relatorio cromatografia

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INTRODUÇÃO
A descoberta da cromatografia, no final do século passado, é creditada a um botânico chamado Tswett. Ele usou uma coluna com carbonato de cálcio e um solvente que percolava pela mesma, para separar pigmentos de folhas em uma série de bandas coloridas. 
O nome cromatografia é composto dos termos gregos “chroma” = cor e “graphein” = escrita. A partir deste experimento, muitos outros cientistas têm contribuído para o desenvolvimento da teoria e da prática da cromatografia.
O processo cromatográfico ocorre como um resultado dos fenômenos de adsorção (interação é entre um sólido e um fluido - um líquido ou gás) e dessorção (capacidade de uma substância química para mover-se com a fase móvel) que acontecem repetitivamente, durante o movimento dos componentes da amostra, através do leito estacionário. A separação ocorre devido a diferentes constantes de distribuição destes componentes entre as fases móvel e estacionária (DEGANI; CASS e VIEIRA, 2011).
A cromatografia é um método empregado de forma ampla e que permite a separação, identificação e determinação de componentes químicos em misturas complexas. Nenhum outro método de separação é tão poderoso e de aplicação tão generalizada como a cromatografia. Segundo Skoog et al (2008, p. 875) “é uma técnica na qual componentes de uma mistura são separados com base nas diferenças de velocidade nas quais são transportados através de uma fase fixa estacionária por uma fase móvel líquida ou gasosa”. Os componentes da mistura são transportados através da fase estacionária pelo fluxo da fase móvel e as separações ocorrem com base nas diferenças de velocidade de migração entre os componentes da fase móvel. É também um método muito versátil, podendo “utilizar colunas de diferentes tipos e dimensões, bem como diversas combinações de diversas fases móveis e estacionárias” (SIMÕES et al, 2007, p. 241)
Os métodos cromatográficos servem também para fins de identificação e análise de misturas e de substâncias isoladas; nesse caso, chama-se de cromatografia analítica, enquanto a cromatografia que visa o isolamento de compostos é dita cromatografia preparativa. A fase estacionária pode encontrar-se empacotada em coluna (aberta ou fechada) ou constituir uma superfície plana, como na cromatografia em papel e cromatografia em camada delgada.
Em geral, a técnica cromatográfica envolve as seguintes etapas (SIMÕES et al, 2007, p. 240):
- montagem da coluna ou placa: disposição adequada da fase estacionária ou suporte e preparação da fase móvel;
- aplicação da amostra;
- desenvolvimento: passagem de um solvente escolhido – fase móvel – através da fase estacionária;
- revelação/visualização: localização das diferentes zonas de separação dos compostos e/ou
- extração das substâncias retidas na fase estacionária. 
Este procedimento é especialmente útil no caso de compostos que são sensíveis ao calor, ou não são voláteis, ou seja, compostos que não apropriados à determinação de ebulição ou à cromatografia em fase gasosa. A distância percorrida por cada composto em uma amostra, dividido pela distância percorrida pelo solvente é conhecido como o Rf (fator de retenção). Comparações do valor de Rf da amostra com o de um padrão é um método qualitativo usado na identificação de um composto.
Para cálculo de valor de Rf mede-se a distância que a substância se deslocou a partir do ponto de aplicação (ds), considerando-se para efeito de medida o centro de gravidade da mancha, e divide-se pela distância percorrida pela frente do solvente a partir do ponto original da amostra (dm):
d
m
d
s1
d
s2
Linha de chegada fase móvel
Ponto de aplicação da amostra
Nível máximo da fase móvel
Figura 1: Determinação do Rf no cromatograma em camada fina
1.1 O processo cromatográfico
O processo cromatográfico consiste na partição dos componentes de uma mistura entre a fase móvel e a fase estacionária. No caso da cromatografia gasosa o fluido é um gás e na cromatografia líquida o fluido é um solvente. Na cromatografia líquida a fase estacionária é constituída de partículas sólidas empacotadas em uma coluna, a qual é atravessada pela fase móvel. São as forças físicas e químicas que atuam entre os solutos e as duas fases são responsáveis pela retenção dos solutos sobre a coluna cromatográfica. A diferença na magnitude dessas forças que determina a resolução e, portanto a separação dos solutos individuais. As forças elementares que agem sobre as moléculas são de cinco tipos:
1) Forças de dispersão de London ou forças de Van der Waals;
2) Interações de dipolo induzido;
3) Ligações de hidrogênio;
4) Interações dielétricas;
5) Interações eletrostáticas e coulombianas.
As variáveis que afetarem essas forças intermoleculares iram influenciar o grau de separação obtido pela passagem dos solutos através da coluna cromatográfica. (CEFET, s.d).
1.2 Classificações da cromatografia
São vários os critérios usados para a classificação das diferentes modalidades de cromatografia, sendo os mais comuns relacionados à técnica empregada, ao mecanismo de separação envolvido e aos diferentes tipos de fases utilizadas (COLLINS et al., 1997 apud TÔRRES, 2009):
 Classificação pela forma física do sistema cromatográfico
Se subdivide em cromatografia em coluna, na qual a fase estacionária é colocada em um tubo cilíndrico, e cromatografia planar, disposta sobre uma superfície planar. Enquanto a cromatografia planar resume-se à cromatografia em papel (CP), por centrifugação e à cromatografia em camada delgada (CCD), são diversos os tipos de cromatografia em coluna.
Classificação pela fase móvel empregada
Cromatografia gasosa, a cromatografia líquida e a cromatografia supercrítica (CSC), usando-se na última um vapor pressurizado, acima de sua temperatura crítica. 
A cromatografia líquida apresenta uma importante subdivisão: a cromatografia líquida clássica (CLC), na qual a fase móvel é arrastada através da coluna apenas pela força da gravidade, e a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), na qual se utilizam fases estacionárias de partículas menores, sendo necessário o uso de uma bomba de alta pressão para a eluição da fase móvel. No caso de fases móveis gasosas, separações podem ser obtidas por cromatografia gasosa (CG) e por cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR). A diferença entre os dois tipos está na coluna.
Figura 2: Representação esquemática dos diferentes tipos de cromatografia.
Fonte: TÔRRES, 2009, p. 5
Classificação pela fase estacionária utilizada
Distingue entre fases estacionárias sólidas, líquidas e quimicamente ligadas. No caso da fase estacionária ser constituída por um líquido, este pode estar simplesmente adsorvido sobre um suporte sólido ou imobilizado sobre ele. Suportes modificados são considerados separadamente, como fases quimicamente ligadas, por normalmente diferirem dos outros dois em seus mecanismos de separação (COLLINS et al., 1997 apud TÔRRES, 2009).
Classificação pelo mecanismo de separação
Por este critério, separações cromatográficas se devem à adsorção, partição, troca iônica, exclusão ou bioafinidade.
Na cromatografia de adsorção as separações são baseadas em atrações eletrostáticas ou dipolares (forças de Van Der Waals) entre a fase estacionária (sólido) e os componentes a separar da fase móvel (líquido ou gás). 
A cromatografia de partição é baseada nas diferenças de solubilidade dos componentes na fase estacionária (líquido) e na fase móvel (líquido). 
Na cromatografia de troca iônica a separação ocorre devido a diferentes tendências dos componentes iônicos ou ionizados permutarem com íons da fase estacionária, que, assim, são deslocados para a fase móvel. A afinidade entre os íons da fase móvel e o suporte pode ser controlada por alteração do pH e da força iônica do eluente. 
Na cromatografia de afinidade ocorre uma ligação molecular específica e reversível entre o soluto e um ligante imobilizado na fase estacionária. Utiliza-se esta técnica especificamente para separar produtos biológicos,e como exemplos podemos citar: ligações enzimas e substratos, anticorpos e substratos. 
A cromatografia de exclusão molecular separa os componentes segundo o tamanho efetivo (raio hidrodinâmico) das moléculas, isto é, moléculas grandes não penetram no interior do suporte (partículas porosas de gel) e movem-se mais rapidamente ao longo da coluna de onde emergem primeiro, enquanto as moléculas pequenas apresentam velocidade de deslocamento retardada porque penetram no gel, portanto, emergem da coluna mais tardiamente (LEDERER & LEDERER, 1973; DEGANI et al., 1998, apud TÔRRES, 2009).
1.3 Fundamentos de adsorção
O fenômeno da adsorção é conhecido desde o século XVIII, quando se observou que certa espécie de carvão retinha em seus poros grandes quantidades de vapor d´água, o qual era liberado quando submetido ao aquecimento.
Nas últimas décadas, com o avanço das pesquisas e do conhecimento na área, bem como o acentuado desenvolvimento registrado na petroquímica, a adsorção passou a ser utilizada como uma operação unitária importante dentro da engenharia química. Atualmente, a adsorção é aplicada em processos de purificação e separação, apresentando-se como uma alternativa importante e economicamente viável em muitos casos.
A adsorção é um dos fenômenos de transporte e a transferência de massa se dá quando existe uma superfície de contato entre um sólido e um gás ou um líquido e a concentração de determinado componente deste gás ou deste líquido é maior nesta superfície do que no interior do gás ou do líquido.
Desta forma, a adsorção está intimamente ligada à tensão superficial das soluções e a intensidade deste fenômeno depende da temperatura, da natureza e a concentração da substância adsorvida (o adsorbato), da natureza e estado de agregação do adsorvente (o sólido finamente dividido) e do fluido em contato com o adsorvente (o adsortivo).
1.3.1 Adsorventes mais utilizados
Sendo a adsorção um fenômeno essencialmente de superfície, para que um adsorvente tenha uma capacidade adsortiva significante, deve apresentar uma grande área superficial específica, o que implica em uma estrutura altamente porosa. As propriedades adsortivas dependem do tamanho dos poros, da distribuição do tamanho dos poros e da natureza da superfície sólida. Os adsorventes mais utilizados em escala industrial atualmente são o carvão ativado, a sílica-gel, a alumina ativada e as peneiras moleculares.
Os chamados adsorventes amorfos carvão ativado, sílica-gel e alumina apresentam áreas específicas entre 200-1000m2/g, e uma faixa de distribuição de tamanho de poros bem ampla, enquanto que as peneiras moleculares, por serem materiais cristalinos apresentam um tamanho de poro de ordem de grandeza molecular definido pela estrutura cristalina, e que praticamente não varia.
Sílica-gel
A sílica-gel é formada quando um silicato solúvel é neutralizado por ácido sulfúrico, retirando-se a água um sólido poroso é obtido. Sua composição química pode ser expressa como SiO2.nH2O. Sua principal aplicação industrial como adsorvente é a retirada de umidade de correntes gasosas, mas também foi utilizada na separação de compostos aromáticos de parafínicos e naftênicos no processo Arosorb.
Alumina
A alumina ativada é constituída de óxido de alumínio e é comumente obtida da bauxita (Al2O3.3H2O). Sua aplicação industrial mais importante também é na desidratação de correntes gasosas e em algumas purificações específicas de correntes líquidas.
Carvão ativado
O carvão ativado é um dos primeiros adsorventes conhecidos e um dos mais utilizados atualmente. Pode ser produzido de várias maneiras e suas características vão depender da matéria prima utilizada e da forma de ativação. Geralmente é produzido pela decomposição térmica de material carbonáceo seguido pela ativação com vapor ou dióxido de carbono em temperaturas elevadas. Sua superfície possui afinidade com substâncias de caráter orgânico, conferindo-lhe sua principal aplicação atualmente, a descontaminação de água destinada ao consumo humano. Utilizando-se de técnicas modernas de ativação é possível produzir um novo material chamado peneira molecular de carvão um carvão ativado com estreita distribuição de tamanho de poros, na faixa observada nas peneiras moleculares. Uma utilização em larga escala destas peneiras moleculares de carvão é na separação de gases.
Peneiras Moleculares
A grande maioria das peneiras moleculares são zeólitas, termos que praticamente eram sinônimos até o surgimento de outros tipos de peneiras moleculares como as alumino fosfatadas e as peneiras moleculares de carvão. Zeólitas são alumino-silicatos de estrutura cristalina e porosa, de ocorrência natural ou sintetizados em laboratório.
A estrutura cristalina das zeólitas é formada pela união de tetraedros de SiO4 e AlO4 que formam poliedros característicos. Estes poliedros arranjam-se tridimensionalmente dando origem a poros de dimensões moleculares e uniformes. Como o grupo AlO4 apresenta excesso de cargas negativas a estrutura é compensada eletronicamente por íons positivos. As diferentes configurações tridimensionais e a presença de diferentes cátions de compensação determinam uma grande quantidade de tipo de zeólitas, cada uma com seu diâmetro de poro característico.
2. MATERIAIS E REAGENTES
- 2 cubas para eluição cromatográfica
- 5 placas de vidro (microscópio)
- 1 bagueta
- capilares de tubo de vidro
- papel filtro
- água destilada
- amido
- gesso em pó
- régua e lápis macio
- papel toalha
- vidro de relógio
- canetinha, fita adesiva
- etanol, acetona, acetato de etila e éter de petróleo, iodo.
- estufa
Parte A
Preparo das placa CCD
Lavou-se as placas de vidro cuidadosamente com detergente e água corrente. Após a lavagem, a superfície das placas não foi mais tocada com os dedos. 
Misturou-se num béquer amido (maisena) e gesso em pós na proporção de 2:1, diluiu-se com um pouco de álcool formando uma suspensão homogênea. 
Mantendo-se as placas na posição horizontal, transferiu-se uma porção da suspensão na superfície das placas, (FOTO 1) espalhando uniformemente a medida que se suspendia as placas com auxílio de papel toalha e se soltava a placa na bancada. Repetiu-se esta operação até que toda a superfície estivesse uniforme. A espessura do recobrimento estava com aproximadamente 0,3mm.
Repousou-se a placa na bancada e deixou-se secar ao ar por 15 minutos, quando o adsorvente adquiriu uma aparência opaca. Depois as placas foram transferidas para a estufa onde ficaram por 30 minutos a fim de eliminar a água adsorvida no suporte.
Foto 1
Preparo das tiras para cromatografia em papel
Recortou-se o papel filtro, no sentido da fibra, em retângulo que coubessem dentro do béquer sem que suas bordas tocassem nas paredes do béquer.
Parte B
Cromatografia de tinta de canetinha em papel
Em 4 tiras de papel fez-se um traço a +/- 1 cm da borda, sobre ela fez-se uma pinta de tinta bem pequena na seguinte ordem: verde claro, verde escuro, preto, vermelho, laranja, azul escuro, lilás, azul claro e pink (FOTO 2).
Dentro do béquer colocou-se um pedaço de papel filtro limpo para homogeneizar o ambiente. 
Prendeu-se a extremidade oposta da tira de papel num vidro de relógio e prendeu-se com fita adesiva.
Preparou-se uma mistura de eluente com metade acetona e metade álcool. Colocou-se a tira dentro do béquer que ficou fechado com o vidro de relógio cuidando para que o eluente ficasse apenas na borda da tira e aguardou-se a separação (FOTO 3 e 4). Os resultados foram anotados.
Repetiu-se a operação com uma eluente formado com 75% de álcool e 25% de acetona outra com 25% de álcool e 75% de acetona e outra com álcool, acetona e água. Anotou-se os resultados.
 
Foto
 		Foto 2 			foto 3 		 foto 4
Parte C
Com o capilar, coletou-se uma amostra do extrato de folhas verdes (FOTO 5). Na placa de vidro previamente preparada, colocou-se uma mancha do extrato (FOTO 6). A placa foi transferida para uma cuba cromatográfica contendo acetato de etilae éter na proporção de 2:1, cuidando para que o nível do eluente ficasse abaixo do nível da mancha na placa (FOTO 7).
Após a eluição a placa foi seca na estufa por uns 10 minutos, após foi colocada no revelador (iodo sólido) (FOTO 8) até o aparecimento da mancha de cor verde oliva próxima ao topo da placa (FOTO 9). Anotou-se o resultado.
Foto 5 foto 6 foto 7
 
Foto 
 Foto 5 			foto 6 		foto 7
 
Foto 8 		foto 9
RESULTADOS
PARTE A:
- Resultados da separação das tintas de caneta:
Separação 1: 					separação 2:
metade álcool e metade acetona 		30% álcool + 70% acetona
 
Separação 3: 					separação 4:
70% álcool +30% acetona 		40% álcool + 30% acetona + 30% água
 
Tabela 1: Resultados de Rfs encontrados:
	separação
	verde
	Verde escuro
	azul
	vermelho
	laranja
	preto
	lilás
	Azul claro
	pink
	1(Dm=4,4)
	0,09
	0,068
	0,13
	0,068
	0,022
	0,18
0,86
	0,88
	0,15
	0,9
	2(Dm=4,2)
	0,04
	0,09
	0,09
	0,023
	0,023
	0,11
0,80
	0,83
	0,88
	0,80
	3(Dm=5,5)
	0,109
	0,145
	0,09
	0,05
	0,027
	0,181
0,85
	0,109
0,854
	0,109
	0,83
	4(Dm=3,4)
	0,44
	0,29
0,88
	0,58
0,91
	0,29
	0,29
	0,088
0,85
	0,88
	0,82
	0,82
Gráfico 1: Comparativo entre os Rfs encontrados em cada separação.
Através do gráfico pode-se verificar que o a separação 4 que tinha uma mistura de álcool, acetona e água é a que melhor separou os componentes da tinta. As cores escuras como o preto e o lilás foram os que mais se separaram, chegando a ser possível identificar mais de uma cor na mistura.
Apesar da mistura 3 (70% álcool +30% acetona) ter tido um valor maior de dm, ou seja, apresentou maior afinidade com o papel, foi a mistura 4 quem conseguiu uma separação mais eficiente.
PARTE B:
Na foto 10, é possível observar que a mancha verde oliva revelada representa a clorofila que foi arrastada pelo eluente. 
Assim fio possível calcular o seu Rf:
Foto 10
Pode-se observar que os fundamentos básicos para este tipo de separação dependem dês fenômenos de adsorção e que acontecem repetitivamente, durante o movimento dos componentes da amostra, através do leito estacionário. A separação ocorre devido a diferentes constantes de distribuição destes componentes entre as fases móvel e estacionária, consiste também na partição dos componentes de uma mistura entre a fase móvel e a fase estacionária que depende da afinidade entre as fases, pois os componentes de uma mistura são separados com base nas diferenças de velocidade nas quais são transportados através de uma fase fixa estacionária por uma fase móvel líquida ou gasosa.
As interações decorrentes da polaridade de cada composto são fundamentais para o entendimento dos fenômenos envolvidos, tendo em vista que cada um deles tem maior afinidade por seu “semelhante”. 
Os usos mais consagradas da técnica de cromatografia são: separação, identificação e determinação de componentes químicos em misturas complexas. Nenhum outro método de separação é tão poderoso e de aplicação tão generalizada como a cromatografia. Os métodos cromatográficos servem também para fins de identificação e análise de misturas e de substâncias isoladas; nesse caso, chama-se de cromatografia analítica, enquanto a cromatografia que visa o isolamento de compostos é dita cromatografia preparativa. 
As suas desvantagens estão em encontrar o solvente ideal para a separação e por ser um processo caro e demorado.
O solvente para ser um bom eluente deve ter afinidade com a substância a ser analisada para que possa ser separada. Nas experiências realizadas pode-se observar que para a tinta a mistura, álcool,m acetona e álcool foi o melhor eluente, e no caso do extrato de folhas verdes, o acetato de etila também foi um bom eluente.
Quando suspeitamos que os componentes da amostra a ser analisada pode não ser visível a olho nu, podemos usar substâncias reveladoras, que reagiram com o componente a ser encontrando dando a ela cor. Por exemplo: vapores de iodo e lâmpada ultravioleta. No primeiro método, os vapores de iodo regiram com muitos compostos orgânicos formando complexos de cor marrom ou amarela. No segundo método, sob a luz UV os compostos geralmente como manchas brilhantes de prata.
Outro método consiste na adição de um indicador de fluorescência ao adsorvente usado para cobrir a placa.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Após este experimento pode-se concluir que a cromatografia é um método eficiente na identificação de compostos com polaridades distintas, além de ser uma técnica eficaz na classificação do grau de polaridade de compostos desconhecidos, fazendo a separação de mais de um componente.
No experimento da cromatografia em papel, pode-se observar que os componentes da tinta têm maior afinidade com uma mistura de álcool, acetona e água, pode-se dizer que os compostos são polares, uma vez que os solventes também os são. Este solvente apesar de ter percorrido o menor caminho, conseguiu separar as tintas em mais de uma cor.
Na separação do extrato de folhas verdes foi necessário o uso de um revelador, uma vez que a substância a ser identifica não era visível a olho nú. A placa preparada manualmente, apesar de não ter ficado perfeita, apresentou uma boa afinidade com o eluente e com a substância, pois conseguiu realizar um bom transporte e uma boa separação dos componentes.
O mecanismo de separação é dado pela interação da fase estacionária e da fase móvel com os componentes da mistura, no caso do experimento, o mecanismo de separação é o processo físico, que é denominado de processo de adsorção, que é baseado principalmente em atrações eletrostáticas ou dipolares (forças de Van Der Waals), incluindo a formação de ponte de hidrogênio. A adsorção se dá na interface entre o sólido e a fase móvel, devido à presença de grupos ativos na sua superfície.
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
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MATOS, F.J.A. Introdução à fitoquímica experimental. 2. Ed. UFC Edições: Fortaleza, CE. 1997.
SIMÕES, Cláudia Maria Oliveira (ORG.). et al. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 6. ed. Porto Alegre: UFRGS, 2007.
SKOOG, Douglas A.; WEST, Donald M., Fundamentos de Química Analítica, 8 ed. São Paulo: Cengage Learning, 2008.
TÔRRES, Andrea Cintra Bastos. Cromatografia líquida de alta eficiência: revisão de Literatura. Seminário apresentado junto à Disciplina Seminários Aplicados do Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da Escola de Veterinária da Universidade Federal de Goiás. Nível: Doutorado. GOIÂNIA. 2009. Disponível em: <http://www.ufg.br/this2/uploads/files/66/Andrea_Cintra.pdf>. Acesso em 16 mai 2011.
VOGEL, Arthur Israel. Química Analítica Qualitativa. 5 ed. São Paulo: Mestre Jou, 1982.