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BASES DA HEREDITARIEDADE
- Gene: bloco lógico que existe dentro do genoma (DNA) que é capaz de ser transcrito, ou seja, que seja feito um RNA a partir desse DNA.
- Genótipo: conjunto de genes.
- Fenótipo: conjunto de características físicas. Padrão de expressão gênica depende disso. Depende não só do genótipo, mas também do ambiente. 
- Princípio Transformante (1928): Cepa R + Bactéria S + Caldo fervido combinados eram letais para camundongo, apesar, sozinhos, não terem sido letais. Bactéria S + Caldo fervido também não era letal. Conclusão: Material genético é resistente à fervura e mudou fenotipicamente a cepa R.
- Avery, MacLeon, McCarty (1944): Descoberta da molécula de DNA.
- Herhsye e Chase (1952): Desenvolveram bacteriófagos (possuem apenas uma estrutura externa proteica + DNA em seu interior) em meio de enxofre e fósforo ativo, e, ao fim, estrutura proteica tinha marcação radioativa de enxofre e, o DNA, de fósforo. Foram adicionados em células e lavados. Detectaram, ao fim, fósforo no interior das células e enxofre no sobrenadante, indicando que o DNA era o responsável por conter o material genético.
- Albinismo: característica dependente da enzima tirosinase, que produz os RNA-mensageiros e suas proteínas, transformando tirosina em melanina e pigmentando os indivíduos. O ser humano é 2n, então nossas células têm 2 cópias de nosso genoma e, assim, 2 cópias de cada gene. Perdendo um gene não há interferência. Porém, tendo as duas cópias mutadas, nada de tirosinase e melanina são produzidos.
PROPRIEDADES E ESTRUTURAS DO DNA
- PIRIMIDINA: Citosina, Timina e Uracila.
- PURINA: Adenina e Guanina.
- Desoxirribose possui –H no lugar de –OH no açúcar que estrutura o ácido nucleico. 
- RNA hidrolisa facilmente em meio aquoso por causa da hidroxila em sua estrutura, causando sua rápida degradação.
- No nucleotídeo o açúcar não varia. O que varia é a base nitrogenada. Um só tipo de ligação química liga um nucleotídeo ao outro e essa ligação é feita na estrutura do açúcar, que não varia.
- Pentose (parte não variável – muda apenas –OH para –H no carbono 2 entre ribose e desoxirribose) + fosfato + base nucleica.
- Funções de nucleotídeo: produção de ATP, segundo mensageiro da ação hormonal, parte da estrutura de coenzimas, constituintes de DNA e RNA.
- Todos os nucleotídeos existem em todas as formas de fosforilação. 
- Ligação fosfodiéster sempre envolve os açúcares. Bases nitrogenadas não fazem parte.
- Ligação fosfodiéster são bem fortes em DNA por não haver hidroxila próxima.
- Carbono 5’ ligado ao fosfato e 3’ livre.
- Estrutura de DNA e RNA são totalmente iguais, tirando a hidroxila x H.
- Regras de Chargaff: A quantidade de A é sempre igual a de T e a de C era sempre igual a de G, mas (A + T) não é necessariamente igual a (G + C). A quantidade total de pirimidina (T + C) é sempre igual à quantidade total de purina (A + G). A proporção (A + T) e (G + C) varia entre diferentes organismos, mas é igual entre diferentes tecidos de um mesmo organismo. Isso se deve à estrutura dupla fita do DNA.
- Cada par de bases nitrogenadas fazem de 2 a 3 pontes de hidrogênio entre fitas de DNA. 
- Uma fita de DNA não possui nenhuma ponte de hidrogênio entre ela própria. Única ligação nela própria é a ligação fosfodiéster entre açúcares.
- Dupla hélice: duas fitas giram juntas. 
- Existem 3 tipos de DNA feitos em laboratório (em vivo, só existe 1 tipo), diferem quanto ao perfil de cristalização em tubo de ensaio:
Forma B - forma mais encontrada do DNA, em condições normais.
Forma A - Quando há pouca água disponível para interagir com a dupla hélice, o DNA pode assumir a conformação A-DNA.
Forma Z - O DNA, em solução com altas concentrações de cátions, assume a conformação Z-DNA. Em eucariotos o DNA tende a assumir a conformação de Z-DNA em regiões metiláveis (que podem ser silenciadas).
- Bases nitrogenadas podem sofrer tautomerização e este é um dos principais motivos de erros no DNA, uma vez que, se isso tautomeriza, um grupo que era aceptor de H na ponte de hidrogênio passa a ser doador e vice e versa, causando erros na formação da estrutura.
- Padrão de pontes de hidrogênio: A-T e C-G. Essas combinações possuem as distâncias corretas e as posições doados-aceptor corretas para fazer ligação de H. Se troco A por G, distâncias estão corretas, mas possui 2 doadores e 2 aceptores de hidrogênio ligando-se entre si, não ocorrendo a ponte. Se coloca G-A, assim como, C-G não tem a distância adequada.
- DNA é resistente à degradação por proteólise pois não é uma proteína.
- DNA pode desnaturar apenas a temperaturas altíssimas.
- DNA renatura se abaixar a temperatura. A fita dupla de abre com aumento da temperatura, mas quando temperatura cai ela se organiza corretamente, pois há muita ponte de hidrogênio e estrutura não é complexa.
REPLICAÇÃO DE DNA
- É um processo que vai acontecer sempre que uma célula fizer uma mitose (material genético é duplicado). Meiose não realiza replicação pois metade do que já temos vai para cada célula.
- Células hematopoiéticas, células da pele, células epiteliais internas e externas tem altas taxas de replicação.
- Replicação é semiconservativa: uma das fitas do DNA é usada como molde.
- Se a replicação fosse conservativa as chances de erros e alterações incorporadas seriam maiores, pois seriam feitas cópias das cópias do DNA original. Além disso, seria mais demorado e termodinamicamente desfavorável.
- Experimento de Meselson-Stahl: certa cultura de células foi conservada em N pesado, foi purificado e colocado em um gradiente de densidade, por ser mais pesado, migrava um pouco mais abaixo. Uma vez que essas células eram passadas para um meio de cultura contendo N leve, a primeira linhagem de células filhas tinha uma fita completamente pesada herdada da geração anterior e a fita filha toda ela teria N leve, pois eram as células disponíveis no meio novo em que se encontravam, então a densidade da fita de DNA caiu pela metade. Na segunda geração, uma bactéria teria perfil leve-pesado e a outra perfil leve-leve, confirmando o perfil semiconservativo do DNA. A abundância de DNA leve-leve deve-se a maior disponibilidade de células de N leve.
- Hipotetizando o perfil de migração do DNA no gradiente de densidade caso replicação fosse conservativa: primeira geração seria leve-leve e pesado-pesado e em qualquer geração subsequente seriam encontrados dessa mesma forma, com abundância de leve-leve.
- Se a replicação fosse dispersiva, ou seja, se as fitas de associassem aleatoriamente entre leve e pesado, teríamos um perfil sempre com a densidade reduzindo a metade a cada geração, pois dispersaríamos os pedações originais pesados entre toda a nova prole que surgisse, ou seja, se o modelo dispersivo fosse verdade as duas fitas duplas teriam a mesma densidade pois teríamos trechos leves e pesados em ambas as fitas. 
- Polimerase liga e copia sempre uma fita simples. Quando abre uma fita dupla, 4 fitas simples estão disponíveis, pois a replicação pode andar tanto para um lado quando para o outro. 
- Abre-se uma bolha entre fita dupla. Há uma forquilha de replicação tanto para a direita quanto para a esquerda. Essas bolhas são abertas em pontos específicos da fita dupla. Isso acontece em vários pontos ao mesmo tempo para que DNA possa ser replicado em tempo hábil. Para cada bolha aberta, necessita-se de 2 conjuntos enzimáticos (um para a esquerda e um para a direita), esse conjunto é a forquilha. Nessa forquilha precisa-se de 2 polimerases, uma lendo a fita de cima e outra lendo a fita de baixo. Quando forquilhas se encontram, tem-se 2 fitas já sintetizadas, mas que faltam serem ligadas uma a outra.
- A polimerização acontece sempre do sentido 3 para o sentido 5 da fita filha, pois ela deve estar com hidroxila disponível, já que se estiver com o trifosfato disponível e ocorrer algum erro, ela perderá toda a capacidade de polimerização. Mais seguro que trifosfato esteja no solúvel do que no polímero.
- Fita cresce no sentido 5’ – 3’ (DIREÇÃO DEPOLIMERIZAÇÃO), fita que está sendo lida é no sentido 3’ – 5’.
- Os nucleotídeos são adicionados na ponta 3’ disponível, ou seja, na hidroxila disponível da fita filha. Nucleotídeo que chega para ser adicionado libera 2 fosfatos e o terceiro faz parte da estrutura final.
- Uma polimerase só polimeriza uma fita e sempre no mesmo sentido, pois precisa-se de uma hidroxila disponível e isso só ocorre de um lado. Sempre lerá fita molde na mesma direção e gerar fita filha na mesma direção.
- SLIDE 10: Leitura da fita azul e produção da vermelha, que cresce para o lado direito. 
- DNA polimerase necessita obrigatoriamente ler uma fita molde.
- Ela funciona como uma “mão” que segura o DNA. Tem sítios de polimerização e sítios de conferência. 
- Polimerização é unidirecional.
- SLIDE 13: Fita de cima pode ser polimerizada de forma contínua pois tem o 3’ disponível, já a de baixo tem a polarização contrária. 
- Sempre o trifosfato vem do nucleotídeo solúvel e o polímero que está sendo criado fornece a hidroxila para que a síntese da ligação fosfodiéster aconteça pela polimerase.
- Se a polimerização acontecesse no sentido 3’ – 5’, fosfato obrigatoriamente ficaria preso no polímero e também teria um trifosfato no nucleotídeo solúvel, mas não seria utilizado na reação de polimerização.
- Direção de polimerização 5’ – 3’ é mais econômica metabolicamente, viável energeticamente e passível de correção na ocorrência de erros (Imagem do slide 14 mostra isso).
- Polimerase possui sistema de correção de erros por tautomerização, podendo arrancar fita errada após tautomerização ser desfeita. 
- Além de formar a ligação fosfodiéster, polimerase também é capaz de promover hidrólise da ligação, mas apenas de erros recém ocorridos de sua polimerização.
- Se polimerase não pegar erros, eles ainda podem ser consertados na primeira geração formada. Caso ainda não sejam corrigidos, eles podem se perpetuar como mutações. 
- A polimerase de procariotos não detecta e conserta tanto os erros como a de eucariotos.
- Origem de replicação: dada região do DNA que tem uma sequência de nucleotídeos reconhecidas por proteínas para dar início a bolha de replicação.
- Procariotos: apenas uma origem de replicação. Normalmente DNA é circular e o material genético é muito compactado, replicação é rápida. Problema: qualquer mutação que aconteça tem grandes chances de acertar em um gene do que uma região intergênica que não codificada nada, também por causa do tamanho.
- Direção de replicação e estratégia da enzima são as mesmas para eucariotos e procariotos.
- REPLISSOMO é o conjunto de atividades enzimáticas necessárias para o funcionamento de forquilha de replicação, mesmo que não estejam fisicamente ligadas à forquilha. 
- Para começar polimerização, precisa-se produzir uma ponta 3’ da fita filha para ligar à fita mãe; abrir fitas duplas além da ponte (romper pontes de hidrogênio); impedir a renaturação da fita molde; processividade (enzima não pode soltar até terminar de processar).
- DNA PRIMASE: Faz um primer, ou seja, consegue começar a polimerizar “do nada” – não precisa de um ponta 3’ para começar. Porém, coloca um primer de RNA-msg e não DNA. É utilizado apenas para iniciar, esse trecho de RNA não fica para o DNA final. Fita cresce para a esquerda. 
- Sempre é necessário um primer para começar polimerização. Para replicação, precisam-se de, pelo menos, 4 primers – 1 para casa polimerase, pois cada forquilha tem 2 polimerases.
- DNA HELICASE: Desfaz ligações de H e abre fitas simples. 
- Em procarioto, primase e helicase são uma só coisa – PRIMOSSOMO.
- SSB’s – proteínas que protegem a fita simples, impedindo que ela volte a fazer ligação de H entre ela mesma ou com a outra fita. Faz ligação e H com a fita simples. Interação não pode ser tão forte para que polimerase consiga passar.
- POLIMERASE está presa em uma proteína chamada de Cinta deslizante dismérica. A cinta detecta uma ponta 3’ disponível e um pedaço de fita dupla de DNA e se monta, polimerase se liga e desliza para o lado certo. Tem um montador que monta essa cinta abraçando o DNA.
- CÓPIA DA FITA RETARDADA (fita de baixo – no sentido “errado”): Uma polimerase segue continuamente e a outra precisa que a fita vá e volte. Após polimerizar continuamente uma parte da primeira fita, polimerase volta polimerizando a fita retardada em pedaços, repetindo esse processo várias vezes. Esses fragmentos formados são chamados de Fragmentos de Okasaki (200 nucleotídeos). Dessa forma, polimerização continua no sentido 5’ – 3’. 
- Algumas das enzimas utilizadas na replicação são necessárias diferentemente em casa fita. PRIMASE é utilizada apenas uma vez na fita contínua, pondo o primer no começo, enquanto é necessária a cada novo intervalo. HELICASE é necessária apenas uma vez. POLIMERASE E CINTA duas vezes.
- REPLISSOMO é 1 helicase, 1 primase, 2 polimerases e 2 cintas, sempre andando para a direita ou para esquerda, na velocidade da fita retardada.
- PROBLEMA NA FITA RETARDADA (Slide 31): Remover os primers de RNA e unir os fragmentos de Okasaki. DNA Polimerase I (outro tipo de polimerase) arranca primers de RNA e completa com DNA. DNA LIGASE liga os fragmentos. 
- SUPER-TORSÃO: pode causar tensão de tal modo que pode causar a quebra do DNA se ele não estiver organizado em estonas. Para retirar, precisa-se cortar uma ou as duas fitas (depende da enzima que resolver o problema), deixar ele girar e depois refazer a ligação química, assim, tira-se a torção. 
- TOPOISOMERASES: enzimas que trabalham tirando tensão. A de tipo II tem um mecanismo muito mais controlado que a de tipo I. 
- Sem o trabalho da topoisomerase, forquilhas ficam entupidas devido à formação de enovelamentos.
- TELOMERASE: cria polirepetições nas pontas do cromossomo, sendo muito maiores que a região, de fato, útil. Assim, essas pontas podem descartadas na replicação. Aumenta quem vai ser a fita líder, para poder fazer a retardada mais vezes. Ela tem um molde de DNA presa nela, podendo crescer fitas nela mesma. É um mecanismo de proteção do cromossomo. Ao passar dos anos, sua expressão gênica diminui uma vez que é menos produzida no corpo.
TRANSCRIÇÃO
-O processo de transcrição é a leitura do DNA e a produção de um RNA. Posso transcrever genes que geram RNAmsg e também genes que geram outros tipos de RNS (como ribossomais, transportadores...). Após isso, o RNAmsg é traduzido a AA. Lê-se apenas uma das duas fitas.
- RNA transportadores são moléculas de RNA que levam AA pra síntese proteica no ribossomo. 
-RNA tem OH na posição 2, enquanto o DNA não tem. Isso faz com que a estrutura do RNA seja mais lábil, menos estável. Bases nitrogenadas do RNA: A, U, C e G. *U é gerada no lugar do T. 
-RNA forma estrutura tridimensional, tendo pontes de H entre suas bases nitrogenadas. 
- Características gerais: precisa de um molde de DNA; precisa de RNA polimerases que fazem a polimerização; nucleotídeos tri-fosforilados, co-fatores; NÃO precisa de primer, a RNA polimerase se liga diretamente ao molde, diferentemente da DNA polimerase que precisa de primer. *o molde do DNA não é danificado.
-RNA polimerase precisa de proteínas acessórias pra exercer sua função.
-Tipos de RNApolimerase: I transcreve genes pra RNAribossomal; II transcreve genes que codifica proteínas, é a mais acionada pois é aquela que faz a transcrição de RNA pra RNAmsg; III genes que codificam RNA transportadores.
Transcrição em Procariotos
INÍCIO DA TRANSCRIÇÃO:
Quando se forma a holoenzyma (RNA polimerase se liga ao fator sigma) e esse tântamero começa a escanear a fita de DNA procurando a região promotora (que mostra o início da transcrição). Região regulatória pode bloquear ou estimular a transcrição; Ela desnovela aquela parte e começa a transcrever dali em diante pois ela encontrou as sequências nucleotídicas especificas pra iniciar. Região promotora tem que ser bastante conservada para que a maquinaria enzimática sempre a reconheça.
A região promotora tem dois blocos muito conservados, chamados de -35 ePribnow box(-10). Esses dois blocos distam-se entre 11 e 15 nucleotídeos. Uma vez que a polimerase consegue identificar essas duas sequências (blocos), ela sabe pra onde vai transcrever. Se a -35 tiver a esquerda e a pribnow box na direita vai transcrever pra direita. Se encontrar ao contrário, transcrição pra esquerda. O início da transcrição varia entre 5 a 8 nucleotídeos a frente do pribnow Box. 
ELONGAÇÃO DA TRANSCRIÇÃO:
Elongamento do RNAmsg com o deslocamento da polimerase e o DNA se desenrolando com isso (não há helicase aqui, quem desenrola é a própria RNA polimerase). A polimerase que polimeriza sentido 5->3 ela tem que ler 3->5. 
TÉRMINO DA TRANSCRIÇÃO:
O término é detectado por regiões estruturadas palindrômicas, de crucifixo ou de grampo. Uma região de crucifixo no DNA gera um grampo no RNAmsg que ta sendo sintetizado
Transcrição em Eucariotos
INÍCIO DA TRANSCRIÇÃO:
Não tem-se o fator sigma. O que tem são várias proteínas com a função dele, chamadas de fatores de início transcricionais. Precisa-se da associação dessas proteínas na região promotora e a RNA polimerase vai se associar nas proteínas. Isto é, quem reconhece a região promotora não é a polimerase, mas sim os fatores transcricionais. Tem a região -35 e TATAbox, com espaços conservados (regiões consenso) e também a +30 que é reconhecido por uma proteína de fator transcricional. O início da transcrição ocorre entre esses blocos, buscando dois sinais na região promotora e um sinal já na região a ser transcrita; Esses 3 sinais dão ok pra polimerase começar a transcrição.
TBP reconhece o TATAbox, dobrando a fita.
A região regulatória normalmente ta antes da promotora, mas também pode estar dentro da região a ser transcrita. Fatores transcricionais tem a capacidade de acentuar ou bloquear a transcrição de um gene. Genes que tem a mesma região regulatória normalmente são transcritos juntos. 
ELONGAMENTO DA TRANSCRIÇÃO:
A cauda carboxílica da RNApolimerase 2 é fosforilada e fica liberada pra começar a transcrever até encontrar o sinal do término. Assim, o que RNAmsg é sintetizado, as enzimas de CAPeamento derivatizam a ponta 5’ do RNAmsg, protegendo. Se retirar o CAPeamento, o RNAmsg dura muito menos tempo. 
*Genes de procariotos não tem íntrons,então tudo é transcrito. Em eucarioto é diferente, tem-se íntrons e exons. A transcrição transcreve a região codificante, que é a exon. Os genes de eucariotos são fragmentados, tem-se regiões codificantes (exons) e espaçadoras (íntrons). Os íntros são retirados por CAPeamento, metilações, splicing. Se o íntron não for retirado, não há a transcrição. Então, a maquinaria de splicing é responsável por remover os íntrons. Ao final do meu processo de transcrição, tem-se o RNAmsg maturo. Obs: A polimerase não identifica exon e íntron. Há também o splicing alternativo. Diferentes tecidos podem ter variantes de splicing de um mesmo gene, gerando RNAmsg maduros diferentes, dando proteínas semelhantes ou diferentes.
TÉRMINO DA TRANSCRIÇÃO:
Acontece quando detecta-se um sinal de parada de transcrição, levando a clivagem do RNAmsg e a poli-adenilação do RNAmsg, ou seja, consegue uma proteção na ponta 3’
Evidências macroscópicas da Transcrição
A parte menor do gene é o início da transcrição, e a maior é o final da transcrição conforme vai crescendo. Começa com DNA numa linha, depois as RNA polimerases entram em ação produzindo RNAribossomal, ‘’ramificando’’ essas linhas. É possível fazer transcrição simultâneas. 
Mecanismo de reparo na Transcrição
Quando a RNApolimerase identifica uma lesão, ela para a transcrição. Ela sai e entra um fator transcricional (TFIIH) que recruta proteínas de reparo, estas então reparam essa lesão. Caso o dano seja uma base oxidada, recruta-se um conjunto enzimático que troca apenas um nucleotídeo. Se o erro for um produto de UV pode fazer alteração química entre bases que estão na mesma fita, entre timinas, aproximando-as e sendo lidas como uma só. Arranco um pedaço daquela fita e completo esse pedaço com uma fita complementar reversa. 
Obs: tem organismos que tem mecanismos de reparo pra UV que nós mamíferos não temos. Eles têm enzimas que é sensível a luz do dia e essas enzimas cortam as ligações entre Carbonos, reparando-as mais facilmente. 
Transcrição reversa
Processo normalmente feito por vírus, porque ele pega uma molécula de RNAmsg sintetizando uma fita de DNA. 
Transcriptase reversa é muito utilizada pra fazer isso.
REGULAÇÃO DA TRANCRIÇÃO
-A regulação da transcrição é importante pois os genes não são transcritos na mesma intensidade em todos os momentos, em todos os tipos celulares... Cada gene tem o início de transcrição celular para cada célula para cada sinal de estímulo que a célula reconhece. 
-Gene é a unidade transcricional dos procariotos. Contém a região promotora. 
-Existe uma região regulatória normalmente anterior a região promotora. A região promotora é onde a RNApolimerase vai se ligar. A região regulatória tem seus elementos regulatórios, cada um permitindo a ligação de uma proteína regulatória que se chama de fatores transcricionais (isto é, são proteínas que se ligam na reg regulatória, ativando ou inibindo a transcrição gênica). A presença desses fatores transcricionais podem facilitar ou dificultar a associação da RNA polimerase, e é assim que aumenta-se ou diminui a transcrição de um gene, ou seja, produzo mais ou menos cópias de RNAmsg (isso em eucariotos).
-Em procarioto, a região regulatória tb é chamada de operadora. Quando há um ativador ligado tem-se a transcrição. Caso contrário, um repressor ta ligado não tem a transcrição. O região operadora (liga a uma única molécula) é tudo ou nada. Há ou não a transcrição. Não tem como ter diferentes intensidades. *As plantas tem um arsenal gênico e uma regulação de transcrição muito mais complexa que nós que temos a habilidade de locomoção* Regulação positiva: quando tem o ativador, tem a transcrição. Quando não tem o ativador, não tem a transcrição; Regulação negativa: quando tem o repressor, não tem a transcrição. Quando não tem o repressor, tem a transcrição.
-Há 7 maneiras diferentes de fazer um sinal fora da célula entrar na célula: a) a proteína não existia antes e quando é sintetizada ela já esta na sua conformação ativa, alterando + ou – a expressão gênica; b)por ligação, um hormônio se liga a célula e aí este conjunto imite o sinal; c) fator transcricional pode ser fosforilado; d) o fator pode se ligar a uma segunda proteína; e)o fator pode ser liberado de um dímero; f) proteína inibitória sai; g) se quebra.
-Operon: conjunto de genes que estão sob regulação na mesma região regulatória, ou seja, é a minha unidade transcricional em procariotos. Onde começa e termina a transcrição. Só existe em procarioto (bactéria). Ele economiza espaço no genoma e tempo. 
-Quando transcreve todo mundo, produzo o RNAmsg policistrônico, pois tem várias regiões a ser traduzida. 
OPERON DA LACTOSE (procariotos)
Esse operon tem a região promotora, onde a RNA polimerase vai se ligar. Tem a região operadora (reg regulatória, bloqueando ou permitindo a transcrição). O repressor liga na região operadora. 
Glicose presente (cAMP), sem lactose: não há RNAmsg lac
O repressor não ta com a lactose ligada. Ele se liga então na região operadora e não é produzido o RNAmsg, ou seja, não há transcrição.
Glicose presente (cAMP baixo), lactose presente: pouco RNAmsg lac
A lactose liga no repressor e bloqueia ele. Então o R não consegue mais ligar na região operadora, então a transcrição acontece pela RNA polimerase, mas ainda não está no nível alto pois ta faltando um segundo estímulo, o CAP não ta interagindo com a região promotora. Se tem glicose no meio, ela tem maior prioridade de metabolização. Ou seja, o operon da lactose responde a duas coisas: a presença da lactose libera o operon pra ser expresso;a glicose, precisa da ausência de glicose pra ser expresso em grande quantidade.
Glicose ausente (cAMP alto), lactose presente: muito RNAmsg lac
Na ausência de glicose,o RNAmsg lac é expresso em grande quantidade. Há a produção de cAMP e este liga no CAP e o cap liga na região promotora, aí a RNApolimerase reconhece muito melhor e faz a transcrição, gerando uma grande quantidade de RNAmsg lac. 
-A proteína Y é o canal da lactose; Z é o gene da b-galactosidade (pega a lactose e quebra em galactose e glicose, a glicose segue a via glicolítica e galactose vai ser isomerizada pra virar um intermediário da via glicolítica); A é uma válvula de segurança, desitoxicam moléculas (acetilando lactose, saindo da célula).
*se tem presença de glicose, não produzo cAMP (segundo mensageiro). Baixa qtde de glicose, tem pouco cAMP. Sem glicose, cAMP ligado no CAP (eficiente)
OPERON TRIPTOFANO (procarioto)
A célula só aciona esse operon se ela não encontrar triptofano no meio em que ela está (trp não é essencial). O sensor detecta a ausência de trp. Quando há trp, ele se liga ao repressor, e o conjunto liga a região operadora (faz um RNAmsg mais curto). Isto é, presença de trp o repressor liga e faz uma transcrição curta. Quando não tenho trp, o repressor não liga, o operador ta livre e a RNApolimerase transcreve todos os genes para a síntese de trp. *No caso da lactose eu acionava o operon quando tinha lactose. Nesse caso, eu aciono quando NÃO tenho triptofano.*
REGULAÇÃO DA TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS
-Os genes estão quase sempre silenciados, desligados, isto é, em eucariotos pouco são os genes que são constitutivos (expressos por padrão), mesmo a cromatina sendo desnovelada;
-Cromatina limita a acessibilidade das proteínas regulatórias e fatores transcricionais, isto é, talvez tenha o fator transcricional pra fazer uma transcrição mas ela não acontece pq o gene ta enovelado;
-Um mesmo fator transcricional em tipos celulares diferentes pode levar a produção de proteínas diferentes, pq a região que ta desnovelada é diferente, desnovela-se a parte que interessa pra cada fator;
-O aparelho basal de transcrição depende de um imenso número de proteínas regulatórias. O aparelho basal de transcrição é mais complexo em eucariotos do que em procariotos. No procarioto tem o fator sigma que liga na RNApolimerase transcrevendo. Em eucarioto tem várias proteínas.
-Diversos padrões de expressão gênica são gerados pela modularidade e cooperatividade das proteínas regulatórias que interagem uma com as outras e com o aparelho basal. *cooperatividade: hemoglobina ligando ao oxigênio.
*Construo um gene sintético com uma região regulatória padrão pra bactéria, tiro os genes normais e ponho um gene que quando for traduzido gera uma proteína fluorescente. Então se eu pegar esse DNA sintético que eu fiz e injetar numa bactéria e pô-la pra crescer, ela será fluorescente. Esse é o controle.
-RNApolimerase ligada a vários fatores de início transcricionais, posicionados em torno do TATAbox. Antes da região promotora tem elementos regulatórios na região regulatória. A região regulatória normalmente é antes da promotora (Tb tem após).
Sinergismos transcricional (cooperatividade)
Com uma cópia do elemento regulatório um fator de transcrição liga, estimulando a interação da RNApolimerase e as proteínas pra ter a transcrição em uma unidade de x, produzindo 1 unidade de transcrição. Agora com 4 vezes desse elemento regulatório, permito a ligação de 4 fatores transcricionais, tendo 500 unidades de transcrição. 
Ou seja, o sinergismo transcricional é quando ponho mais elementos na região regulatória, tendo mais fatores transcricionais e então acontece a transcrição em maior intensidade.
Condensação da cromatina
Cada bolinha amarela é uma histona (proteína globular, onde a hélice de DNA ta super enovelada em cima dessa histona). Estão interligadas formando um bloco onde o DNA ta na superfície. Posso desnovelar esse bloco de duas maneiras: remodelagem da cromatina, esse complexo identifica uma área específica, aumentando o espaço entre as histonas e toda aquela região vai ta disponível pra ser transcrito; acetilação de histonas identifica o mesmo sinal e começa a acetilar as histonas naquela região e aí permitem o acesso, sendo uma região mais restrita pois não tem um grande desnovelamento. Assim, pode-se ter a transcrição, ou por desnovelamento de grande porte (remodelagem) ou com a marcação por acetilação. 
Para reverter o processo, precisa de um complexo de reorganização da cromatina, que enovela novamente a cromatina. Ou recruta histonas desacetilase, tirando a marcação daquela região a ser transcrita.
Exemplos de elementos regulatórios
-CREB: fator transcricional que se liga a região CRE, respondendo a sinal de cAMP (ausência de glicose, jejum). CREB liga na reg regulatória, ativa a transcrição e produz uma enzima PEPCK (enzima de biossíntese de glicose)
-Hormônios lipossolúveis e hidrossolúveis podem regular a transcrição gênica. Quem não entra na célula, manda recado fazendo o efeito acontecer. Quem entra na célula liga direto no fator transcricional.
TRADUÇÃO
Revisão: Toda informação genética do DNA pode ser replicada quando a célula vai fazer mitose (temos células 2n e viram 4n pra depois fazer mitose). De DNA ele é transcrito pra RNAmsg (cópia de um determinado gene –eucarioto- ou operon –procarioto-). O RNAmsg é maturado, perdendo os íntrons e tb CAPeado numa ponta e poliadenilado em outra, com funções de proteção, sinalização etc. O RNAmsg maduro é utilizado no processo de tradução nos ribossomos para a produção de proteínas (lê-se cada trinca, produzindo AA).
Código Genético
-Código de 3 bases nitrogenadas diferentes. 43= 64 aa possíveis, porém existem 20 aa. 
-Portanto, tem geralmente mais de 1 códon que codificam o mesmo AA. E tb que não correspondem AA nenhum, como stop códon (sinal de parada de tradução).
-Código genético redundante: Mais de um códon para o mesmo AA.
-O código é lido a partir de um ponto fixo e a partir dali é lido de 3 em 3, porque se perder o ponto que comecei a ler codificará AA diferentes.
-Código genético degenerado: tem mais de um códon gerando o mesmo AA. A mudança é mais frequente na 3ª posição do códon. Objetivo: proteger de mutação, pois tem a possibilidade de ter mutação silenciosa. E mesmo se a mutação não for silenciosa eu ainda tenho chance de ter um AA com a mesma característica, diminuindo o potencial maléfico de troca de AA). *Triptofano e metionina só tem um códon pra cada um deles, mudou esse códon mudará o aa*
-Normalmente AA que tem característica química parecidas, tem uma conservação nas letras dos códons (códons parecidos).
-Em eucariotos, quando tem uma mutação a maior chance é que ela caia numa região não-codificante. Assim, tenho uma mutação que raramente vai afetar o funcionamento de algo (mutação silenciosa – troca um códon por outro que codifica o mesmo AA). Quando essa mutação cai numa região codificante, ela vai alterar o códon e então talvez mude o AA (mutação não silenciosa – o aa é trocado por outro pela alteração do códon. Porém, cai em duas consequências diferentes: muda pra outro AA com característica química semelhante, deixando ainda funcional ou uma troca que altere totalmente)
-Frame de leitura é a capacidade de =ler de 3 em 3 nucleotídeos. O ribossomo acha o códon inicial (AUG da metionina) e cada vez que ele se deslocar no RNAmsg, ele vai se deslocar de 3 em 3 nucleotídeos. In vivo, é o frame +1 (leitura começa no primeiro nucleotídeo que tem que ser lido). Frame +2 e +3 não existem In Vivo, nenhum ribossomo acha o códon inicial e pula um nucleotídeo ou dois, respectivamente. *O ribossomo nunca erra, nunca pula um ou dois, mas RNAmsg pode ter sido alterado de forma que ele tenha recebido um ou perdido um nucleotídeo que deveria estar ali. 
Etapas da Tradução
-A tradução acontece da seguinte maneira: primeiro ativa-se os AA (precisam ser ligados aos RNA transportadores através da enzima RNAt sintetase), depois montar o complexo (ié, o ribossomo precisa pegar o RNAmsg e prendê-lo no complexo com as duas unidades, tendo as proteínas assessórias que ajudam a se montar) e chegar o RNAtransportador pra ter a elongação da cadeia com adição de AA subsequentes e o término da cadeia. 
-RNA transportador está no genoma, existe um gene pra ela, ela é transcrita e aí se enovela. 
-RNAt sintetase por AA. 
1) Ativação dos Aminoácidos
-A enzima RNAt sintetase (junto com o RNA transportador) tem um sítio de reconhecimento do AA, gasta energia pra fazer a ligação entre eles. 
-A RNAt sintetase tem sítio de síntese e o de conferência. Após ela ter colocado o AA, o RNAtransportador é dobrado pro outro lado e tem-se uma conferência química. Se tivesse posto uma AA errado, ela vai removê-lo. Ou seja, ela sintetiza RNa ativado, dobra e confere se o AA é correto. 
*O ribossomo só confere se o códon corresponde ao anti-códon. Mas o AA ligado é conferido pela RNAt sintetase somente, por isso é importante conferir logo na ativação. 
-Pareamento oscilante: pareado no RNAmsg já com o ribossomo montado. Tem especificidade do códon com o anti-codon, são complementares reversos. Checa-se se tem ponte de hidrogênio corretamente, e aí esse AA é inserido na proteína que ta sendo produzida. 
-Nucleotídeos modificados: alguns nucleotídeos podem estar modificados e isso altera o pareamento das bases do códon com o anti-codon, afetando a exatidão do AA que será inserido. Pode ter uma derivatização ou alteração no RNAmsg ou transportador e isso da um pareamento errôneo. 
-Pareamento oscilante: tem uma 3ª posição que é mal-pareada, que não tem todas as pontes de H feitas adequadamente. É a posição que não é perfeitamente checada pelo ribossomo. Acontece e depende do RNAtransportador. Objetivo de reduzir os erros., permite que 61 códons de bactérias (procarioto) com apenas 31 tipos de molécula de RNAtransp. Anti-códons podem não ser o encaixe 100% ótimo para o códon, mas é aceitável.
2) Iniciação
-Ribossomos são enzimas, são complexos de RNA e proteína. 
- O códon iniciador metionina (AUG) para procariotos e eucariotos.
-Procariotos: começa depois da sequência de Shine-Dalgarno (AGGA) no primeiro AUG, ou seja, o ribossomo procura pelo Shine-Dalgarno e a tradução começa a partir do primeiro AUG. Pode ter vários Shine-Dalgarno, pode ter vários pq os RNA são policistrônicos, é um RNA para cada operon.
-Eucariotos: a sequência mais próxima do terminal 5’ do RNAmsg serve como códon de início. Cada RNAmsg é um gene.
-A tradução se inicia com a subunidade menor do ribossomo junto com os fatores de início de tradução se associam ao RNAmsg e acham a região de Shine-Dalgarno em procariotos, e a uma distância ta o AUG. Agora vem o RNAtransportador com os fatores de início de tradução, se associando e a subunidade maior do ribossomo fecha o pacote e agora com o ribossomo montado segue começando a transcrição. 
-Em eucariotos, a tradução começa inicialmente com alguns fatores de tradução checando o RNAmsg, ié, checam se o CAPeamento é íntegro e se ele tem cauda Poli-A, fazendo essa associação. A subunidade menor do ribossomo se associa com o RNAtransportador da metionina (AUG) usando alguns fatores transcricionais. Esses dois complexos se unem e estão posicionados no começo do RNAmsg, agora começa a escanear o RNAmsg procurando o AUG para poder começar a tradução nesse ponto. 
3) Elongação
-Processo de deslocamento do ribossomo em relação ao RNAmsg. Pra cada novo AA adicionado, o ribossomo tem que se deslocar pra ter o sítio de entrada vago (ele tem o sítio de entrada, síntese e saída). *Sempre gasta energia.
-A maioria das proteínas já vão se enovelando conforme a produção.
-A tradução sempre adiciona a proteína que já foi produzida no AA que ta chegando. 
-RNAtransportador precisa de uma proteína que auxilia no processo de elongação. O deslocamento do ribossomo no RNAmsg, a síntese da ligação peptídica, isso tudo gasta energia. Quem traz energia são os fatores de elongação.
4) Término
-Em procariotos e eucariotos sempre tem fator de término (identificam o código de parada)e funcionam assim: tem uma proteína que imita um RNAtransportador, ou seja, ela encaixa no ribossomo no mesmo lugar que o RNAtransportador encaixaria. Tem um códon de parada e não tem RNAtransportador que tem um anti-códon para o de parada, mas essa proteína parecida com o RNAtransportador tem, e aí quando ela entra, faz essa maquinaria se desmontar, hidrolisando a proteína solúvel.
-Intensidade de tradução: se a mutação troca um códon por outro, do mesmo AA, mas que usa um RNAtransportador 100x mais abundante, esse gene vai ser muito mais expresso, vai ter maior quantidade e isso traga uma performance melhor desse organismo, tendo mais descendente e essa mutação tem mais chances de ser fixada pela evolução (seleciona códons que são frequentes para os AA, RNAT que são mais abundantes). Os genes muito expressos precisam de RNAtransportadores abundantes pra que eles sejam muito expressos. 
-Falso término: Um stop-codon nem sempre é um stop-codon. As vezes realmente é stop, outro é pra um AA específico. Se tiver somente um stop-codon, realmente é de parada. Se ele tiver associado a mais alguma coisa, não é de parada. 
Tradução de Operons
-Tinha um operon de 3 genes na bactéria, fez-se a transcrição e gerou o RNAmsg policistrônico com 3 Shine-Dalgarno (azul escuro). Ao lado de cada um deles, tem um AUG. Ao final de cada região codificante, tem que ter um stop-codon. Esse conjunto na hora de ser traduzido, simultâneamente nos 3 pontos. Pode entrar 3 ribossomos de uma vez. Gerando diferentes proteínas. 
Tradução usando Polirribossomos
-Se um ribossomo libera um AUG, a fila anda, vem outro ribossomo no lugar dele e se liga. Tem-se então várias ribossomos presos no mesmo RNAmsg e há proteínas em diferentes pontos. *Genes muito expressos usam códons de RNAtransportadores que são abundantes.*
Antibióticos e Tradução
-Tetraciclina entope o sítio de entrada do ribossomo de bactéria, perdendo a capacidade de síntese proteica; Streptomicina fixa os fatores de início de transcrição do ribossomo, então ele nunca fica pronto pra elongar, bloqueando a capacidade de tradução; Cloranfenicol impede a síntese da ligação peptídica; Eritromicina age na transcrição, bloqueando-a. Etc.
MUTAÇÃO E REPARO NO DNA
-Danos ao DNA: erros de replicação (traz a inserção de uma base mal pareada); substância do ambiente (derivatizações); calour; acidentes metabólicas; radiação...
-Todos esses danos não necessariamente vão virar mutação. A cada 1000 alterações acidentais no DNA, 1 se torna uma mutação permanente (aquela que não pode mais ser detectada pelo sistema de correção).
-Um dano só pode ser detectado no DNA enquanto ele não é completamente introduzido, ou seja, uma fita errada e uma certa. 
Pontos passíveis de danos no DNA
-Danos oxidativos: bases nitrogenadas e açúcares podem ser oxidados, geralmente em metilas e dupla lig.
-Ataques hidrolíticos: quebra a estrutura, removendo a base nitrogenada inteira. Pode ocorrer em aminas tb
-Metilações: em nitrogênios da base nitrogenada.
-Qualquer uma dessas alterações do nucleotídeo que ta com erro pode ser consertada através da leitura da fita complementar. 
Radiação UV pode produzir dímeros de pirimidina (T/T)
-Cria ligações C-C que não existem entre as bases nitrogenadas adjacentes, aproximando-as e sendo lidas como uma só. Podem ser corrigidas com fotorreparo (para mecanismos não-mamíferos). Tecido epitelial é o mais atingido. É a principal mutação que causa câncer de pele.
-Na hora de fazer replicação ou transcrição eu pular um nucleotídeo pq está próximo do outro e isso tiver numa região codificante, em algum momento essa modificação vai chegar no RNAmsg e o ribossomo na hora de ler, o frame de leitura será alterado e a tradução do ribossomo será toda errada. 
Reações espontâneas que danificam o DNA
-Depurinação: hidrólise que arranca a base nitrogenada.
-Deaminação: perda da amina da Citosina, passando a ter Uracila. Se for perda de Guanina, não terá nada. 
DNA não usa Uracila. Se tiver no DNA, é porque veio de uma Citosina desaminada. Por isso que não Uracila no DNA, para fazer essa distinção.-Desaminação: os produtos da desaminação espontânea de A, G e C são reconhecidos como não-usuais, quando ocorrem no DNA e precisam ser consertadas.
-Pirimidinas: C e T (1 anel) ; Purinas: G e A (2 anéis)
Metilação e Desaminação sequencial (C -> T)
-Não tem como ser rastreado se acontecer no mesmo nucleotídeodevido a um mal pareamento. E aí quando é replicado gera uma fita-filha igual a original e uma fita-filha mutada. Tranforma uma C em T.
Por que o U foi trocado pelo T no DNA?
- DNA não usa Uracila. Se tiver no DNA, é porque veio de uma Citosina desaminada (U). Por isso que não Uracila no DNA, para fazer essa distinção. O sistema de raparo seria incapaz um C desaminado (que vira U) de um U de ocorrência natural.
Mutações derivadas de erros no DNA
- Se não forem corrigidas, grande parte das alterações levam a deleção de 1 ou mais pares de bases do DNA ou à substituição de um par de bases na cadeia filha do DNA.
-Ex: Mutação de pareamento em U que é o erro (1º fita) com G (2° fita). Na replicação da 1° fita, há erro pois ira ser pareada com uma A por 3 ligações de H, sendo mutada. Já na replicação da 2° fita, G irá se parear com C normalmente por 3 lig de H, sendo normal. 
Locais e Idades das mutações
-Se as mutações ocorrerem mais cedo na vida de um organismo, elas serão mais dispersas no tecido e nas células desse organismo. Se uma mutação acontece logo quando um espermatozoide se junta ao óvulo, formando a primeira célula, logo essa mutação estará em todas as células desse organismo, diferenciada ou não. Mutações que acontecem mais tardiamente na vida, vão estar presente em poucos tecidos. Qualquer mutação que esteja nas nossas células reprodutivas serão passadas aos descendentes. 
Tipos de mutações e consequências funcionais das mutações
Quando cai dentro de uma região codificante:
-Mutação silenciosa: não muda o AA (geralmente muda-se a 3° posição do códon)
-Sentido trocado: muda o AA.
Ex: Anemia falciforme. Troca-se um único nucleotídeo, mudando o AA. Glu (GAG) é mutado para Val (GUG). Muda a solubilidade, a Hgb passa a se polimerizar em baixas pressões de O2. Porém, essa mutação traz resistência à malária, por isso se fixou na África. O balanço é positivo se levarmos em consideração o altop índice de malária em detrimento do baixa necessidade de movimento (que leva a morte das Hgb em alto movimento).
-Sem sentido: a tradução acaba antes do esperado (códon->stop)
-Alteração no frame de leitura: todos os códons vão ser lidos diferentes pela perda ou ganho de um nucleotídeo.
*Da pra pular um stop códon prematuro usando uma droga específica que afrouxe a exigência de correção do ribossomo.*
Mecanismos de Reparo de fita simples (pré-replicação)
Dependem da fita complementar, tendo o erro apenas em uma fita. Corrige um lado baseado no outro. 
Acionam antes da replicação, pois depois é capaz de virar uma mutação. 
-Reparo por excisão de base: repara 1 nucleotídeo apenas. A DNA glicosidade reconhece a base nitrogenada defeituosa, removendo-a e recrutando a DNA polimerase (add nucleotídeos) e a DNA ligase (sela a lig).
*Se tiver mais de um nucleotídeo errado, não dá pra reparar por excisão de base. Então qlqr derivatização quím da base nitrogenada ou a falta de uma base nitrogenada, pode recrutar essa via. 
-Fotorreparo: uma enzima estimulada pela luz visível corta as ligações extras entre as pirimidinas (T/T). (Para mecanismos não-mamíferos).
-Reparo por excisão de nucleotídeos: repara vários nucleotídeos. Múltiplos e quaisquer qnt de danos próximos aciona-se esse reparo, cortando várias bases pela DNA nuclease, abrindo o DNA com a helicase e recrutando a DNApolimerase, add os novos nucleotídeos.
*Se tiver um organismo menos complexo, o mecanismo que manterá é o por excisão de nucleotídeos pois essa corrige o erro que a base corrige, além de vários erros. Arranca a parte do DNA errada, reparando-a. 
*Todos são mecanismos co-transcricionais (o DNA não deixa pra depois o que pode fazer agora, se a polimerase engasgar durante a replicação devido a algum erro, o fator TFIIH é acionado e a polimerase se desliga e é reparado por um mecanismo. 
*Quando tem erro ao longo de toda a fita, aciona-se todos os mecanismos de reparo. Se tiver erros subsequentes na fita e um erro longe deles, aciona-se o reparo por excisão de nucleotídeos para o primeiro e o de base para o segundo.
*Se a mutação cai na região codificante ou promotora causa câncer (tumor). 
Reparo pós replicação (em procariotos)
-Reparo por excisão de base dependente de metilação. As fitas-mães são metilas e as filhas ainda não estão metiladas. Quando nota um erro, eu sei qual é a fita antiga e a nova. Então eu sei qual a fita que deve ser reparada. Então se DNApolimerase erra, os procariotos conseguem corrigir isso logo após a replicação pois a fita-mãe ainda ta metilada, sendo o sinal de que está certa. 
Reparo pós replicação (em eucariotos)
-Reparo por excisão de nucleotídeos. Arranca os nucleotídeos em torno da região errada. Não sabe se escolheu o lado certo ou errado, pois não tem metilação pra identificar as certas. Há apenas distorções que indicam erro. 
Reparos de quebras na fita dupla de DNA
-Quando há um dano na fita dupla, não sabe se o corte deixou terminações iguais, se perdeu parte do DNA deixando desiguais. Uma quebra de fita dupla é danosa por isso, pois não tem como usar uma fita como molde pro reparo, já que as duas se quebraram. Corrige-se consultando a segunda cópia do material genético, cromossomo homólogo ou juntando. É melhor perder um pedaço do que todo o cromossomo. Assim, apara-se as pontas pra que elas ficam possíveis de serem encaixadas, ligando-as. Esse reparo se chama de junção terminal não-homóloga. Melhor perder um pedaço do que um cromossomo inteiro. Se der ruim, as células tem mecanismos de apoptose e se matam. *Esse mecanismo de reparo tem um certo respaldo, uma vez que grande parte do nosso DNA não é codificante pra nada (inclusive isso talvez seja uma maneira de nos protegermos de danos, mutações, já que as chances desses danos caíram numa região codificante é pequena porque 90% do DNA não é codificante, é apenas estrutural.* 
Tem-se tb a junção terminal homóloga, acessando o cromossomo homólogo na mesma região, reconstruo a região que foi perdida em fita simples e depois faço cópia dessa fita, fazendo a fita dupla. Esse mecanismo não é o preferencial. Usa nucleases para aparar as pontas e ligases pra ligá-la.
-As pontes de H que dão o aval se a região ta certa ou não.
Mutações em genes relacionados a reparo do DNA
- Xeroderma pigmentosa: câncer de pele e sensilibilidade a luz UV. Torna a pessoa incapaz de reparar os dímeros de pirimidina causadas pela radiação UV.
-Ataxia-telangiectasia: hipersensibilidade a raios-x e predisposição à linfomas.
ISOLAMENTO E MANIPULAÇÃO DE UM GENE
Importância da Engenharia Genética
-Análises de DNA (paternidade, forense, predisposição a doenças); Melhoramento de culturas e maior produtividade de alimentos (transgênicos); Produção de Vacinas e Medicamentos Imuno-Biológicos; Melhoramento de Processos Industriais (áreas de energia, meio ambiente etc).
Etapas básicas da Clonagem
Clonagem é pegar uma região contendo ou não genes e colocá-la no tubo de ensaio de maneira controlada, tendo uma maneira de fazer cópias, cortando, ligando pra que ela seja replicada com qualidade, sem erros. 
- Preparar o gene ou DNA a ser usado (escolha; amplificação; digestão)
- Escolher um vetor de clonagem (um esqueleto de DNA que ao ser inserido num organismo garanta a replicação, transcrição e tradução). Essas moléculas são geralmente plasmídios e DNA viral.
- Pegar o pedaço de DNA de interesse no vetor de clonagem, colocar dentro de um organismo, ligando covalentemente e vai transferir DNA recombinante pra uma celula hospedeira que emprestará sua maquinaria enzimática para a replicação desse DNA.
-Selecionar ou identificar as células hospedeiras que contém o DNA recombinante (DNA de interessante) e quais abriram o poro e não entrou nada, fechando-ovazio. 
Resumo: tenho o esqueleto de DNA que controlo com etapas de controleo e o pedaço de DNA que quero estudar, ligo os dois e faço um pedaço único de DNA e dou um estímulo pra célula hospedeira pra abrir poros (choque elétrico, térmico ou hosmótico). O DNA que ta na mesma solução entra aleatoriamente. Depois seleciono as células que receberam o DNA recombinante e as que não receberam. 
-Posso pegar pedaços específicos os aleatórios do DNA
-Não posso pegar o DNA de eucariotos e por diretamente em procariotos. Tem-se que tirar os íntrons pra depois inserir em uma bactéria. Então poderia pegar o RNAmsg maduro (que não contém íntrons) de um eucarioto e inserir num procarioto.
Escolhas iniciais e preparação
 Ver esquema do slide. 
- Purificar o RNAmsg ou DNA e transcrição reversa para o caso de RNA.
-Amplificação da região ou gene de interesse (PCR- coloco uma DNA polimerase, tampão, substrato dela (nucleotídeos trifosforilados), primer e molde). *Como eu sei a sequência do gene de interesse, então desenho um primer que só vai se ligar aquele gene de interesse, não vai se em nenhuma outra sequência que tiver no tubo de ensaio. Assim, aquela sequência de nucleotídeos só vai se ligar na minha região de interesse. Então quando vou amplificar,isto é, fazer várias cópias de uma região, só vai ser replicada a região que o primer liga. 
-Digestão do DNA (ligação, transformação e seleção) significa cortar a região de maneira planejada, tendo uma ponta desalinhada mas conhecida para o inserto correto. Precisa-se de: DNA a ser digerido, endonuclease e tampão adequado.
Transcrição reversa
- Tem-se o RNAmsg com a cauda Poli-A, então posso usar um primer poli-T, fazendo uma fita simples de DNA, se dobrando nela mesma e a DNApolimerase faz a segunda fita, tendo uma fita dupla e a nuclease corta essas pontas pra ter o DNA sozinho. Precisa-se de molde a ser transcrito, transcriptase reversa, primer poli-T e tampão adequado. *Primer randômico se liga aleatoriamente em qlqr lugar. 
Amplificação de DNA ( PCR- reação em cadeia da polimerase)
Tem-se 3 estapas que são repetidas n vezes:
Desnaturação: abro a fita dupla do DNA com o aumento da temperatura. *Normalmente a 94°C. A enzima é a Piroccocus que resiste a essa temperatura, ela para de funcionar mas não desnatura. Quando abaixo a temperatura, tem-se a temperatura de anelamento. 
Anelamento: a temperatura de 55°C permite que o primer que eu desenhei vai ligar na região específica que eu quero (tem que ter energia cinética pra que esse primer não faça ligações inespecíficas). 
Amplificação: a polimerase já começa a funcionar na temperatura de anelamento, porém quando passa pra temperatura ótima da enzima (68°C) ela faz a cópia mais rápido.
- Então pra uma reação de PCR funcionar tem que ter: molde de DNA, primer específico, DNA polimerase, tampão e nucleotídeos solúveis trifosforilados. 
Resumo: temperatura de 94°C abre as fitas, temperatura de anelamento (55°C) primer liga e a enzima já começa a copiar, temperatura ótima da enzima (68°) ela copia mais rapidamente. 
- 2n: começa com duas cópias, no final da rodada tem 4, depois 8, 16, 32, 64. Geralmente tem 40 rodadas, então produz-se 240 que é muito DNA, dando até pra ver em gel de eletroforese. *Pra isso preciso de 2 primers diferente, um que liga na fita molde outra na reversa aí consigo copiar as duas fitas sempre numa mesma rodada! *Se tiver primer em uma fita só o esquema é diferente. 
-Os primers delimitam as áreas a ser copiadas do DNA.
-Primer bom é um que anela bem na região que eu quero e não em outras.
-Então PCR é uma reação in vitro de amplificação de uma região de DNA de interesse que ta delimitada pelos primers. 
Digestão de DNA
-O vetor é um pedaço de DNA circular que tb tem dois sítios de clonagem, desenha-se os primers (um diferento do outro) com os mesmo sítios de clonagem. Utiliza-se uma enzima que abre o vetor, digere o vetor.
-As opções de encaixe para dois sítios iguais são: vazio, vetor, vetor + inserto. Já em dois sítios diferentes, cortados por duas enzimas distintas são: vetor ou vetor + inserto. 
-Não deve-se cortar com o mesmo sítio de clonagem dos dois lados porque o vetor vazio pode fechar sozinho ou encaixar ao contrário e na hora de traduzir vai sair tudo errado. Então cortar com sítios de clonagem diferentes em cada lado, garante o direcionamento da clonagem e evita que o vetor feche sozinho. 
-Corte com 1 enzima de restrição gera pontos coesivos, que podem ser fechados pela ligase sem inserto de DNA externo.
- Corte com 2 enzimas de restrição impede o fechamento do vetor vazio, necessitando do DNA externo. 
-Isso se chama clonagem direcional pois o inserto é direcionado. Com 1 só enzima ele poderia entrar no sentido senso ou anti-senso, pois as duas pontas são iguais. Já com 2 enzimas isso não acontece. 
Análise de fragmentos de DNA (eletroforese em gel de agarose)
- Posso checar se minha reação de PCR funcionou, se a ligação com o vetor funcionou através da eletroforese de DNA (separa por tamanho, já que todas as moléculas do DNA tem carga negativa). Faz-se uma malha de agarose contínua e frouxa pra analisar o que to interessado. Moléculas menores migram mais fácil e as maiores migram menos. *Importância ter massa pra visualizar 
- O resultado da eletroforese após a ligação ter sido feita com o vetor + inserto é esperado ver 2 bandas, o sem e o com inserto.
-Se fizer a eletroforese após a digestão (antes da ligação) são vistas 3 bandas, vetor vazio, vetor normal e o vetor com inserto.
Southern e Northern Blot (Identificação de DNA e mRNA em membranas de nylon)
-Não falou sobre.
Fingerprint de DNA
-Faz-se uma digestão com várias enzimas (tendo padrão de cortes e pesos) e comparar as bandas. Usado em testes de paternidade ou assassinatos. 
Relembrando as etapas iniciais da clonagem
- Purifico o RNAmsg quando quero gene. Em eucariotos tem que retirar os íntros de qualquer maneira, mesmo em fungo, porque a maquinaria de splicing do fungo é diferente dos outros organismos, e aí pode acabar confundindo um íntro com um exon. Faz-se a transcrição reversa e amplifica a região de interesse, confere-se usando a eletroforese pra ver se amplificação ficou boa e faz-se a digestão do DNA pra gerar pontas desalinhadas nos sítios de clonagem, ou seja, os primers que usei no PCR já tinham sítios de clonagem, um pra cada ponta. 
Etapas da digestão:
- Ligação: precisa da DNA ligase e de tampão adequado. A DNA ligase liga as duas fitas. Ao final desse processo ou tenho o vetor original ou o vetor com o inserto. 
- Transformação: choque de temperatura, elétrico...
Ao final da transformação, temos a célula vazia, com vetor normal e com vetor + inserto.
-Seleção: faz-se uma seleção pra ver se a célula ganhou o vetor. Ela pode ganhar um vetor vazio ou o vetor com inserto. Pode ser feita pela habilidade de sobreviver a antibióticos ou crescer em meios de cultura pobres em algum aminoácido ou nutriente.
*Celula vazia (a que não recebeu vetor) é identificada ao selecionar com antibiótico, eliminando-a.
*Célula com vetor normal é eliminada selecionando com lactato desidrogenase (coloração azul), ficando apenas o vetor com inserto, que é o meu interesse.
Então, o antibiótico marca os vetores vazios e a lactato desidrogenase marca o vetor normal. 
P3
INTRODUÇÃO AO METABOLISMO
- Metabolismo é um conjunto de reações químicas que acontecem dentro das células. Precisa-se de energia. Nós somos máquinas oxidativas, tiramos elétrons do alimento. A energia estocamos em forma de macromoléculas.
-A energia obtida pela degradação de nutrientes ou pela fotossíntee é utilizada para realizar 3 tipos de trabalho:
1) Químico: reações necessitam de energia pra ocorrer. Delta G próximo de 0 sugere que a reação é reversível.
2) Mecânico: movimentação de flagelos ou contração de proteínas motoras. Ex.: transporte de vesículas, actina e miosina (contração de músculos)
3) Osmótico: concentrações intracelulares das moléculas é diferente no interior das células eno seu meio ambiente próximo. Bombas que transportam íons pra dentro e pra fora da célula.
Obtenção de Energia Química
- Para heterotróficos: pega-se elétrons de carboidratos, lipídios e proteínas que vem da alimentação e é degradado (catabolismo) em CO2, H2O e NH3. Com esses elétrons produz-se fontes de energia ou moléculas reduzidas NAD, NADP, FADH ou ATP e essa energia química sustenta todo o processo. O excesso de carboidratos, lipídios e proteínas em excesso são estocados. Lipídios e açúcares são estocados como forma energética. Glicogêneo também.
- Para autotróficos: usam energia do fóton pra conseguir fixar o CO2 e produzir glicose. Estocam durante o dia pra usar a noite as macromoléculas pra tirar energia.
*Anabolismo faz-se unidades maiores a partir de menores.
ATP e liberação de energia
-ATP é reproduzido e gasto de forma dinâminca, não tem estoque de ATP. 
-Fosfocreatina (derivada de aminoácido) num momento de falta de ATP, ela pode doar o fosfato dela a um ADP virando um ATP. Então a fosfocreatina é uma reserva energética (principalmente em músculos, fígado). Mas não é tão eficiente pra gente, pois só da segundos de energia. O estoque de fosfocreatina é bastante limitado. Mas pra quem precisa correr muito rápido num pequeno intervalo de tempo, é importante (ex: corrida de 100m).
Outros compostos que têm o ∆G’0 de hidrólise superior ao ATP são
-Fosfoenolpiruvato (PEP) e 1,3bisfosfoglicerato (1,3BPG) são produzidos na via glicolítica e mais energéticos que o ATP. Vantagem: podem produzir ATP.
-Como a célula consegue produzir uma molécula mais energética que o ATP, sem utilizar ATP? Coloca um fosfato não-energético numa posição não-energética, não gasta ATP. Então ela rearranja a molécula, põe dupla, tira hidroxila... tornando esse fosfato muito energético. 
-Depois dessas duas moléculas, tem-se a fosfocreatina e as hidrólises do fosfato são as mais energéticas.
Resumo: PEP, 1,3BPG e fosfocreatina podem levar produção de ATP e o ATP é usado pra produção de outras biomoléculas fosforiladas (glicose, glicerol). Só produzo ATP a partir dessas e o ATP é utilizado como fonte de fosfato pra várias outras.
Outras formas de usar ATP: Intermediário ativado com fosfato
- ATP pode ser usado como intermediário ativado. Liga-se uma molécula no ATP com um lig temporário e depois esse ATP é trocado pela molécula definitiva. Ex: o glutamato vira glutamina, ligando o fosfato na hidroxila com uso de ATP e depois troca-se o fosfato pelo grupamento amino.
Outras formas de usar ATP: Intermediário ativado com AMP e quebra de pirofosfato
-Agora quem fica ligado temporariamente não é o fosfato, é o nucleotídeo
Há outras formas de energizar uma molécula além da fosforilação: CoA
-Coenzima A liga-se a uma molécula temporariamente e depois a troca pela molécula ligante de fato.
Há outras moléculas que são equivalentes energéticos
- Pra retirar elétrons do alimento e colocá-los no oxigênio, eles tem que passar por moléculas estáveis. Ex?
-NADH: 1 NADH produz 3 ATP. *NADP recebe elétron também.
-FADH2: 1 FADH2 produz 2 ATP.
-Elas estabilizam o elétron e o leva pra produção de ATP, servindo como fonte redutora.
*NADH é diferente de NADPH2, pois este possui um fosfato e não serve pra estabilizar elétrons. Nenhuma enzima da via de produção de ATP consegue usar elétron do NADPH2, pois ta permitido a outras vias apenas. 
*Toda enzima usa ATP? Não. E as que usam ATP, tem que ter ATP. As que não usam, não faz diferença ter ou não ATP.
*O NADH é solúvel, mas o FADH2 não é solúvel.
*O FADH2 ta preso na estrutura de uma enzima, sendo um grupo prostético. A enzima já tem o FADH2 preso na estrutura pra estabilizar o elétron que ela arranca de alguém.
Processos que ocorrem consumo de ATP
-Estapas inicias de vias de degradação
-Interconversão de nucleosídios tri-fosfato
-Processos fisiológicos, como: transporte ativo, contração muscular, biossíntese de proteínas, replicação e reparo de DNA;
-Garantir reações endergônicas (endotérmicas)
Processos que ocorrem produção de ATP
- Fosforilação ao nível de substrato (as duas moléculas mais energéticas que ATP); fosforilação oxidativa (respiração), fotofosforilação (plantas), reação da adenilato quinase ( ADP -> ATP + AMP, raro)
-ATP NÃO É ESTOCADO!!!!!!!!!!
-Estoco aminoácidos, açúcares, lipídios. AA faz-se proteínas, açucares faz-se polissacarídos e lipídios simples faz-se complexos. Anabolismo é o estoque de macromoléculas (biossíntese).
Característica das vias metabólicas
-Irreversibilidade: se tiver volta tem que ser por outra enzima. Garante que a enzima que faz ida seja diferente da de volta, sendo as duas irreversíveis e reguladas.
-Existência de uma etapa comprometida: não da pra voltar. É a reação que se passar, não tem desvio, vai ter que seguir a via até o final. 
-Regulação: uma ou duas enzimas principais reguladoras para permitir ou não a metabolização. Ex: Numa via com 15 enzimas, tem-se somente 2 ou 3 no máximo reguladas.
Regulação da atividade enzimática por efetores alostéricos
- Cicla entre a forma relaxada(com ativadores-hiperbólica) e tensa (com inibidores-sigmoid, pode ficar com km cada vez maior)
-O substrato pode levar a enzima pra forma relaxada, sendo melhor.
Controle por modificação covalente (fosforilação)
-As duas principais maneiras de controlar a enzima são: a modificação covalente por fosforilação e a presença de efetores solúveis. 
-Normalmente as enzimas param ou passam a funcionar após a fosforilação. A PFK2 é a exceção, pois possuis dois sítios catalíticos diferentes.
-Quando a PFK2 ta livre de fosfato, ela é uma quinase, fosforilando outros substratos como açúcar. PFK2 quando é fosforilada, ela deixa de fosforilar o açúcar e passa a desfosforilar, fazendo o contrário. É a única enzima que muda de função pq possuis dois sítios diferentes, sendo em momentos opostos.
Transdução de sinal: características gerais
Especificidade: receptores específicos na membrana que se ligam nas moléculas, passando o sinal pra célula.
Amplificação: sinal ligando na enzima 1 (receptor), ativa várias cópias da enzima 2, depois mais da enzima 3 e assim vai. [S] se liga, o receptor é ativado, influenciando uma enzima que esta na membrana e esta passa a produzir uma molécula qualquer. 
Desensibilização: em algum momento o sinal para. A molécula se solta ou o receptor para de responder.	
Integração:várias vias diferentes (ou respostas a hormônios) podem convergir ou competir pra uma mesma resposta/efeito. 
Transdução de sinal: tipos
Canal de íons fechados: abre ou fecha em resposta a concentrações do sinal do ligantes [S] para os íons entrarem. Resposta ao sinal é a abertura de um canal que permite a entrada de íons. Ex: receptor nicotínico de acetilcolina. Acetilcolina na fenda sináptica ela liga no canal e este canal permite a entrada de Ca e Na e quando esse canal é desensibilizado, ele fecha a parte debaixo e esperaa acetilcolina sair pra retornar ao estado inicial.
Enzima receptora: [S] se liga ao receptor e é ativado e promove a atividade enzimática intracelular. Ex: insulina. Dois dímeros e quando a insulina liga ele tetrameriza, e então a parte intracelular fica com atividade enzimática e uma enzima quinase passa a fosforilar seus alvos.
Receptor de serpentina: o [S] se liga ao receptor e é ativado, influenciando uma enzima que esta na membrana e esta passa a produzir uma molécula x qualquer. 
Receptor esteroide (intracelular): fatores transcricionais se ligam a hormônios lipossolúveis, ligando na região rgulatória, ativando ou inibindo a transcrição de genes.
Exemplo de receptor ligado à proteína G: Receptor de epinefrina e 2º mensageiro
-A presença de AMP dentro de uma célula eucariótica, significa que fora da célula tem sinal de glucagon ou adrenalina. Se for sinal de glucagon, o estado glicêmico ta baixo. Esse AMP ativa uma proteína quinase (que fosforila)
*Em jejum, a glicemia (qtd de glicose) cai, mas não zera. O glucagon é importante pra sinalizar pq alguns tecidos não tem autorizaçãode consumir glicose. Em estado alimentado, a glicose vem da dieta. A maquinaria sabe que a glicose é abundante e a insulina da o sinal de autorização pra usar a glicose. Quando a insulina cai e o glucagon aparece, ele desautoriza os tecidos a usar glicose. Então insulina e glucagon responde a quantidade de glicose.
*Então quando entro em jejum e a glicemia deveria cair absurdamente, o glucagon manda alguns tecidos pararem de consumir glicose. Se uma pessoa em jejum tomar uma injeção de insulina, é capaz dela morrer em poucos minutos, pois não tem glicose circundante no sangue. Celula sente glucagon e não glicose.
*PKA regula enzimas de degradação e produção de energia.
*Cada tecido responde de uma maneira a adrenalina. No músculo, quebra o glicogênio (estoque energética) pra entrar na via glicolítica e produzir energia. Então o músculo não quer saber se TAM em estado alimentado ou jejum, se tiver adrenalina ele vai quebrar o glicogênio. 
*Músculo não responde a glucagon
*Susto produz hormônio adrenalina, jejum produz hormônio glucagon. Tem tecidos que respondem os dois ou a apenas um.
 
-Receptor intracelular: receptor inativo e quando liga a uma molécula consegue se liberar do complexo e fica livre pra interagir com a região regulatória, promovendo a transcrição.
-O organismo é muito mais regulado por fosforilação do que por expressão gênica. A única enzima regulada por expressão gênica é a da gliconeogenese. Por transcrição gênica demora mais a acontecer. Por fosforilação acontece em milissegundos. 
-Hormonios esteroides tem efeito primário como fatores transcricionais e esses promovem a regulação das proteínas que vão ser produzidas.
GLICÓLISE
-É a via mais conservada. A via da glicólise é a que ta mais relacionada com todas as funções da célula. Glicose é gerada por degradação de amido, sacarose da dieta ou glicogênio estocado das células. A glicólise permite a produção de pentoses (pra produzir pentoses), piruvato (entrando no ciclo de Krebs – então a glicólise é usada pra gerar energia ATP)
-Glicólise ta ligada diretamente na fermentação pois tem que dar um destino ao piruvato formado (não quero perder os Carbonos do piruvato). A via glicolítica gera uma molécula com elétrons NADH (pois tira elétrons da glicose). Se todo NAD+ virar NADH, a via para. Tem que reoxidar o NADH, gerando o NAD+. Os destinos possíveis dos elétrons são piruvato e quando esse piruvato ganha elétron, vira lactato. Qualquer opção de fermentação é uma tentativa da celula de se livrar dos elétrons e reoxidar o NAD. Ela põe elétrons onde puder. Se a célula tiver a capacidade de respirar esses elétrons podem ir pra cadeia respiratória. 
Utilização de glicose por diferentes tipos de células
-Hemácias: fermentam, liberando lactato. Só faz glicólise. Não tem mitocôndria, por isso não respira.
-Cérebro: respiram. Constante O2 pra que o piruvato seja usado. Não fermenta.
-Músculo: respira e fermenta, mas prefere respirar pois é mais energético. Enquanto tiver O2, prefiro respirar.
-Adiposo: respira, regenerando o NAD, fazendo ciclo de Krebs. Não fermenta. 
-Hepáticas: respira. Quando ela ta fazendo glicólise usando glicose ela ta respirando e a regeneração do NAD é na respiração. Pega o lactato que as outras células produzem, e quando tem o sinal usa esse lactato. Fazem todas as reações possíveis.
Visão geral da via glicólica
-Duas partes. A primeira começa com a glicose e as vias vão ser uma tentativa de fazer uma molécula espelhada pra quebrá-la no meio, tendo duas metades iguais e todas as reações serão duplicatas. A segunda parte é a reorganização das moléculas e os ligantes pra que os fosfatos de baixa energia tornem-se de alta energia. Pegar o fosfato e fazer ATP. *Pro saldo de ATP for positivo, tenho que por fosfatos de baixa energia. 
-1° reação: Fosforilação da glicose com objetivo de evitar que ela saia da célula, pois não passa pelo transportador. Irreversível. Enzima: hexoquinase.
*O fígado tem que ser capaz de lidar com quantidades altíssimas de glicose. Ele tem uma segunda enzima chamada de glicoquinase que não é regulada e tem um Km muito mais alto que a hexoquinase. Se a [glicose] tiver pequena, somente a hexoquinase funciona. Se eu comer um pudim de leite condensado e a glicose sobe demais, a [glicose] sobe tanto que mesmo a hexoquinase funciona em Vmax não da conta, então a glicoquinase começa a funcionar. 
2° reação: Isomerização. Muda o fechamento do anel.
3° reação: *Fosforilação da frutose* (ETAPA COMPROMETIDA). Enzima: PFK1. Essa enzima fosforila a frutose-6fosfato e vira frutose-1,6-bifosfato. Enzima glicose-6-fosfatase faz a reação reversa. Etapa mais lenta. ATP é ao mesmo tempo substrato e efeito alostérico (o ATP pode se ligar em dois lugares na enzima, no sitio regulatório(inibindo) e no substrato. Então uma alta de ATP inibe a PFK1. Algumas células produzem F-6P 
*Regulação por ATP. 
*O começo e o fim da via tem que ficar em sincronia. Se pausar o início, as enzimas do final ficarão ociosas. Se o começo tiver ativado, PFK1 ativa funcionando em velocidade alta e a ultima enzima da via piruvato quinase não for ativada, vai ter um engarrafamento na via e não adiantou nada ter ativado a PFK1. Pra isso, uma molécula produzida na metade da via é um ativador das últimas etapas. Uma molécula produzida nas ultimas as vezes é um inibidor. Isso garante a sincronização. 
*Regulações hormonais são mais superiores por ser via sinalização celular. A proteína quinase A é ativada fosforilando uma enzima, desativando-a. É uma regulação que sobrepõe a carga energética e a sincronização da via.
*O ATP é um inibidor alostérico da PFK1. O ATP é um ativador alostérico da frutose-1,6-bifosfatase
4°reação: quebra da frutose-1,6-bifosfato em duas trioses. Enzima: Aldolase.
5° reação: Interconversão de GAP e DHAP.
6° reação: gasta NAD+ e produz NADH. Importante pelo balanço redox. Esse NADH pode virar ATP se o elétron que tiver nele conseguir chegar na cadeia transportadora de elétrons e ir pra respiração.
7° reação: produção de ATP.
8° e 9° reação: produção de PEP
10° Reação: Irreversível e reguladas. A enzima tira o fosfato do PEP e Poe ADP. Produção do 2° ATP.
*Se eu conseguir pegar os elétrons do NADH e levá-los pra respiração, o saldo finaliza com produção de 8ATP.
-A glicólise é uma via quase que universal, onde uma molécula de glicose é oxidada a 2 moléculas de piruvato sendo a energia liberada conservada em duas moléculas de ATP e duas moléculas de NADH.
-Todas as enzimas da via glicolítica são citoplasmáticas e seus intermediários são moléculas fosforiladas de 3 ou 6 átomos de carbono.
-Na fase preparatória da glicólise 2 moléculas de ATP são consumidas. Na 2 a parte da glicólise a energia liberada pela oxidação do C1 do GAP é conservada permitindo a produção de 2 moléculas de NADH e de 2 ATP para cada triose.
-Que a velocidade da glicólise é regulada de forma coordenada com a de outros caminhos de produção de ATP, de modo a assegurar o suprimento de ATP paras as células em qualquer condição metabólica
-Que as enzimas Fosfofruto quinase e Piruvato quinase têm sua atividade modulada por efetores alostéricos.
-Que a velocidade e o sentido das demais reações são regulados pela lei de ação das massas.
-As enzimas irreversíveis prestam somente pra via glicolítica. As reversíveis servem pra via glicolítica e para a produção de glicose (gliconeogenese).
-Vários caminhos alimentam a glicólise. Os açúcares diferentes não vão sobrar, vão ser consumidos.
A degradação do glicogênio e do amido são fosforólises.
REVISÃO: A via glicolítica acontece em todos os organismos praticamente. Transforma glicose em piruvato com saldo de 2 ATP (usa 2 mas produz 4 ATP), tb produz poder redutor, reduzindo moléculas de NAD produzindo NADH. Esse NADH pode significar mais ATP se os elétrons que tão no NADH forem pra respiração, ié, entrar na mitocôndria. Mas mais importante que produzir ATP usando esses elétrons do NADH é dar um destino qualquer pra esses elétrons, pois senão reoxidar o NADa via para. Cada NAD, gera 3ATP. Se isso não for possível, os elétrons tem que ir pra qualquer lugar, o mais comum quando a respiração não é possível é a fermentação, usando o piruvato (produto da via glicolítica) é reduzido (usa os elétrons) e produz o lactato. Com isso garanto a reoxidação do NAD e a utilização dele pra que a via glicolítica continue a funcionar. A via tem 3 enzimas irreversíveis: a hexoquinase tem uma enzima oposta que faz a reação oposta; comprometida e mais regulada: PFK1. A oposta é a frutose-2,6-bifosfato que faz a reação oposta. O que ativa uma inibe a outra; a piruvato quinase, não há uma única enzima que faz a reação oposta, somente várias enzimas. A via glicolítica na maioria das células acontece no momento alimentado e em outras acontece sempre. Ela pode ou não ser regulada por substrato.
-A via glicolítica pode acontecer em aerobiose e anaerobiose, desde que exista um sistema eficiente de reoxidação do NADH. Havendo condições aeróbicas e mitocôndrias, o NADH pode ser reoxidado e seus elétrons transferidos pra mitocôndria, depois pra cadeira respiratória e pro oxigênio, ié, respiração. Caso não consiga fazer isso, há a fermentação, sendo mais rápida com vantagem, porém com menor rendimento.
-Em ausência de uma destas condições as células irão fermentar, ou seja, transferir os elétrons do NADH para uma molécula orgânica que será reduzida e então excretada •Alguns tipos de células sobreviverão bem fermentando, pois serão capazes de ajustar a velocidade da via glicolítica e produzir ATP suficiente. Outras morrerão se privadas de oxigênio.
Glicólise Aeróbica
*O piruvato em presença de O2 e mitocôndria, ele entra na mitocôndria, sendo usado no ciclo de Krebs pra produção de NADH e depois ATP. O NADH tb pode doar seus elétrons pra dentro da mitocôndria. Nenhum nucleotídeo atravessa a membrana, com exceção de ATP. Se isso não for possível, o piruvato será fermentado, reoxidando o NADH.
Fermentação lática
-Ocorre em músculo, nas hemácias em outras células dos animais e ainda em alguns microrganismos. O lactato ionizado acidifica o tecido e o meio de cultura. Então regenera o NAD, reoxida o NAD pra que a glicólise continue funcionando.
Fermentação alcoólica
-Primeiro o piruvato é descarboxilado a acetaldeído e este é reduzido a etanol, tendo que usar NADH. Fermentação é uma maneira de reoxidar o NADH senão a via glicolítica para.
A regulação da via glicolítica
-É regulada nas reações irreversíveis que são 3: a primeira, a etapa comprometida e a última. A primeira é regulada pela quantidade de produto, se tem bastante produto a atividade da enzima cai, se tem pouco produto a enzima volta a funcionar bem, então a glicose-6-fosfato regula a atividade da enzima hexoquinase.
-A segunda, PFK1 é regulada pela carga energética, ATP. A via será inibida caso a carga energética estiver alta, a via será ativada caso a carga energética estiver baixa. A regulação da via consegue se antecipar a ausência de ATP, por isso é regulada assim. É uma regulação alostérica! Tem-se um regulador majoritário da PFK1, Frutose 2,6 bisfosfato (açúcar regulador) ativa a via glicolítica. Ele é produzido por uma enzima que é regulada pela fosforilação de uma enzima, ou seja, é hormonal. Condições crescentes do açúcar regulador aumenta a velocidade da via. 1uM de F2,6BF ativa tanto a enzima que nada a inibe. Em concentrações pequenas desse açúcar a enzima PFK1 pode estar 100% ativada. Se sobrepõe a regulação por ATP. Esse regulador é produzido pela PFK2, que no fígado é regulado por fosforilação e desfosforilação. Em jejum, a insulina cai e o glucagon subiu, e quando há presença de glucagon ou adrenalina, a enzima PFK2 é fosforilada e degrada o açúcar regulador (F2,6BF), parando a via glicolítica. Quando volta o momento alimentado, todas as fosforilações feitas no jejum são desfeitas e volta-se a produzir F2,6BF que ativa a PFK1 e a via glicolítica volta a funcionar intensamente. Como é uma regulação hormonal, sobrepõe-se as outras regulações. Quando chega em frutose-6-fosfato, a PFK2 utiliza essa pra fazer o regulador (frutose-2,6-bifosfato) caso não tenha sinal de glucagon ou adrenalina, promovendo o regulador ativando a PFK1, resultando numa glicólise intensa. Então a F2,6BF ativa a PFK1 aumentando sua afinidade pelo substrado F6F. F6F é um ativador alostérico que desloca o equilíbrio na conformação ativa da enzima. Então, no fígado, F2,6BF presente significa momento alimentado e PFK1 ativa. F2,6BF ausente significa momento de jejum e PFK1 inibida. 
*A enzima PKA é a que faz a regulação de todo metabolismo energético.
-No fígado, a glicose é fosforilada pela glicoquinase; A glicoquinase não é inibida por G-6P e tem Km alto.
-No estado alimentado, a via glicolítica acontece em todos os tecidos. No estado de jejum, não acontece no fígado nem no músculo, acontece nos tecidos nobres: hemácias (tb fermentam sempre – senão fizer a via glicolítica, não tem ATP), sistema nervoso e cérebro. Por isso a glicemia não pode zerar, pois os tecidos nobres não podem parar. Consumir glicose e fazer glicólise é diferente. Pois em jejum esta consumindo glicose pela degradação do glicogênio.
-O transportador de glicose no músculo só é colocado na membrana se tiver o sinal de insulina. Se a insulina sumir e aparecer o glucagon a célula arranca o transportador da membrana e guarda dentro da célula. Então, em jejum o músculo não tem transportador pra glicose então não tem nem como captar glicose da circulação. Então em jejum pode-se fazer a via glicolítica pela degradação do glicogênio no músculo quando tiver atividade física.
Feedback negativo: gastar mais ATP do que produzir ou quando uma etapa x+n sinaliza a uma etapa x que a via não está mais favorecida, por alta energética ou regulação de substrato. Final sinalizando o início.
SÍNTESE E DEGRADAÇÃO DO GLICOGÊNIO
-É um polímero ramificado que é produzido e estocado em diversas células. O músculo e o fígado se destacam no estoque de glicogênio. É um polímero com unidades de glicose e solúvel em água. Gasta ATP pra fazer a ligação glicosítica. É estocado no citosol. Ele vai ser sintetizado no momento alimentado e degradado em jejum. O músculo degrada o glicogênio somente em atividade física. O fígado degrada o glicogênio em jejum. A glicose é tão abundante no estado alimentado pra célula gerar energia e estocar glicogênio.*A degradação não gasta ATP.
-É um polímero ramificado. Uma rota enzimática tem que fazer ligação linear e outra de ramificações. A degradação do glicogênio ou do amido não é feita por hidrólise (H entra num lado e OH no outro) e sim por fosforólise (fosfato numa ponta e OH na outra). Vantagem de ser fosforólise: não preciso ter a 1° reação da via glicolítica, a molécula gerada pela degradação é uma glicose com um fosfato, assim economiza-se ATP e uma reação a menos que precisa fazer na via glicolítica. Forma-se glicose-1-fosfato.
-A enzima que degrada o glicogênio nas ligação lineares (alfa-1,4) é a glicogênio-fosforilase. Ela engasga quando chega uma ramificação, se soltando e indo pra outra ponta. 
-A enzima desramificadora tem 3 atividades: quebra uma ligação alfa-1,4 e faz uma ligação alfa-1,4, tendo uma atividade de transferase. Transfere unidades na ramificação pra cadeia principal. Quebra também uma ligação alfa-1,6 pra desfazer completamente a ramificação. Então pra enzima desramificadora fazer seu papel precisa-se da ramificação do glicogênio, tendo 4 unidades de glicose em extensão. A atividade de transferase exige que as duas cadeias estejam próximas, pra que seja reposta. Duas cadeias, uma ramificação da outra e curtas. Não adianta desramificar e a cadeia estar longa pois a enzima desramificadora não vai conseguir alcançar a ponta. Se não tiver a enzima desramificadora, só iria dar pra clivar o primeiro nível. Não daria pra acessar todas as outras ramificações abaixo.
- A glicose que é liberada pela enzima ramificadora é a hidrólise, não sai glicose com fosfato. Mas isso é uma parcela bem pequena. A grande maioria das glicoses