Estudo das Proteínas

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BIOQUÍMICA CELULAR
Estudo das 
Proteínas
• Como as sequências de aminoácidos especificam a
conformação e, logo, a função das proteínas?
• Como as proteínas individuais se ligam a substratos
específicos e a outras moléculas?
• Como medeiam a catálise e transduzem energia e
informação?
Proteínas
Ampla gama de funções 
• Milhares de proteínas
• Enovelamentos tridimensionais característicos
• Interação com uma grande quantidade de moléculas
• Purificação da proteína de interesse (solubilidade, tamanho, carga e propriedades de ligação)  Avaliar a
estrutura e função da proteína sem efeito de contaminantes
• Determinação da sequência de aminoácidos  sequenciamento automatizado de peptídios, utilização de métodos
de DNA recombinante (sequências de proteínas deduzidas a partir das sequências de genomas), utilização de
bancos de dados (a determinação de um trecho permite a identificação da proteína correspondente no banco de
dados), espectrometria de massa (identificação por meio da comparação de massas)
• Determinação da função em um contexto fisiológico  Localização e quantificação in vivo por meio de anticorpos
• Os peptídios e as proteínas podem ser quimicamente sintetizados, fornecendo ferramentas para a pesquisa, e,
em alguns casos, proteínas altamente purificadas são usadas como medicamentos.
• Elucidação da estrutura tridimensional para determinação da função (cristalografia por raios X e a espectroscopia
de ressonância magnética (RM)).
Estudo das proteínas
Purificação de proteínas
Como um bioquímico é capaz de isolar uma proteína em particular de uma mistura complexa de proteínas?
A mistura impura do material inicial é submetida a uma série de separações baseadas nas propriedades 
físicas da proteína, como tamanho e carga. 
Monitoramento do sucesso da purificação: o bioquímico precisa de um teste para alguma propriedade 
característica única que identifique a proteína. 
Ensaio
absorve luz a 
340 nm
Medida da atividade enzimática: 
observação da capacidade absortiva de luz 
que a amostra desenvolve em um dado 
período de tempo
A quantidade de proteína presente na mistura do ensaio também deve ser analisada 
para saber se o esquema de purificação está funcionando
Purificação de proteínas
Como um bioquímico é capaz de isolar uma proteína em particular de uma mistura complexa de proteínas?
• Com estes dois dados experimentais – atividade enzimática e concentração proteica – podemos
então calcular a atividade específica – a razão da atividade enzimática e a quantidade de proteína na
mistura.
• Idealmente, a atividade específica aumenta à medida que a purificação continua, e a mistura de
proteínas do ensaio é cada vez mais constituída pela lactato desidrogenase.
• O objetivo geral da purificação é maximizar a atividade específica. Para uma enzima pura, a atividade
enzimática específica terá um valor constante
Centrifugação diferencial
As proteínas podem ser purificadas de acordo com a solubilidade, 
tamanho, carga e afinidade de ligação
• As misturas de proteínas são submetidas a uma série de separações, cada uma baseada em
uma propriedade diferente.
• Em cada etapa da purificação, a preparação é ensaiada e sua atividade específica, determinada.
• Uma variedade de técnicas de purificação está disponível.
Precipitação (salting out). A maioria das proteínas são menos solúveis em altas concentrações de sal, um
efeito conhecido como salting out. A concentração de sal na qual uma proteína precipita difere de uma proteína
para a outra, de modo que esta técnica pode ser utilizada para fracioná-las.
Diálise pode ser usada para remover o sal.
Purificação de proteínas
Cromatografia de filtração em gel. Tem como base o tamanho das proteínas, 
Uma mistura de proteínas em um pequeno volume é aplicada a uma coluna preenchida com grãos porosos. Como 
proteínas grandes não podem ter acesso ao volume interno dos grãos, elas emergem antes que as pequenas.
Purificação de proteínas
Cromatografia de troca iônica: Separa as proteínas principalmente por sua carga total
Purificação de proteínas
A proteína ligada pode ser eluída (liberada) pelo aumento da 
concentração de cloreto de sódio no tampão de eluição; os íons 
de sódio competem com os grupos com carga positiva na 
proteína pela ligação à coluna. 
Cromatografia de afinidade: Se aproveita da alta afinidade que muitas 
proteínas exibem a grupos químicos específicos.
Purificação de proteínas
A cromatografia de afinidade da concanavalina A (mostrada em amarelo) em um 
suporte sólido contendo resíduos de glicose (G) covalentemente ligados.
Usada para o isolamento de fatores de transcrição – proteínas que 
regulam a expressão gênica ao se ligarem a sequências específicas 
do DNA. Uma mistura de proteínas é percolada por uma coluna 
contendo sequências específicas de DNA ligadas à matriz; as 
proteínas com alta afinidade pela sequência se ligarão e serão retidas. 
Neste caso, o fator de transcrição é liberado lavando-se a coluna com 
uma solução com alta concentração de sal
Purificação de proteínas
• Os materiais das colunas são muito mais bem divididos e,
como consequência, possuem mais sítios de interação e
assim têm mais poder de resolução.
• Um detector que monitora a absorbância do material eluído
em um comprimento de onda em particular é colocado
imediatamente após a coluna.
• As proteínas são detectadas ajustando o detector a 220 nm
(o comprimento de onda característico de absorbância da
ligação peptídica).
Cromatografia líquida de alta pressão (HPLC, do inglês high-pressure
liquid chromatography): versão melhorada das técnicas de colunas.
A filtração em gel pelo HPLC define proteínas 
individuais porque tem maior poder de 
resolução: (1) tireoglobulina (669 kDa), (2) 
catalase (232 kDa), (3) albumina sérica bovina 
(67 kDa), (4) ovoalbumina (43 kDa), e (5) 
ribonuclease (13,4 kDa). 
Como podemos dizer se um esquema de purificação é eficiente? 
• Aumento da atividade específica a cada etapa da purificação. 
• Dimuição do número de proteínas diferentes em cada a cada etapa de purificação: eletroforese
As proteínas podem ser separadas por eletroforese em gel e reveladas
Com uma micropipeta, soluções de 
proteínas nos pequenos “poços” da 
lâmina
O complexo SDS (dodecil
sulfato de sódio)–proteínas, 
negativamente carregado, 
migra na direção do anodo, 
na base do gel
A ação filtradora do gel poroso de poliacrilamida
separa as proteínas de acordo com o tamanho, 
com as menores se movendo mais rapidamente
Uma tampa é então disposta em cima da 
câmara do gel e a voltagem é aplicada. 
As proteínas podem ser separadas por eletroforese em gel e reveladas
As proteínas no gel podem ser visualizadas por meio da coloração com 
prata ou corantes como o azul de Coomassie.
As proteínas também podem ser separadas eletroforeticamente de acordo com seus conteúdos relativos de 
resíduos ácidos ou básicos  método de separação de proteínas de acordo com seus pontos isoelétricos.
Ponto isoelétrico (pI): pH no qual a carga total da proteína é zero. 
As proteínas formam bandas que podem ser retiradas e 
usadas para experimentos adicionais
Focalização isoelétrica
Um gradiente de pH é estabelecido em 
um gel antes da utilização da amostra
A amostra é colocada e a voltagem, aplicada. As proteínas migram para 
seu pH isoelétrico, o local onde elas não têm carga elétrica líquida 
(posição no gel na qual o pH é igual ao pI da proteína)
Eletroforese bidimensional em gel
Uma amostra de proteína é fracionada em 
uma dimensão pela focalização isoelétrica
O gel da focalização isoelétrica é então acoplado ao gel de SDS-
poliacrilamida e a eletroforeseé executada na segunda 
dimensão, perpendicular à separação original  As proteínas 
com o mesmo pI são agora separadas com base em sua massa.
As proteínas foram inicialmente separadas de acordo 
com seu pH isoelétrico na direção horizontal e então 
por sua massa aparente na direção vertical
Alterações nos níveis de proteína detectadas pela 
eletroforese bidimensional em gel
Análise eletroforética da purificação de uma proteína
As sequências de aminoácidos das proteínas podem ser 
determinadas experimentalmente
• O peptídio é hidrolisado em seus aminoácidos
,que podem ser separados pela cromatografia
de troca iônica.
• A identidade de cada aminoácido é revelada
por seu volume de eluição, que é o volume de
tampão usado para remover o aminoácido da
coluna, e sua quantidade é revelada pela
reação com um corante indicador como
ninidrina ou fluorescamina.
• Após a conjugação com o indicador, o
aminoácido exibe uma cor com a intensidade
proporcional a sua concentração.
Composição de aminoácidos do peptídio. 
Cliva o resíduo aminoterminal de um peptídio sem desfazer as ligações peptídicas entre os outros 
resíduos de aminoácidos
Sob condições levemente ácidas, um derivado 
cíclico do aminoácido terminal é liberado, o que 
deixa intacto o peptídio encurtado em um 
aminoácido
O fenil isotiocianato reage com o grupo 
aminoterminal não carregado de um 
peptídio para formar um derivado 
feniltiocarbamoil. 
Degradação de Edman
Por meio de degradações de Edman repetitivas, a sequência de aminoácidos de cerca de 50 resíduos em 
uma proteína pode ser determinada. 
• Os PTH-aminoácidos podem ser rapidamente
separados por cromatografia líquida de alta
pressão (HPLC).
• Um aminoácido desconhecido pode ser
identificado por sua posição de eluição, em
comparação com aqueles conhecidos.
Sequenciadores automatizados 
As proteínas podem ser fragmentadas em pequenos peptídios
para facilitar sua análise
Quebram o arcabouço proteico em resíduos de aminoácidos específicos, de uma maneira conhecida
As proteínas podem ser fragmentadas em pequenos peptídios
para facilitar sua análise
A imunologia fornece técnicas importantes para a investigação das proteínas
Ensaio enzimático imunoabsorvente
(ELISA, do inglês enzyme-linked immunosorbent assay)
Western blotting possibilita a detecção de proteínas separadas 
por eletroforese em gel
Marcadores fluorescentes tornam possível a visualização de 
proteínas celulares
Os espectrômetros de massa operam por meio da conversão das moléculas de analitos em formas gasosas, 
carregadas (íons em fase gasosa). Por meio da aplicação de potenciais eletrostáticos, a razão de massa de cada 
íon e sua carga (a razão massa-paracarga, ou m/z) pode ser medida.
Espectrômetros de massa 
Espectrometria de massa sequencial (tandem)
Peptideos sintéticos
Elucidação da estrutura tridimensional