2RELATÓRIO DE TRABALHOS PRÁTICOS DE BIOQUÌMICA CELULAR

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RELATÓRIO DE TRABALHOS PRÁTICOS DE BIOQUÌMICA CELULAR
Integrantes: Carolina Souza, João Vitor, Marcela Rêda, Marcone Pereira, Monique Marianne. 
Título: Atividade Enzimática da Enzima Catalase.
Introdução: 
No presente experimento testamos a atividade enzimática da catalase, presente no fígado através de mudanças na concentração do substrato, ph e temperatura. Desta forma visamos entender como esses fatores alteram a atividade das enzimas, assim como, identificar os produtos da reação de 2H2O2 – catalase 2H2O + O2. 
As enzimas são catalizadores biológicos específicos que determinam transformações químicas e transformam um tipo de energia em outro. Essas moléculas atuam aumentando a velocidade de reações especificas, fazendo papel de catalisador orgânico. O catalisador aumenta a velocidade das reações, sem ser alterado, podendo ser utilizado novamente. A catálise ocorre no centro ativo ou ponto ativo da enzima, que são em sua maioria proteínas. Os reagentes utilizados pelas enzimas são denominados de substratos, e a especificidade da enzima é devido a interação precisa entre essa molécula e seu substrato. 
A energia contida nos reagentes é transformada, através da ação enzimática em uma forma diferente. É o que observamos no caso da reação 2H2O2 – catalase 2H2O + O2. A espuma produzida deve-se ao produto da reação, O2, que não estava presente antes da catálise ocorrer, verificamos também, na reação exotérmica deste mesmo experimento a liberação de calor, outra transformação de energia no processo. 
A enzima utilizada foi a hidroperoxidase, normalmente denominada de catalase, que é encontrada na maioria dos organismos que realizam a decomposição do peroxido de hidrogênio, H202. A catalase é da classe das enzimas oxidorredutases, utilizando o peroxido como aceptor ou doador de elétrons. 
A catalase presente no fígado, como o que utilizamos, é produzida no reticulo endoplasmático rugoso e fica armazenada nos peroxissomos e também nas mitocôndrias. O H2O2 é subproduto de várias reações químicas e deve ser quebrado pela ação desta enzima devido ao seu potencial toxico. 
Objetivos: 
Compreender o significado biológico das enzimas e da catálise enzimática: 
Conhecer a atuação e a importância das enzimas; 
Conhecer o efeito da temperatura e pH na atividade das enzimas; 
Relacionar o efeito da concentração do substrato com ação das enzimas; 
Materiais e Métodos: 
Pegou-se um pedaço de fígado e macerou-se com água destilada.
Filtrou-se em gaze 20 ml do macerado.
O filtrado foi utilizado nos experimentos.
Experimento 1:
Marcou-se um tubo de ensaio com o número 1.
Nele foi-se posto 2 ml do filtrado é um 1 ml de H2O2 PA.
Experimento 2:
Marcou-se um tubo de ensaio com o número 2.
No tubo foi colocado 2 ml do filtrado. 
Aqueceu-se no bico de Bunsen o conjunto, durante o aquecimento o tubo ela mexido procurando a homogeneidade. 
Depois do aquecimento o conjunto foi colocado para esfriar.
Depois de esfriado foi-se acrescentado 1 ml de H2O2 PA.
Experimento 3: 
Marcou-se três tubos de ensaio com as palavras: gelo, 70º e ambiente e o nome do grupo.
Acrescentou-se em cada tubo 2 ml do filtrado.
O tubo escrito gelo foi colado no gelo.
O tubo marcado com 70º foi colocado em aquecimento em 70º.
O terceiro tubo, marcado como ambiente foi colocado em descanso em um suporte para tubos de ensaio.
Depois de aproximadamente 1 hora foi acrescido em cada tubo 1 ml de H2O2 PA.
Eexperimento 4: Atividade enzimática (catalase) X Concentração do substrato
Foi marcado 6 tubos de ensaio com as seguintes diluições 1/4,1/8,1/16,1/32,1/64 e 1/128. 
No tubo de ¼ foi adicionado 3 ml de água destilada, com o auxílio da pipeta.
Os tubos marcados de 1/8,1/16,1/32,1/64 e 1/128 foi adicionado 2 ml de água destilada.
O tubo de ¼ foi acrescentado 1ml de solução concentrada de H2O2 e fez a diluição deste com os demais até chegar no último tubo de 1/128. Sempre retirando da primeira diluição 2 ml para a realização da seguinte.
Após as diluições foi acrescentado 0,5 de extrato de fígado e mediu-se a altura, com uma régua, que a espuma alcançou em cada tubo.
Experimento 5: Atividade enzimática (catalase) X pH
Foram utilizados 3 tubos de ensaio que foram marcados, com caneta, os conteúdos que continham:
No 1º tubo foi adicionado base (1 ml de NaOH)
No 2º tubo foi adicionado água (1 ml H2O)
No 3º tubo foi adicionado ácido (1 ml de ácido acético)
Logo após esse procedimento foi adicionado, por meio da pipeta, e misturado em cada um 1 ml de H2O2.
Usando um papel indicador de pH foi medido o pH de cada tubo.
Após medido o pH foi adicionado com a pipeta 2 gotas do extrato de fígado.
Experimento 5: 
Primeira pergunta:
Levando-se em consideração a quantidade de espuma formada, dentre os pH testados o mais ideal para a enzima catalase é mais próximo do neutro. Logo, o 2° tubo de ensaio é o mais adequado, pois é o que mais aproxima-se de um pH neutro 
Segunda pergunta: 
Os fatores que afetam a atividade enzimática são a temperatura, o pH do meio e a concentração do substrato. 
Resultados: 
Experimento 1: 
Ao acrescentar 1ml de H2O2 aos 2ml de filtrado a solução imediatamente produziu espuma que ultrapassou o tubo de ensaio, chegando a aproximadamente 17cm de espuma. O tubo de ensaio esquentou consideravelmente, sinal de que a reação é exotérmica e as enzimas presentes no fígado reagiram com H2O2, tendo como produto O2, que formou a espuma. 
Experimento 2:
Após ferver o filtrado e deixa-lo resfriar, adicionamos 1ml de H2. A mistura não produziu espuma e não aqueceu, evidenciando que as enzimas do fígado foram desnaturadas com o aumento da temperatura oriundo do aquecimento até a fervura. 
Experimento 3: 
Em temperatura ambiente o filtrado, quando em reação com 1ml de H2O2 produziu espuma que ultrapassou o tubo de ensaio e o fez esquentar. 
No gelo, à aproximadamente 0ºC, a espuma passou ainda mais do limite do tubo de ensaio e a mistura produziu mais calor do que na temperatura ambiente. 
No tubo aquecido até 70ºC não houve reação. 
Experimento 4:
Catalase trata-se de uma enzima (proteína produzidas por seres vivos e capazes de catalisar reações químicas relacionadas com a vida, sem, no entanto, sofrerem alterações em sua composição química), ela é hemeproteína citoplasmática (intracelular) a qual também pode ser chamada de hidroxipedase, é produzida no retículo endoplasmático rugoso e fica armazenada nos peroxissomos (bolsas membranosas que contêm alguns tipos de enzimas digestivas que degradam gorduras e aminoácidos, além da grande quantidade de catalase). Ela é encontrada no sangue, medula óssea, mucosas, rim e fígado, e sua atividade é dependente da coenzima Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato, o NADPH. 
Tal hemeproteína é responsável pela decomposição do Peróxido de Hidrogênio (H2O2) comumente chamado de “Água Oxigenada”. Pois as células do corpo humano produzem substâncias em meio às suas reações metabólicas. Normalmente durante a degradação de gorduras e de aminoácidos, uma substância formada, é o Peróxido de Hidrogênio. Este é tóxico ao organismo, já que em grande quantidade pode causar lesões às células, uma vez que sua ação se deve ao ataque da membrana lipídica, DNA e outros componentes das células, pelos radicais livres tóxicos que o mesmo produz. 
 O Peróxido de Hidrogénio atua ainda em diversos mecanismos de degradação de aminoácidos (em associação com amino-oxidases), por conta de seu poder oxidante elevado. Desse modo, a decomposição do mesmo em H2O (água) e O2 (Oxígênio) promovida pela Enzima Hidropedase (Catalase) é de extrema importância para a desintoxicação do organismo, pois uma vez tóxico para as células, o peróxido tem de ser rapidamente convertido numa espécie química que seja inócua. A catalase tem o mais alto número de turnover (kcat) conhecido em enzimas: uma molécula de catalase pode catalisar a decomposição de até 40 000 000 moléculas de peróxido de hidrogênio por segundo, tornando-a numa enzima importante paraa desintoxicação desta substância. Algumas células do sistema imunitário produzem peróxido de hidrogênio para uso como agente antibacteriano. As bactérias patogênicas que possuem catalase são capazes de resistir a este ataque graças à presença da enzima, conseguindo sobreviver nas células que invadem.
Por essas perpectivas, torna-se evidente, portanto, que a ação da catalase é indispensável para o corpo humano, pois a mesma é uma gente de desoxidação e desintoxicação do metabolismo. A catalase está presente na maioria dos organismos e no nosso corpo o fígado é um dos órgãos que está em maior concentração. No fígado acontece o metabolismo de diversas substâncias tóxicas, inclusive do peróxido de hidrogênio.
Experimento 5:
Tubo I: 1ml NaOH (10%) / pH 12
Tubo II: 1ml água / pH 4 – 5
Tubo III: 1 ml ácido acético (10%) / pH 2 – 3 
Tubo I + 2 gotas de filtrado: produziu espuma branca, densa, de aproximadamente 8cm, sem alteração da temperatura. Abaixo da espuma observamos bolhas sendo formadas no liquido transparente. 
Tubo II + 2 gotas de filtrado: imediatamente muita espuma foi produzida e a temperatura do tubo de ensaio aumentou bastante. A espuma produzida ultrapassou 14cm. Liquido transparente com produção de bolhas. 
Tubo III + 2 gotas do filtrado: houve formação de poucas bolhas e quase nenhuma espuma, demonstrando que no meio ácido a enzima foi desnaturada. 
Discussão e Conclusão: 
Considerando a quantidade de gás produzido como medida indireta da atividade da catalase concluímos que o PH mais adequado para a ação da referida enzima é o pH neutro, encontrado na água, porém ressaltamos que a água utilizada tinha um caráter levemente ácido, sendo que a conclusão do pH ótimo desta enzima teve que ser deduzido hipoteticamente. 
Diante dos resultados obtidos percebemos que a temperatura, pH e concentração do substrato são fatores que alteram a ação enzimática. Até certo ponto, o aumento da temperatura corresponde a um aumento na velocidade de reação da enzima, porém, como observado nos experimentos 2 e 3 depois de um certo ponto a temperatura pode desnaturar a enzima, diminuindo até cessar sua ação. 
O pH ótimo da enzima é por volta de 7, um meio neutro, sendo a mesma desnaturada em meios muito ácidos ou muito básicos. 
A concentração do substrato também alterou a atividade enzimática. Como observado no gráfico do experimento 4, quanto maior a concentração do substrato, que variou de 0,25 a 0,015625 , maior foi a altura da coluna de O2, ou seja, quanto mais concentrado maior a velocidade da reação, entretanto, sabemos que depois de determinada concentração a velocidade não se alterará pois a enzima chegará ao seu ponto de saturação.
Referências Bibliográficas: 
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