DNA mantêm-se unidos aos nucleotídeos da outra cadeia por ligações de hidrogênio, estabelecidas entre as bases: a adenina liga-se especificamente à timina, e a citosina liga-se especificamente à guanina. Portanto, segundo o modelo proposto por Watson e Crick, a molécula de DNA é constituída por duas cadeias polinucleotídicas dispostas em hélice ao redor de um eixo imaginário, girando para a direita (uma hélice dupla). Os estudos de difração de raios X revelaram também que o diâmetro externo da dupla hélice é de cerca de 2 nm, enquanto que a distância entre os pares de bases vizinhos é de 0,34 nm. A hélice dá uma volta completa a cada 3,4 nm, que corresponde a cerca de 10 pares de bases. Em 25 de abril de 1953, Watson e Crick publicaram seus resultados em uma edição da revista científica Nature - e em 1962 receberam o Prêmio Nobel de Medicina e Fisiologia, tornando-se dois dos cientistas mais importantes da história moderna.
Um experimento muito importante na historia do DNA foi o de Meselson e Sthal, que em 1958 com o objetivo de descobrir qual era o mecanismo de replicação do DNA, cultivaram células de E. coli em um meio contendo apenas isótopo pesado de nitrogênio(15N) e após 14 gerações todas as moléculas sintetizadas naquela população de bactérias, teriam incorporado 15N , essa população portanto tinha um DNA mais denso do que a E. coli cultivada no meio comum com isótopo leve de nitrogênio 14N, de acordo com o experimento com a ultracentrifugação realizado antes que mostrava que a E. Coli com 15N era sedimentada mais ao fundo do que a E. coli 14N. Para concluírem por fim qual era o mecanismo de replicação do DNA, eles transferiram células com 15N para um meio contendo apenas 14N e permitiram a duplicação de duas gerações, todavia no intervalo de tempo da primeira geração extraíram DNA e fizeram o mesmo na segunda geração. As amostras de DNA isoladas nos diferentes tempos foram ultracentrifulgados até que encontrasse sua posição no tubo de centrifuga, ou seja, onde sua densidade era correspondente a da solução de cloreto de césio. Na primeira geração se a duplicação fosse conservativa haveria duas bandas uma pesada e outra leve, se fosse semiconservativa ou dispersiva haveria uma única banda ao meio. Na segunda geração no modo conservativo continuaria igual, no semiconservativo surgiriam duas bandas uma na posição do meio e a outra mais leve e no modo dispersivo continuaria como na primeira geração. Os resultados obtidos mostraram que após a primeira geração era visto apenas uma banda ao meio excluindo assim o modo conservativo, já na segunda geração era observado, uma banda mais leve e outra intermediaria, concluindo assim que o mecanismo de duplicação do DNA era semiconservativo.
Principais características gerais dá molécula de DNA
O DNA é uma macromolécula com capacidade de armazenar informações fundamentais ao organismo de seres vivos, além disso, possui o mecanismo necessário para se duplicar fielmente possibilitando assim a divisão celular. Sua estrutura é caracterizada por duas fitas compostas de nucleotídeos que por sua vez são compostos de um grupo de fosfato, uma açúcar (Desoxirribose) e uma base nitrogenada que podem ser classificadas como púricas (Adenina e Guanina) ou pirimídicas (Citosina e Timina), o que ocasiona a estrutura de dupla hélice do DNA é o pareamento das bases complementares de cada fita, sendo que Adenina sempre se liga com Timina por duas pontes de hidrogênio e Guanina com Citosina por três. Já a ligação responsável pela união dos nucleotídeos é a ligação fosfodiester que liga o carbono três de um nucleotídeo ao carbono cinco do outro em uma fita e o contrario na outra, fazendo que as fitas do DNA sejam antiparalelas. 
Enzimas envolvidas na replicação do DNA
Helicase: Tem função de reconhecer a origem de replicação e quebrar as pontes de hidrogênio entre as bases, para que as duas fitas de DNA se separem. Essa separação é essencial para que a forquilha de replicação se movimente.Topoisomerase: Relaxa o DNA super enrolado, regulando a tensão resultante da abertura pela helicase.
SSB: Proteínas que se ligam as fitas de DNA protegendo-as e impedindo que se unam novamente.
Primase: É a enzima que sintetiza os primers (iniciadores), que são pequenas sequências de RNA., ela adiciona os primers para fornecer o terminal 3OH para RNA polimerase III, tanto no inicio da fita continua quanto em cada fragmento de okasaki da fita descontinua. 
DNA polimerase III: Sintetiza a nova fita de DNA adicionando os nucleotídeos correspondentes a fita molde. A polimerização acontece no sentido 5’-3’ sendo que a DNA polimerase sempre adiciona um nucleotídeo na extremidade 3OH do outro.
DNA polimerase I: Retira os primers de RNA e substitui por DNA.
Ligase: Une os fragmentos de okazaki.
 Processo de Replicação do DNA
A replicação do DNA ocorre na fase S da interfase, sendo um pré-requisito para divisão celular, o mecanismo de duplicação é semiconservativo, ou seja, ao final da replicação a fita molde da origem a duas novas moléculas de DNA sendo que cada molécula tem uma fita original e uma recém-sintetizada. A replicação tem inicio quando a Helicase reconhece a origem de replicação e quebra as pontes de hidrogênio criando assim duas forquilhas de replicação que se movem em direções opostas, para evitar que durante a abertura o DNA fique suoer enrolado as topisomerases se prendem as forquilhas para relaxar o DNA que não esta sendo replicado, as SSB se prendem as fitas separadas para proteger e impedirem que se unam novamente. Logo em seguida na fita continua a primase sintetiza o primer para que a DNA polimerase III comece a sintetizar nova fita a partir da fita molde, já na fita descontinua a primase adiciona vários primers para a síntese da nova fita já que a fita molde tem sentido oposto ao necessário para o sentido de polimerização da DNA polimerase III, no final a fita descontinua possui diversos fragmentos de okasaki que são compostos do primer de RNA mais a fita recém-sintetizada de DNA, esses fragmentos são corrigidos pela ação de duas enzimas a DNA polimerase I que retira os primers de RNA e substitui por DNA e a Ligase que une os fragmentos finalizando assim a replicação, que ainda passa pela revisão das DNAs polimerases para se certificar que adicionaram as bases corretas.
Enovelamento do DNA, Cromatina, Cromossomos e Genes:
A Cromatina é formada por nucleossomos que por sua vez são formados por um octamero de histonas(2H2A, 2H2B, 2H3, 2H4) que é enrolado por duas voltas de DNA + a Histona H1 que une os nucleossomos, essa cromatina é encontrada na interfase. Já o cromossomo é a cromatina super condensada e é observado durante a metáfase no seu máximo de condensação. Esse processo que torna DNA em cromatina e depois em cromossomo é chamado de enovelamento e acontece da seguinte forma: proteínas não histonicas se ligam aos nucleossomos formando um arranjo chamado solenoide que possui 30 nm de diâmetro, o solenoide se une as proteínas não histônicas sofrendo uma helicoidização e ficando com diâmetro de 300 nanômetros, novamente sofre outra helicoidização ficando agora com 700 nanômetros, e por fim sofre uma ultima helicoidização formando o cromossomo mitótico que esta no máximo de condensação estando, portanto pronto para a metáfase. Os genes são partes do DNA que expressão alguma característica e codificam algo.
Principais diferenças entre RNA e DNA
Primeiramente o DNA possui dupla fita já o RNA fita simples, a açúcar presente no DNA é a desoxirribose já no RNA a ribose, existe outra diferença nas bases nitrogenadas já que no RNA é encontrada a Uracila no lugar da Timina do DNA.
 
Transcrição
A transcrição consiste na síntese de RNA. Ela é realizada por um complexo enzimático cuja enzima chave é a RNA polimerase, composta de várias subunidades que realizam a polimerização do RNA a partir de um molde de DNA. Esse processo ocorre em três etapas principais, a iniciação, o alongamento e o término, cada um contendo fatores específicos.
Iniciação
A transcrição se inicia quando o fator sigma junto com os demais fatores de transcrição acoplados a RNA polimerase, identificam uma região chamada promotora que contem sequencias de bases especificas repetidas os chamados sítios promotores que são divididos em TATA box, CAAT box e CG box, essa região promotora é importante pois é ela quem sinaliza onde se deve iniciar a transcrição de determinado gene. Depois que é identificado o inicio da transcrição o fator sigma e os fatores de transcrição se fixam a ela e liberam a RNA polimerase que deve desenrolar o DNA dúplex, formando uma bolha de transcrição, que consiste em cerca de 17 pares de bases desenrolados, a fita de RNA sempre é polimerizada no sentido 5’-3’.
Alongamento
É a fase que acontece após a formação da primeira ligação fosfodiéster, e é durante essa fase que o RNA é sintetizado. Uma vez iniciado o alongamento segue numa velocidade aproximada de 50 nucleotídeos por segundo. A RNA polimerase diferente da DNA polimerase não tem atividade de nuclease, ou seja, não revisa a cadeia de RNA nascente, em consequência a fidelidade da síntese de RNA é bem menor que a da síntese de DNA. 
Término
A terminação da maioria dos genes acontece quando é encontrado uma região auto complementar palindrômica rica em GC e AT ou uma sequencia rica em adenina. Depois de sintetizar alguma dessas sequencias a RNA polimerase entende como sendo o termino do gene e se desprende da molécula de DNA e libera a nova fita de RNA. Alguns genes porem não possuem esses sinais na sua fita de RNA recém sintetizada tornado necessário o auxilio da proteína RHO para finalizar a transcrição.
Pós Transcrição
 Antes que o RNAm possa sair do núcleo são necessárias algumas alterações na molécula como a adição do revestimento Cap na sua extremidade 5’ e a cauda poli-A na extremidade 3’, que conferem a essa molécula uma maior proteção e estabilidade, elas também auxiliam o ribossomo a reconhecer o RNAm. Além disso o RNAm possui partes na sua molécula que não são codificantes sendo desnecessárias para a tradução, os chamados  íntrons, se faz necessário então a retirada desses íntrons para que fique somente as regiões codificantes que são chamadas éxons, o nome do processo de retirada dos introns e ligamento dos exons é chamado Splicing e é realizado pelos spliceossomos que são um arranjo de RNA + proteínas. 
Tradução
A maquinaria que controla a tradução é constituída de:
Ribossomo (estrutura encontrada livre ao citosol ou aderida ao retículo endoplasmático, que não caracteriza-se como organelas citoplasmática, pela ausência de membrana plasmática) subdividido em duas unidades, sendo a menor que promove a leitura do RNAm (RNA mensageiro) e a unidade maior que contém os sítios A, P e E responsáveis por alocar os RNAt (RNA transportador) carregados com o aminoácido e também com os peptídeos que serão alongados devido à translocação 5’ 3’.
Rna-m que contém as informações necessárias para a leitura, feita atraves de trincas de bases (AUG, CAU….) denominados códon, cuja as mensagens são oriundas do gene.
Rna-t que contém o aminoácido em uma das suas estruturas e o anti-códon na sua outra estrutura, onde pareará com os códons do Rna-m, sendo denominado “Pareamento Oscilante de Bases”, sempre respeitando a orientação 5’ 3’.
Etapas da Tradução
Iniciação
Nessa fase a subunidade menor do ribossomo reconhece a região 5’ do RNAm através do cap 5’. Pós o reconhecimento a subunidade menor transloca-se até o códon de iniciação representado pelas bases AUG, na maioria das vezes, onde ao mesmo tempo a subunidade maior e o RNAt carregado com o aminoácido metionina também acomplam-se ao processo. Geralmente quando o RNA-t chega carregado com o aminoácido ele é reconhecido pela sítio A, porém nesse caso como é necessário a formação de uma longa cadeia polipeptídica o primeiro RNAt é reconhecido pela sítio P.
Alongamento
O alongamento é o processo que ocorre após o reconhecimento nosítio P da metionina, logo em seguida o próximo RNAt trazendo o aminoácido complementar aos seus anticódons que por sua vez são complementares aos códons do RNAm, pousa no sitio A, e por meio de ligação polipeptídica o aminoácido metionina que estava no sitio P se liga ao Aminoácido do RNAt que estava no sitio A, o RNAt do Sitio P passa para o sitio E onde é descartado já o RNAt que estava no sitio A passa paro o P deixando o espaço livre para a chegada de um novo RNAt e aminoácido no sitio A esse processo se repete inúmeras vezes e a cadeia peptídica alonga-se cada vez mais. 
Término
Na fase de término, ocorre a leitura do códon de parada, onde o processo é sinalizado para ser cessado. Para que isso ocorra, mais um fator é acrescentado ao fator de término, que por hidrólise ligam-se nas extremidades do polipeptídeo fazendo com que ocorra um desacoplamento entre ribossomo-proteína. Ao final do processo, todos os participantes são reciclados para que haja um novo processo.
Mutações Genéticas 
É qualquer alteração na sequência de bases na molécula de DNA constituinte do gene. Pode ocorrer por meio da deleção, adição ou substituição.
Deleção que é quando são retiradas algumas bases.
Adição que é quando são adicionadas algumas bases.
 Substituição é quando uma base é substituída por outra. A substituição pode ser dividida em: substituição de transição que é quando uma púrica e substituída por uma púrica e uma pirimídica por uma pirimídica; e substituição de transversão que é quando púrica e substituída por pirimídicas ou pirimídicas por púricas. 
As mutações podem ser classificadas quanto à consequência 
Mutação de sentido errado, que é quando a sequencia de Aminoácidos é alterada. Essa mutação leva a perda da estrutura original e função da proteína.
Mutação sem sentido, que é quando uma mutação leva a formação de um códon de finalização, que leva a finalização precipitada da proteína que é descartada.
Mutação silenciosa que é quando a substituição de bases não altera a sequencia de aminoácidos.
As mutações podem ser classificadas quanto à Origem
Mutações germinativas, que originam nas células germinativas, que são as células que dão origem aos gametas, portanto elas passam para as próximas gerações.
Mutações somáticas, que originam nas células somáticas, não passam para próxima geração por meio da reprodução sexuada.
As mutações podem ser classificadas quanto à Causa
Mutações espontâneas que tem ocorrência natural.
Mutações induzidas que são causadas por agentes mutagênicos químicos ou físicos. 
Agentes químicos exemplos:
Análogos de base são substancias químicas que podem substituir as purinas ou as pirimídicas durante a síntese de DNA.
Substâncias Intercalantes são capazes de se inserir entre as bases sucessivas do DNA causando assim algum possível erro na leitura durante a replicação do DNA.
Agentes físicos exemplos:
Radiações ionizantes: raios X, α ,β, gama. Podem provocar alterações nas bases e quebras na cadeia do DNA( de uma ou ambas as fitas).
Radiações não ionizantes: Raios ultravioleta embora não possuam energia suficiente para ionizar o DNA, carregam energia suficiente para alterar a molécula. A mais Conhecida ação da radiação UV no DNA é a indução de dímeros de pirimidina. Trata-se da indução de ligações carbono-carbono entre pirimidinas adjacentes, sendo mais comum com a timina. Isto resulta na distorção da molécula ou ligações entre moléculas adjacentes, o que temporariamente para a replicação do DNA.
PCR
Para a realização deste procedimento, o primeiro passo é extrair o material genético da célula ou do local a ser estudado com cuidado para que o mesmo não seja danificado e nem sofra contaminação. Habitualmente, o material coletado é o DNA; todavia, pode-se utilizar o RNA em uma RT-PCR que consiste em um desdobramento do PCR e apresenta outras aplicações. Após a extração do material, juntamente a este é adicionada uma mistura, também chamada de pré-mix, na qual estão presentes os dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfato), sendo estas bases nitrogenadas ligadas com um três fosfato, os denominados primers (também conhecidos por oligonucleotídeos ou iniciadores) e a enzima DNA polimerase em uma solução tampão. Este material vai para um aparelho conhecido como termociclador, aquecendo e esfriando o material ali contido em ciclos de temperatura pré-estabelecidos. Primeiramente, o tudo é aquecido a uma temperatura entre 90° a 96°C para que ocorra a desnaturação do DNA (separação das fitas). Por conseguinte, a temperatura do termociclador cai (50° a 60°C) para que haja a hibridização ou anelamento. Neste ponto do procedimento, os primers se ligam com especificidade às suas seqüências complementares do DNA. Subsequentemente, há uma elevação da temperatura a aproximadamente 72°C para que ocorra a síntese pela polimerase (extensão de uma nova molécula). Em seguida, um novo ciclo é iniciado, sendo que normalmente são realizados de 25 a 40 ciclos para cada reação, apresentado taxa de replicação exponencial. A análise do resultado é feita por um meio da eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida, sendo interpretada por um profissional treinado.
A técnica de separação dos fragmentos de DNA mais utilizada é a eletroforese através de géis de agarose. Para realizar uma eletroforese, um gel de agarose é preparado, o DNA é introduzido em pequenos poços de gel, e então uma corrente elétrica é aplicada através do gel. Como o DNA é negativamente carregado, ele é atraído pelo eletrodo positivo. Entretanto, para chegar ao eletrodo positivo, o DNA deve migrar através do gel de agarose. Os fragmentos de DNA menores podem migrar através de um gel de agarose mais rapidamente que os fragmentos de DNA maiores. A velocidade de migração de fragmentos de DNA lineares através da agarose é inversamente proporcional a log10 de seus pesos moleculares.