Testes de Histocompatibilidade

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 Testes de Histocompatibilidade 
Tipagem HLA 
 
 Moléculas HLA: 
o Fazem parte do complexo major da histocompatibilidade (MHC = “ Major Histocompatinility 
Complex”). 
o São glicoproteínas presentes na membrana das células que controlam a resposta imune, 
atuando como Ag de histocompatibilidade. 
o Possuem um papel essencial no controlo do auto-reconhecimento e, assim, na defesa contra 
microorganismos. 
o São responsáveis pela rejeição de tecidos e órgãos transplantados. 
o Estrutura: 
 
o Localização cromossómica: 
 
 Do complexo MHC fazem parte os genes que codificam os Ag leucocitários humanos 
(HLA) e outros genes. 
o Contribuição e função do complexo MHC 
 
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o Complexo HLA: 
 HLA-I: 
 Tem como função o processamento e apresentação de Ag intracelulares a 
linfócitos T citotóxicos e TCD8 através da via citosólica levando à síntese de 
proteínas do sistema complemento. 
 Tem apenas 1 “perninha” 
 Existe o HLA – A, HLA - B, HLA – C 
 
 HLA – II 
 Possuem 2 “perninhas” 
 Tem como função o processamento e apresentação de proteínas 
extracelulares a linfocitos T CD4+ ou CD8 atraves da via endocitica 
 Existe HLA – DR, HLA – DQ, HLA – DP 
 
 
 Diversidade dos Ag HLA: 
 As sequências de genes HLA diferem de individuo para individuo. 
 Cada sequência corresponde a um alelo diferente 
 O polimorfismo beneficia a humanidade porque aumenta a probabilidade de 
pelo menos alguns indivíduos serem capazes de apresentar AGs novos do 
agente patológico encontrado, ajudando a garantir a sobrevivência da 
espécie. Porém, conduz à dificuldade de histocompatibilidade nos 
transplantes 
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 Alguns Ag HLA: 
 
 
 Hereditariedade HLA: 
 Os alelos HLA são herdados em bloco “haplotipos” 
 Cada pessoa tem diferentes conjuntos de alolos HLA 
 
 
 Importância da tipagem HLA: 
 Associação com doenças 
 Testes de paternidade (método mais fidedigno) 
 Genética de populações 
 Reprodução (abortos de repetição) 
 Transplantes 
 
 Métodos de tipagem de HLA: 
 Métodos serológicos: 
o Utilizam soros específicos para identificação dos Ag presentes nas 
membranas dos linfócitos. 
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o Citotoxicidade dependente do complemento (CDC): 
 Isolamento dos linfócitos do sangue periférico por gradiente de 
ficoll. 
 
 Incubação dos linfocitos viáveis com Ac específicos de HLA. Se 
o Ag estiver presente na célula, o Ac vai ligar-se 
 Incubação com soro de coelho (fonte de complemento). Se o 
anticorpo anti-HLA estiver ligado ao Ag HLA na superfície da 
célula, o complemento é ativado, danificando a membrana 
celular, tornando-a permeável a corantes vitais. 
 Adição de um corante vital, geralmente um fluorocromos (ex: 
brometo de etídio). O brometo de etídio entra na célula 
(danificada) e liga-se ao seu DNA. 
 Leitura num microscópio de fluorescência. 
 
 
o Resumo: 
 Tirar sangue 
 Separar linfócitos 
 Colocar em caixas de Petri 
 Adicionar Ag 
 Formação de imunocomplexo 
 Adicionar soro com proteínas e complemento 
 Verificar se há formação de poros no linfócito, se houver temos 
um resultado positivo. 
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 Adição de corante, que quando entra e se liga ao DNA emite 
fluorescência. 
 Vantagens: 
 Facilmente executado 
 Não requer equipamento caro 
 Dura aproximadamente 3h 
 Desvantagens: 
 Requer um grande volume de sangue 
 Requer linfócitos viáveis 
 Dificuldade de encontrar anti-soros para Ag HLA raros. 
 Método de baixa resolução 
 
 Métodos moleculares: 
o RFLP (“Restriction Fragment Lengh Polymorphism”) 
 Baseia-se no Western-blot 
 1º Metodologia com base em DNA implementada para 
tipagem HLA, em associação com a técnica de Southern-Blot 
 Baseado na existência, no alelo em causa, de locais específicos 
reconhecidos com a técnica se Southern-Blot. 
 
 Técnica de Southern-Blot 
 A clivagem de DNA pelas enzimas de restrição gera fragmentos 
de DNA que são separados por eletroforese em gel de agarose 
 Os fragmentos de DNA são transferidos do gel para uma 
membrana de nylon. 
 Para identificar o alelo HLA, sondas de cDNA marcadas 
radioactivamente especificas para aquele alelo são hibridas 
com os fragmentos de DNA gerados presentes na membrana 
de nylon. 
 O padrão de hibridação é visualizado numa chapa de raio-x e 
o alelo HLA é identificado 
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 Com o crescente nº de alelos HLA a serem caraterizados, esta 
metodologia tornou-se inadequada devido à falta de enzimas 
de restrição especificas do alelo. 
 
o SSP (“Sequence Specefic Priming”): primer especifico da sequencia 
 PCR utilizando primers específicos para a amplificação seletiva 
do DNA correspondente a: 
 Alelo especifico 
 Grupo de alelos 
 Nota: cada tubo contém um par de primers para um 
gene que se sabe ser expresso (controlo interno). 
 Eletroforese em gel de agarose: 
 O produto de PCR é depositado num gel de agarose 
contendo brometo de etídio. 
 O DNA migra de acordo com o seu tamanho: quanto 
maior o tamanho, menor a distancia de migração. 
 Os resultados são visualizados num transiluminador de 
UV e digitalizados ou fotografados. 
 Interpretação de Resultados: 
 Cada amostra deverá ter um produto de DNA com 
tamanho idêntico ao do controlo interno e, caso o alelo 
esteja presente, uma banda especifica desse alelo 
 
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o SSOP (“Sequence Specific Oligonucleotide Probes”): 
 Principio: 
 Sondas especificas do alelo são ligadas a um a 
membrana. 
 O produto de PCR (contendo o locus HLA) é incubado 
com a membrana, hibridando com as sondas 
correspondentes. 
 Um sinal colorimétrico é ligado à reação 
 Procedimento: 
 Isolamento do DNA 
 Amplificação do DNA de interesse com primers 
biotinilados que flanqueiam todo o exão do gene em 
causa (o PCR amplifica todos os alelos no exão) 
 Hibridação: O produto do PCR é desnaturado 
(separação das duas cadeias) e adicionado a uma 
membrana de nylon e incubado com tampão de 
hibridação. Ligadas às membranas estão sondas 
(“probes”) de sequencias complementares que 
hibridam com o produto de PCR. O excesso de produto 
é removido por excessivas lavagens. 
 Incubação das membranas com uma enzima (HRP) 
conjugada com estreptavidinaque, dessa forma, se liga 
à biotina do produto de PCR (os primers usados são 
biotinilados) 
 Adição do substrato da enzima 
 Visualização dos resultados: as amostras com o produto 
de PCR tornam-se azuis. As strips têm controlos internos 
para garantir que o teste funcionou. 
 
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 Resumo: 
o Amplificação de um fragmento de todas as 
amostras (PCR controlo em todos) 
o Adição de primers de sequencias especificas 
que procuro. 
o Se ocorrer amplificação temos um resultado 
positivo. 
o Por desenho 
o Procura-se os alelos que queremos pelo peso 
molecular. 
o SBT (“Sequence Based Typing): 
 Isolamento de DNA 
 Amplificação do gene de interesse por PCR 
 Sequenciação do DNA (determinação da sequência de bases 
de DNA). 
 A sequência é depois comparada com uma base de dados 
para o gene em causa para encontrar sequencias 
comparáveis com alelos previamente identificados. 
 Estemétodo permite a deteção de novos alelos. 
 Metodo de elevada resolução 
 
 
 
 Métodos com base em PCR: 
o Mais fiáveis, uma vez que há possibilidade de amplificar o DNA nas 
zonas de interesse (genes HLA). 
o Utilizam primers específicos para amplificação de segmentos de DNA 
correspondentes a genes HLA 
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o Procedimento: 
 
 
o A amplificação é exponencial, os vários ciclos originam 2n de DNA 
(n=numero de ciclos).