O método ELISPOT foi desenvolvido pelo grupo Cecil Czerkinsky em Gotemburgo

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O método ELISPOT foi desenvolvido pelo grupo Cecil Czerkinsky em Gotemburgo, Suécia, em 1983 [1], com o objetivo de detectar células secretoras de anticorpos (ASC) específicas de antígeno em um ensaio ELISPOT de células B, que foi uma modificação de um ELISA em sanduíche tradicional imunoensaio . O teste ELISPOT já foi amplamente adotado para a identificação e enumeração de células produtoras de citoquinas no nível de célula única, mas ainda é usado para detecção de ASC.
Simplificando, em condições apropriadas, o ensaio ELISPOT permite a visualização do (s) produto (s) secretor (es) de células individuais ativadas ou respondentes. Cada ponto que se desenvolve no ensaio representa uma única célula reativa. Assim, o ensaio ELISPOT fornece informações tanto qualitativas (quanto à citocina específica ou outras moléculas imunes segregadas) e quantitativas (a frequência das células respondentes dentro da população de teste).
Devido à sensibilidade requintada dos ensaios ELISPOT, as análises das freqüências de células raras específicas de antígenos dentro de uma população de teste, que foi impossível realizar antes do seu desenvolvimento, tornaram-se relativamente simples. Essa sensibilidade excepcional deriva da mecânica do próprio método de ensaio.
Num ensaio ELISPOT, as superfícies da membrana em uma placa de microtitulação de membrana de PVDF de 96 poços são revestidas com anticorpo de captura que se liga a um epítopoespecífico da citoquina que está sendo ensaiado. Durante o passo de incubação e estimulação celular, as PBMCs são semeadas nos poços da placa juntamente com o antígeno e formam uma monocamada na superfície da membrana do poço. À medida que as células específicas do antígeno são ativadas, elas liberam a citoquina, que é capturada diretamente na superfície da membrana pelo anticorpo imobilizado. A citoquina é assim "capturada" na área que circunda diretamente a célula secreta, antes de ter uma chance de se difundir para o meio de cultura , ou ser degradada por proteases e ligada por receptores em células espectadores. Etapas de detecção subsequentes visualizam a citocina imobilizada como um ImmunoSpot; essencialmente a pegada secretiva da célula ativada (veja abaixo).
Este mecanismo de captura da citoquina secretiva torna o método ELISPOT muito mais sensível do que os ensaios que medem citoquinas liberadas em sobrenadantes de cultura, pelas razões acima mencionadas. Os Arrays de Cytokine Bead Arrays (CBA) e os ensaios ELISA convencionais podem fornecer informações extremamente úteis em certos contextos, mas carecem da sensibilidade e precisão de ELISPOT para a detecção e enumeração de células específicas de antígenos raros.
Os limites práticos de detecção de ELISPOT dependem geralmente do número de células semeadas em um poço de ensaio. Normalmente, 200.000 - 400.000 PBMCs serão usadas por poço para um ensaio, mas até um milhão de células são comumente usadas para a detecção de eventos raros. ELISPOT é capaz de detectar uma única célula positiva de antígeno dentro dessa população, dando-lhe um baixo limite teórico de detecção de um em um milhão de células.
Procedimento 
Conforme observado acima, os ensaios ELISPOT empregam uma técnica muito semelhante à técnica de ensaio imunoenzimático ( ELISA ). Ou um anticorpo monoclonal (preferido para maior especificidade) ou de captura policlonal é revestido assepticamente sobre uma microplaca com suporte de PVDF. Estes anticorpos são escolhidos por sua especificidade para o analito em questão. A placa é bloqueada, geralmente com uma proteína sérica que não é reativa com nenhum dos anticorpos no ensaio. Depois disso, células de interesse são plaqueadas em diferentes densidades, juntamente com antigénio ou mitogênio , e depois colocadas em uma incubadora de CO 2 humidificada a 37 ° C por um período de tempo especificado. Alguns antígenos, como proteínas, podem exigir que sejam previamente carregados processados ​​pelas células apresentadoras de antígeno. [2]
As citocinas (ou outros produtos celulares de interesse) segregadas por células activadas são capturadas localmente pelo anticorpo revestido na membrana de PVDF da área superficial elevada. Depois de lavar os poços para remover células, detritos e componentes de mídia, um anticorpo biotinilado específico para o analito escolhido é adicionado aos poços. Este anticorpo é reativo com um epítopo distinto da citoquina alvo e, portanto, é empregado para detectar a citoquina capturada.Após uma lavagem para remover qualquer anticorpo biotinilado não ligado, a citoquina detectada é então visualizada usando estreptavidina conjugada a uma enzima - peroxidase de rábano (HRP) ou fosfatase alcalina (AP) - e um substrato precipitante (por exemplo, AEC, BCIP / NBT ). O produto final colorido (um ponto, geralmente vermelho (para HRP) ou um azul negruzco (para AP), tipicamente representa uma célula que produz citoquinas. As manchas podem ser contadas manualmente (por exemplo, com um microscópio de dissecação ) ou usando um leitor automatizado para capturar as imagens dos micropoços e analisar o número e o tamanho do ponto.