resumo capitulo 7

Prévia do material em texto

Resumo - capítulo 7
Pedro Ivo Gomes de Faria
Sumário
1 Capítulo 7 - Tecnologia do DNA recombinante 2
1.1 Fragmentação, separação e sequenciamento de moléculas de
DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.2 Hibridização de ácidos nucleicos . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.3 Clonagem de DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.4 Engenharia de DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1
1 Capítulo 7 - Tecnologia do DNA recombi-
nante
Vários progressos técnicos permitiram o estudo das células e suas molécu-
las de formas não imaginadas anteriormente. Os mais importantes são os
seguintes:
1. clivagem do DNA em sítios específicos por nucleases de restrição, per-
mitindo o isolamento e manipulação de genes.
2. rápido sequenciamento de todos os nucleotídeos num fragmento de
DNA, possibilitando a determinação de limites de um gene e dos aminoá-
cidos codificados.
3. hibridização de ácidos nucléicos, que permite encontrar uma sequência
específica com precisão.
4. clonagem de DNA, em que uma única molécula pode ser copiada para
gerar bilhões de moléculas idênticas.
5. engenharia de DNA, em que sequências de DNA são alteradas para
fazer versões modificadas de genes (que são reinseridas em células ou
organismos).
1.1 Fragmentação, separação e sequenciamento de molécu-
las de DNA
A solução para vários tipos de problema relativos ao isolamento de genes
começou a surgir com a descoberta das nucleases de restrição. Essas enzi-
mas (que podem ser purificadas de bactérias, que as produzem para degradar
DNA viral) cortam a dupla hélice do DNA em sítios específicos, produzindo
fragmentos de DNA de tamanhos definidos. Algumas produzem cortes en-
viesados, que deixam curtas pontas de filamentos únicos nos dois terminais
de cada fragmento (terminais coesivos). Os terminais coesivos gerado pela
mesma enzima de restrição permitem que quaisquer dois fragmentos de DNA
se unam facilmente (formando moléculas de DNA recombinante).
Comparando os tamanhos dos fragmentos de DNA produzidos em uma
particular região após tratamento com diferentes nucleases de restrição, um
mapa de restrição da região (mostra cada local de corte em relação aos sítios
de restrição vizinhos) pode ser construído. Mapas de restrição permitem a
comparação da mesma região de DNA em diferentes indivíduos sem ter que
determinar as sequências de nucleotídeos em detalhe.
2
No início da década de 1970 descobriu que moléculas de DNA poderiam
ser purificadas com o mesmo tipo de eletroforese (aplicação de uma diferença
de potencial que permite a separação de moléculas de massas diferentes) em
gel usado na análise de proteínas. Para fragmentos de DNA com menos de
500 nucleotídeos, géis de poliacrilamida permitem que moléculas que difiram
(em comprimento) por apenas um nucleotídeo sejam separadas.
Uma vez isoladas, moléculas de DNA costumam ser marcadas de duas
formas distintas. Na primeira, o DNA é copiado pela enzima polimerase
I na presença de nucleotídeos radioativos ou quimicamente marcados. Na
segunda, a enzima PNK (quinase de polinucleotídeo) transfere um átomo de
fósforo radioativo do ATP para uma ponta 5’ de cada cadeia de DNA.
Fragmentos de DNA isolados podem ser rapidamente sequênciados, sendo
que os primeiros métodos desenvolvidos foram o químico (que utiliza mar-
cação da ponta 5’ por fósforo radioativo e tratamento químico - seletivo -
para cortar os filamentos em determinados pontos ) e o enzimático (que uti-
liza didesoxinucleotídeos - não possuem o grupo OH na posição 3’ e portanto
interrompem a polimerização - e primers marcados para sintetizar cópias com
mesmo início mas terminais diferentes). Métodos de sequênciamento são tão
rápidos e confiáveis que são usados para determinar sequências polipetídi-
cas: é feito um clone de cDNA (DNA complementar) sintetizado a partir de
uma RNAm maduro, sua sequência de nucleotídeos é determinada e o código
genético é usado para determinar a cadeia polipeptídica correspondente.
A marcação da ponta 5’ dos fragmentos com fósforo radioativo também
é usada no “footprinting” de DNA (determinação dos sítios de ligação entre
o DNA e as proteínas). Neste método, as moléculas marcadas são clivadas
(por um nuclease ou um reagente) que faz cortes aleatórios em filamentos
do DNA, seguido de uma desnaturação para separar os dois filamentos. Os
subfragmentos resultantes são separados por gel e detectados por autorra-
diografia. Como a proteína ligada ao DNA impede a quebra das ligações
fosfodiéster na região onde está, os fragmentos que terminariam nessa região
não aparecem no padrão de bandas, deixando uma lacuna no gel (“footprint”
ou pegada).
1.2 Hibridização de ácidos nucleicos
Quando uma solução aquosa de DNA é submetida a altas temperaturas (100
oC) ou alto pH (≥ 13), os filamentos que formam as hélices se disassociam
(desnaturação). Porém, se a solução for mantida por um período prolon-
gado a uma temperatura mais baixa (65 oC), as hélices são regeneradas (re-
naturação ou hibridização). Esse processo pode ser usado para detectar e
caracterizar sequências específicas de nucleotídeos tanto no DNA como no
3
RNA.
Para identificar um determinado fragmento, é usado um fragmento com-
plementar (obtido por clonagem ou quimicamente) que carregue um mar-
cador único (como um radioisótopo) que permita acompanhar o curso da
hibridação. Tal fragmento é denominado uma sonda de DNA.
Quando o fragmento procurado é de DNA, é possível utilizar a hibridiza-
ção para determinar quantas cópias da sequência estão presentes no genoma
de uma célula (mesmo que estejam em baixa concentração na solução). No
caso em que o alvo é uma sequência de RNA, a hibridação serve para desco-
brir se (e em que intensidade) um dado gene está se expressando na célula
ou para determinação da posição de íntrons na sonda.
Um método que facilita a hibridização consiste em fracionar os filamentos
simples (DNA ou RNA) por eletroforese em gel, que são transferidos para
uma membrana de nitrocelulose. Em seguida, a membrana é tratada com a
sonda, lavada e submetida à autorradioagrafia. Conhecendo os pontos onde
os fragmentos foram clivados, é possível dizer em quais trechos a sequência
procurada está ou não presente. O método é dito transferência de Southern
se a sequência-alvo for de DNA ou transferência de Northern se for de RNA.
Grandes genomas podem ser mapeados fisicamente (através da análise
direta das moléculas de DNA) ou através de mapas de ligação genética
(baseados na frequência de co-herança entre duas ou mais características,
que servem como marcadores genéticos). Um marcador genético pode estar
em qualquer lugar no genoma onde existem variações detectáveis entre difer-
entes indivíduos de uma população (a diferença é dita uma mutação se for
rara ou um polimorfismo se for comum).
Um tipo de marcador largamente utilizado depende do modo em que
pequenas diferenças (uma mudança em um par de bases ou duplicação de um
subsequência) na sequência de DNA alteram os sítios de corte das enzimas de
restrições (alterando os tamanhos dos fragmentos). Tais diferenças mínimas
entre indivíduos são ditos polimorfismos do comprimento do fragmento de
restrição (RFLPs). Um RFLP é especialmente útil quando é muito comum
na população, tal que exista uma alta probabilidade de que os parentes de
um indivíduo carreguem marcadores distinguíveis (como repetição de curtas
sequências com comprimento variável - microssatélites).
Moléculas de DNA sintéticas podem ser usadas para fazer um diagnóstico
precoce de doenças genéticas (como sondas), especialmente no caso em que a
mutação é conhecida (um exemplo é anemia falciforme, em que a sequência
GAG muda para GTG na cadeia beta da uma hemoglobina). Variando a
temperatura em que ocorre a hibridação, é possível variar sua estringência
(acima de uma certa temperatura apenas sequências caadasperfeitamente
hibridizam, permitindo detectar genes mutantes). Mesmo quando a sequên-
4
cia exata de mudanças nos nucleotídeos não é conhecida, é possível utilizar a
transferência de Southern para procurar por variações específicas no genoma
(como RFLPs) que são sabidamente ligadas ao gene defeituoso.
Como novos genes surgem devido a alterações em genes precedentes, a
maioria deles possui uma “família” de indivíduos intimamente relaciona-
dos (tanto funcionalmente como estruturalmente). Essas famílias podem
ser identificadas quando a hibridização ocorre com estrigência reduzida (em
condições - temperatura reduzida - que permitem que a sonda forme uma
dupla hélice estável com filamentos que não casem perfeitamente com ela).
Ácidos nucléicos ocupam posições precisas em células e tecidos, e portanto
grande parte de informação em potencial é perdida quando essas moléculas
são extraídas e homogeneizadas. Para evitar isso foram desenvolvidas téc-
nicas de hibridização in situ, que permitem localizar genes em cromossomos
intactos de células ou cortes histológicos.
1.3 Clonagem de DNA
Na clonagem de DNA, um fragmento que contenha um gene de interesse é
inserido no genoma de um elemento autorreplicante (um vírus ou um plas-
mídeo) para amplificar sua quantidade. Um vírus ou plasmídeo utilizado
desta forma é dito um vetor de clonagem, e o DNA propagado pela inserção
é dito clonado.
Para clonar um gene específico, é necessário ter uma biblioteca de DNA
(coleção de vários fragmentos de DNA clonados) que conteha o gene de in-
teresse. Se forem usados plasmídeos como vetores, o próximo passo é fazer a
inserção dos fragmentos da biblioteca (através de nucleases de restrição - que
criam terminais coesivo - e ligases de DNA) e reinseri-los em células bacteriais
induzidas a serem permeáveis (temporariamente) ao DNA. As bactérias que
não absorveram os plasmídeos (não transfectadas) podem ser eliminadas por
antibióticos, resultando numa grande quantidade de clones dos elementos da
biblioteca.
A clivagem de todo o genoma de uma célula (com uma nuclease de re-
strição específica) é chamada de abordagem “shotgun” (escopeta) à clonagem
gênica. Ela produz um número grande de fragmentos (na ordem de um mil-
hão para genomas de mamíferos), que estarão presentes em milhões de plas-
mídeos (constituindo uma biblioteca de DNA genômico, com apenas alguns
fragmentos contendo genes). Alternativamente, pode-se usar cDNA (DNA
complementar, que é obtido através da transcrição reversa de um RNAm
maduro) em vez de DNA genômico na clonagem, gerando uma biblioteca de
cDNA. As principais vantagens do uso desse tipo de biblioteca estão na facil-
idade de se encontrar um clone específico (pois a quantidade de um tipo de
5
cDNA numa biblioteca é proporcional à expressão do gene correspondente na
célula de onde foi extraído, e portanto células especializadas na produção de
uma proteína podem ser escolhidas para montar a biblioteca) e de se poder
usar vetores procariontes (que possuem DNA sem íntrons, como o cDNA)
para produção de uma determinada proteína (como a insulina em E. coli)
em larga escala .
Caso os cDNAs precisem ser preparados a partir de células que possuam
baixa expressão do gene de interesse, podem ser usados anticorpos ou hi-
bridação subtrativa. Com o anticorpo apropriado, é possível precipitar as
cadeias peptídicas-alvo que estão nos polirribossomos e, consequentemente,
o RNAm que codifica a proteína.
A hibridação subtrativa pode ser usada quando duas células intimamente
relacionadas (como linfócitos T e B) do mesmo organismo estão disponíveis,
mas apenas uma delas produz a proteína de interesse. Ela ocorre a partir da
hibridação de cDNA da célula de interesse com RNAm da célula semelhante,
sendo que o cDNA de interesse (cuja proteína não é produzida na célula
semelhante) não hibridiza com o RNAm e portanto pode ser separado com
uma coluna de hidroxiapatita.
Existem basicamente duas formas de se encontrar um clone de interesse
numa biblioteca de DNA: usar uma sonda de DNA complementar à sequên-
cia procurada ou um anticorpo marcado que reconheça a proteína produzida
pelo gene. A sequência de nucleotídeos das sondas de DNA pode ser de-
duzida (parcialmente, devido à ambigüidade do código genético) a partir da
análise da sequência de aminoácidos da proteína procurada. Para aumentar
as chances de encontrar candidatos promissores, pode-se usar duas sondas
(que casem com partes diferentes da sequência predita) em vez de uma só.
No caso de reconhecimento da proteína, é necessário usar uma biblioteca
de cDNA composta por vetores de expressão (vírus ou plasmídeos especiais),
que orienta a bactéria transfectada a sintetizar a proteína codificada pelo
DNA estrangeiro em grandes quantidades.
Tendo descoberto um gene mapeado (i.e., está num mapa cromossômico
que dá as posições relativas entre o gene e seus vizinhos) já clonado, ele pode
ser usado num passeio cromossômico para identificar clones (numa biblioteca
de DNA genômico) dos genes vizinhos. Um terminal do clone do gene inicial
é usado para prepara uma sonda, que é então usada para encontrar (por
hibridização) um clone que se sobreponha a ele. Em seguida, faz-se o mesmo
com o clone recém-encontrado e assim por diante.
Para encontrar genes em humanos que sejam responsáveis pelo apareci-
mento de doenças, a abordagem padrão é chamada clonagem posicional, feita
em 5 passos.
6
1. marcadores RFLP co-herdados com o fenótipo são identificados para
delimitar a região em que o gene se encontra.
2. obter clones de DNA genômico que cubram toda a região entre os
RFLPs.
3. os clones são usados para identificar quais porções do DNA também
estão conservadas em camundongos (o que indica a importância dessas
sequências).
4. procurar o subconjunto das sequências conservadas que codificam um
RNAm em tecidos que expressam o fenótipo mutante.
5. procurar (em transferências de Southern) por diferenças de tamanho
entre os fragmentos identificados no passo 4 (que indicam uma deleção,
provavelmente responsável pela mutação).
A disponibilidade de DNA polimerases purificadas (em especial as Taq
polimerases - que são termoestáveis e não desnaturam facilmente) e oligonu-
cleotídeos de DNA sintetizados quimicamente (utilizados como primers) pos-
sibilitaram clonar sequências específicas de DNA exponencialmente sem a
necessidade de uma célula (numa técnica chamada reação em cadeia da
polimerase - PCR).
Cada ciclo da reação requer um tratamento de calor que separa os dois
filamentos da dupla hélice de DNA genômico. Em seguida, um resfriamento
do DNA na presença de um excesso dos dois tipos de primers (um para
cada filamento) permite a hibridização entre os dois. A mistura é então
incubada com a DNA polimerase e os 4 tipos diferentes de nucleotídeos do
DNA (dNTPs), onde ocorre a extensão dos primers. Quando o procedimento
é repetido, os filamentos recém-sintetizados também servem como moldes,
resultando num produto em que predomina um fragmento de DNA cujo
comprimento corresponde à distância entre os dois primers originais.
1.4 Engenharia de DNA
Com enzimas de restrição apropriadas, é possível usar um mesmo vetor (como
um plasmídeo) diversas vezes para unir fragmentos de DNA de diferentes
genes. Outro modo para unir duas sequências de interesse é o uso da PCR
associada a primers com pontas 5’ que criam sítios de restrição específicos
(e, consequentemente, terminais coesivos que permitem a união das duas
moléculas).
Umas das técnicas utilizadas para produzir grandes quantidades de RNA
in vitro utiliza-se de engenharia genética. Ligando o DNA que codifica o RNA
7
desejado a um promotor viral em um vetor, é possível utilizar a eficiente RNA
polimerase viral (produzida por certos bacteriófagos) para fazer a transcrição.
A maioria das diferentes proteínas numa célula eucariótica (muitas com
importantes funções) estão presenteem pequenas quantidades. Um meio
eficiente de amplificá-las in vivo é através de um vetor de expressão, que é
(geralmente) um plasmídeo engenheirado (utilizando acentuasssomos - en-
hancers - e promotores) para aumentar o nível de expressão do DNA codifi-
cante inserido.
A transcrição de um gene é controlada por sequências de DNA regu-
latórias (determinam quais células expressam o gene - e em que condições)
que não são transcritas. Elas podem ser identificadas substituindo o gene em
questão por uma sequência diferente (dita sequência de relato) que codifique
uma proteína de fácil detecção (corante histológico ou medição de atividade
enzimática).
Existem basicamente dois modos de se determinar a função de um gene:
pelo uso de anticorpos ou pela análise de mutantes.
No primeiro método, injeta-se um anticorpo na célula que reconhece a
proteína codificada pelo gene e então observa-se como ela é afetada. Seus
pontos fracos estão na transitoriedade do efeito e no fato de muitos anti-
corpos não conseguirem bloquear a função na proteína (mesmo que estejam
fortemente ligados a ela).
Outra abordagem (utilizada pela genética) está na análise de mutantes
que carecem de uma determinada proteína (e assim revelar sua função numa
célula normal). Esse método é facilmente aplicável a organismos que se repro-
duzem rapidamente, como bactérias ou leveduras. Tratando esses organismos
com agentes que alteram seu DNA (mutagênicos), muitos mutantes podem
ser criados rapidamente e então examinados para a detecção de um defeito
de interesse.
Ainda existe outro tipo de prática: em vez de começar com um mu-
tante gerado aleatoriamente e usá-lo para identificar um gene e sua proteína,
pode-se começar com um gene em particular e induzir mutações nele (tanto
a sequência codificante quanto as regiões regulatórias podem ser alteradas
de modo controlado), criando células ou organismos mutantes para analisar
a função do gene. Como tal procedimento é inverso ao tradicional para de-
scoberta de genes, ele é dito genética reversa.
A função de uma proteína pode ser analisada por proteínas de fusão (cri-
adas pela junção de dois ou mais genes que codificam proteínas separadas),
unindo regiões específicas de uma proteína de interesse (que possuem sub-
sequências sinalizadoras que determinam sua localização ou estabilidade na
célula) a proteínas de relato (facilmente detectáveis e que não possuem tais
subsequências). No caso em que os sinais dependem do dobramento da pro-
8
teína como um todo (e não apenas de uma sequência), pode-se usar uma
proteína resultante da fusão da proteína de interesse e de um epítopo (menor
parte de um antígeno que é reconhecida por um anticorpo, que permite o
rastreamento da fusão).
Em bactérias e eucariontes inferiores (haploides), a introdução artificial
de DNA contendo genes mutantes geralmente causa a substituição do gene
normal (por recombinação). Já em eucariontes superiores (diploides), tal
alteração costuma resultar em adição gênica: o gene mutante se insere numa
posição aleatória do genoma, fazendo com que o organismo contenha tanto
o gene normal quanto o mutante.
Nos organismos em que ocorre a adição gênica, é possível criar mutações
negativas dominantes, os quais o gene mutante inibe a atividade da sua
contraparte normal na célula. Um dos métodos para isso está em engenheirar
o mutante para que ele produza moléculas de RNA anti-sentido (que são
complementares ao RNA transcrito do gene normal), que hibridizam com
o RNA normal e assim inibem a síntese da proteína correspondente. Outra
abordagem está em fazer com que a proteína mutante seja inativa mas mesmo
assim consiga entrar no complexo protéico do qual faz parte a proteína do
gene normal (se um dos componentes é não-funcional, o complexo todo é
inativado).
O teste final para a função de um gene alterado é reinseri-lo em um
organismo e observar qual ele efeito ele tem. Por exemplo, um zigoto de
camundongo injetado com 200 cópias de uma molécula de DNA linear fre-
quentemente irão se desenvolver num adulto contendo (em muitas de suas
células) um vetor de cópias em sequência do gene injetado integrado em um
de seus cromossomos numa única posição aleatória. Se o cromossomo estiver
presente nas células da linhagem germinativa, o camundongo passará o gene
externo à sua prole. Animais permanentemente alterados dessa forma são
ditos transgênicos, e os genes externos são ditos transgenes.
Do mesmo modo que camundongos mutantes podem ser criados a par-
tir da manipulação genética de células tronco num meio de cultura, plantas
transgênicas também podem ser criadas de modo análogo. Um dos meios de
se fazer isso é através do plasmídeo indutor de tumor que espécies de Agrobac-
terium usam para transferir parte de seu DNA (T-DNA) para o genoma da
planta hospedeira (substituindo o oncogene do T-DNA por um gene de in-
teresse).
A habilidade de produzir plantas transgênicas acelerou o progresso em
áreas da biologia celular de plantas, como no isolamento de receptores para
reguladores de crescimento e na análise de expressão gênica em plantas. Em
relação aos benefícios agrícolas, passou a ser possível modificar a reserva de
lipídeos, amido e proteínas das sementes, transmitir às plantas resistência a
9
vírus e pestes e criar plantas que tolerem condições extremas de habitat.
10
	Capítulo 7 - Tecnologia do DNA recombinante
	Fragmentação, separação e sequenciamento de moléculas de DNA
	Hibridização de ácidos nucleicos
	Clonagem de DNA
	Engenharia de DNA