Técnica de Western Blotting

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Técnica de Western Blotting (WB)
 Natália Santos da Silva
Introdução
	É uma técnica usada para detectar proteínas de uma determinada amostra e serve como teste confirmatório de resultados obtidos em testes imunoenzimáticos. Esta técnica pode ser simplificada em cinco passos, são eles:
Extração e quantificação das proteínas, através do preparo tecidual;
Fracionamento das proteínas da amostra em um gel poliacrilamida. Ex.: Eletroforese em gel (técnica de separação de moléculas que envolve a migração de partículas em um determinado gel durante a aplicação de uma diferença de potencial.);
Transferência para uma membrana;
Bloqueio;
Revelação para análise de dados.
Preparo tecidual
	A quantificação das proteínas no tecido biológico ou na cultura de células é feita através de métodos espectroscópicos. Para quantificar a concentração de proteínas na amostra deve-se fazer uma curva de padronização com concentrações conhecidas de uma proteína (normalmente soroalbumina) versus absorbância em 595 nm (comprimento de onda que o complexo proteína-corante absorve). A partir desse resultado obtém-se a equação de ajuste linear na qual é possível substituir os valores médios de absorbâncias das amostras, resultando, assim os valores da concentração das proteínas. 
Eletroforese em gel
	As amostras são carregadas lado a lado em valas feitas em gel. As proteínas são então separadas por massas em “bandas”. Uma raia é reservada para um marcador ladder ( proteína de peso conhecido).
	As proteínas serão separadas em duas dimensões: primeira de acordo com o seu pH, com uma carga total igual a zero; segunda de acordo com o peso molecular.
Transferência
	É necessário que haja uma transferência do gel para uma membrana, seja ela nitrocelulose,PVDF ou de catiônicas de nylon para que a análise individual das proteínas seja realizada. Para tal mecanismo é preciso à aplicação de uma corrente elétrica, o resultado é uma fina camada de proteína. 
Depois de terminado o tempo de aplicação da corrente elétrica, usa-se um corante denominado Ponceau S para confirmar a transferência das proteínas para a membrana, e verificar se essa transferência ocorreu de maneira igual para todas as amostras. Em caso afirmativo, pode ser dada continuidade ao experimento de western blotting.
Bloqueio
	É utilizado para impedir interações não específicas entre a membrana e os anticorpos usados para a detecção da proteína alvo.
Detecção
Método de um passo: É rápido e utiliza menos material, é feito com um anticorpo sonda que marca a proteína de interesse.
Método de dois passos: A membrana será testada com anticorpos da proteína de interesse, ligadas por enzimas reveladoras( altera a cor). 
Anticorpo primário: liga-se direto à proteína;
Anticorpo secundário: Liga-se onde os primários não se ligaram.
	 
Diferença entre a técnica Northern Blot e Southern Blot
Ambas são técnicas realizadas na área da biologia molecular para estudos de expressão gênica. A técnica de Southern blot é utilizada para conferir se uma determinada sequência de DNA encontra-se ou não presente em uma amostra de DNA analisada. A mesma função é realizada pela técnica de Northern Blot, havendo distinção na chave, que ao invés de ser DNA, o material genético procurado é o RNA. Uma outra diferença entre ambas as técnicas, é a adição de formaldeído no gel de agarose (funciona como desnaturante) na técnica em questão.