PCR - Sequenciamento DNA Polimerase

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Técnicas de análise de DNA 
 
PCR 
 
O que é a PCR? 
 
A PCR (Reacção de Polimerização em Cadeia) é uma metodologia que se baseia 
na amplificação exponencial selectiva de uma quantidade reduzida de DNA de uma 
única célula. Esta técnica revolucionou o mundo científico e as suas aplicações são 
imensas: é usada no diagnóstico médico, mapeamento genético, detecção de doenças 
hereditárias, clonagem de genes, testes de paternidade, identificação de “impressões 
digitais” genéticas… De facto, a PCR revolucionou várias áreas como a Biologia 
Molecular, Patologia, Farmácia, Botânica, Medicina Forense e valeu o prémio Nobel, 
em 1993, a Kary Mullis. 
 
Objetivo 
 
O objectivo da PCR é produzir uma quantidade apreciável de um segmento específico 
de DNA a partir de uma quantidade mínima. O DNA molde sofre uma amplificação 
controlada por enzimas, obtendo-se 
milhões de cópias do fragmento de DNA 
de interesse. O molde pode ser qualquer 
forma de DNA de cadeia dupla, como o 
DNA genómico: pode usar-se uma gota de 
sangue, um fio de cabelo, uma célula do 
epitélio oral, um blastómero… 
 
Em que consiste um ciclo de PCR? 
 
Um ciclo de PCR (Fig.1) consiste 
em três fases: desnaturação do DNA molde 
(a 95ºC), ligação (“annealing”) dos primers 
(a 64ºC) e polimerização do DNA (a 72ºC). 
Na 1ª etapa faz-se a separação das cadeias 
de dupla hélice de DNA através do calor. 
Esta separação é essencial para que, na 2ª 
fase, dois primers de oligonucleótidos se 
liguem às sequências dos pares de bases 
complementares da cadeia molde. Estes primers são desenhados e sintetizados de modo 
a ligarem-se às extremidades opostas de cada uma das cadeias de DNA molde que se 
pretende amplificar. Os primers servem, portanto, de ponto de partida para a replicação 
de DNA e, na última etapa, faz-se a sua extensão. A enzima responsável por esta 
polimerização é a DNA polimerase termo-estável (Taq), tendo sido isolada a partir da 
bactéria termofílica Thermus aquaticus que vive em elevadas temperaturas. É essencial 
que a enzima usada seja estável ao calor, uma vez que os ciclos de PCR têm lugar a 
temperaturas situadas entre os 64ºC e 95ºC. Para executar este ciclo usa-se um 
termociclador, que faz variar de forma rigorosa o tempo e a temperatura ao longo do 
ciclo. Normalmente são repetidos cerca de 30 ciclos, o que demora apenas algumas 
horas. 
Assim, duas novas cadeias são sintetizadas a partir da cadeia molde em cada ciclo 
completo de PCR logo dá-se um crescimento exponencial, havendo ao fim de n ciclos 
2n vezes mais cópias do que no início. 
 
Vantagens e limitações 
O segredo do sucesso da PCR reside na capacidade que ela tem de amplificar uma 
sequência precisa de DNA aliada à sua simplicidade, rigor, elevada sensibilidade e 
especificidade. Não é necessário isolar o DNA que se pretende amplificar (mesmo que 
se encontre misturado com DNA de outras espécies), uma vez que a especificidade da 
PCR é dada pelos primers. É uma técnica rápida, barata e segura. 
Contudo, a PCR também tem limitações, como a necessidade de conhecer a sequência 
de DNA a amplificar para que possam ser sintetizados primers específicos. Outras 
desvantagens são a relativa facilidade com que ocorre contaminação da amostra por 
DNA estranho (uma vez que se trata de uma técnica muito sensível) e a limitada 
extensão da sequência que é possível amplificar (é difícil aplicar a PCR a sequências 
maiores do que 5kb). Pode também ocorrer incorporação errónea de bases durante a 
replicação. 
 
Aplicações 
Os resultados da PCR são úteis no diagnóstico, prognóstico, determinação da 
terapia a ser utilizada, e até mesmo na avaliação da susceptibilidade a doenças. A PCR é 
frequentemente utilizada na detecção de polimorfismos, mutações pontuais e infecção 
por microorganismos bacterianos ou virais antes da exteriorização patológica da sua 
presença. É particularmente importante na detecção do SIDA, pois consegue detectar o 
vírus HIV nas primeiras semanas após a infecção e mais rapidamente do que o método 
normalmente utilizado, o teste ELISA. A PCR procura directamente pelo DNA do vírus 
enquanto que o teste ELISA é mais indirecto, pois procura anticorpos que o organismo 
possa ter produzido contra o vírus. 
Outro exemplo de aplicação da PCR é no DPI (diagnóstico pré-implantatório) e 
no DPN (diagnóstico pré-natal). A PCR pode ser usada em DPN em idades gestacionais 
tão precoces como as 9 semanas, permitindo, por exemplo, a detecção de células de um 
feto masculino em circulação no sangue materno, ainda que exista em quantidades 
muito reduzidas, e averiguar a compatibilidade entre o grupo sanguíneo da mãe e do 
feto. Permite ainda a detecção de várias anormalidades cromossómicas como a trissomia 
21. Este exame ao diagnosticar previamente certas doenças, possibilita que os pais e 
equipa de saúde decidam antecipadamente a melhor atitude a tomar em relação a cada 
caso. 
 
DGGE 
O que é a DGGE? 
A electroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE) é um método de separação 
electroforético baseado em diferenças no comportamento de desnaturação de 
fragmentos de DNA de cadeia dupla. 
 
Importância da DGGE 
A DGGE é uma poderosa técnica de análise genética que pode ser usada para detectar 
directamente modificações de uma única base e polimorfismos em DNA genómico, 
DNA clonal e DNA amplificado por PCR. 
Como se processa? 
As moléculas do DNA 
desnaturam em segmentos 
específicos designados 
domínios de desnaturação, 
quando a temperatura ou a 
concentração do 
desnaturante se elevam 
(Fig. 2). A temperatura de 
fusão de uma cadeia dupla 
de DNA é influenciada 
simultaneamente pelas 
pontes de hidrogénio que se estabelecem entre pares de bases complementares e pela 
atracção entre bases adjacentes da mesma cadeia. Inicialmente, envolve a mistura de 
uma sonda de DNA de cadeia simples marcada radioactivamente com a cadeia dupla de 
DNA a ser examinado, sendo a última previamente aquecida de modo a tornar-se de 
cadeia simples. O DNA que é idêntico com a sonda de DNA formará um homoduplex, o 
qual, sob as condições desnaturantes do gel, permanecerá hibridizado. Utilizando um 
gel de poliacrilamida, que contém um gradiente linear de desnaturante (ureia ou 
formamida) é possível distinguir os homoduplex mutantes dos normais devido às 
diferentes propriedades de fusão das moléculas de DNA. Assim, qualquer má 
combinação do DNA em estudo com a sonda de DNA resultará no aparecimento de um 
heteroduplex, o qual, à medida que atravessa o gradiente desnaturante do gel, se 
desagregará, tornando-se de cadeia simples num dado ponto. Daqui resulta uma 
estrutura ramificada que apresenta menor mobilidade quando comparada com a do 
homoduplex, o que pode ser detectado por coloração ou por autorradiografia. A 
separação completa da cadeia é impedida pela presença de um domínio de fusão 
elevado, que geralmente é criado artificialmente numa extremidade da molécula pela 
incorporação de uma braçadeira-GC, que nunca desnatura nas circunstâncias escolhidas 
para a experiência. Isto é realizado durante a amplificação de PCR usando um primer de 
PCR com uma extremidade 5' que consiste numa sequência de GC-40. 
 
Vantagens 
1) Taxa e sensibilidade de detecção elevadas. 2) A metodologia é simples e usa-se um 
método de detecção não radioactivo. 3) Os fragmentos de PCR podem ser isolados a 
partir do gel e ser usados em reacções de sequenciação. 
 
Limitações 
1) Ao elaborar a DGGE desde o zero exige-se a análise por computador bem como 
experiências prévias. 2) É requerida a compra de equipamento específico. 3) Os primers 
são mais caros devido ao GC-40. Primers adicionaispodem ser úteis na sequenciação. 
4) A análise de fragmentos PCR com mais de 400pb é menos bem sucedida. 5) Os 
Fig. 2 – A ligação de DNA em domínios discretos. 
genes excepcionalmente ricos em GC não são analisados fàcilmente por DGGE. 6) O 
método envolve o uso do formamida. 
 
Aplicações 
Algumas das mais valiosas utilidades da DGGE na genética humana são a 
detecção directa de mutações numa única base causadoras de doença, a detecção de 
polimorfismos com sondas de DNA e a descoberta dos pontos de desnaturação de 
fragmentos de DNA. 
São conhecidos casos em que a DGGE, associada a outras técnicas como a PCR, 
foi o tipo de análise mutacional directa utilizado na avaliação de fetos em risco de 
apresentarem deficiência na enzima reductase da dihidropteridina (DHPR). Esta é uma 
doença hereditária autossómica recessiva causada por mutações no gene QDRP e resulta 
em hiperfenilalaninémia e deficiência em diversos neurotransmissores no SNC, sendo 
imprescindível o diagnóstico pré-natal nas famílias afectadas. 
A DGGE é também um dos métodos de pesquisa genética de mutações 
responsáveis pela síndrome de neoplasia endócrina múltipla tipo1 (MEN1), uma doença 
autossómica dominante, caracterizada por tumores endócrinos da glândula pituitária 
anterior, glândulas para-tiroides e pâncreas. Esta doença é provocada por mutações do 
gene MEN1, um gene supressor tumoral. 
Uma mutação de células germinativas já conhecida no gene da proteína precursora 
amilóide bem como mutações novas no gene PS-1 foram detectadas por DGGE em 
pacientes com doença de Alzheimer. 
 
 
Marcadores Baseados em Reação da Polimerase em Cadeia - PCR 
 
 A tecnologia da PCR foi concebida em meados da década de 80 (Mullis & 
Faloona, 1987; Saiki et al., 1985). Desde então esta tecnologia causou uma revolução na 
biologia, na pesquisa visando o entendimento de processos biológicos fundamentais 
como nas áreas de melhoramento genético de plantas e animais domésticos, uma vez 
que esta técnica possibilitou a geração de grandes quantidades de DNA de segmentos 
específicos, podendo ser facilmente detectado a olho nu em gel de eletroforese através 
de corantes específicos. 
 PCR é uma técnica poderosa, que envolve a síntese enzimática in vitro de 
milhões de cópias de um segmento específico de DNA na presença da enzima DNA 
polimerase. Sua reação baseia-se no anelamento e extensão enzimática de um par de 
oligonucleotídeos (pequenas moléculas de DNA de fita simples) utilizados como 
indicadores (“primers”) que delimitam a sequência de DNA de fita dupla alvo da 
amplificação. 
 A PCR ocorre em vários ciclos, onde, em cada um deles, a cadeia específica 
teoricamente dobra de tamanho. Atenção: a frase "reação de PCR" é redundante, 
significa reação de reação em cadeia da polimerase! Abaixo está representado um ciclo 
de uma PCR, onde a polimerase do DNA é uma esfera verde, a cadeia "antiga" é azul, 
um primer é azul claro e o outro é verde, os nucleotídeos são vermelhos, assim como a 
cadeia sintetizada no presente ciclo: 
 
 
Figura 6. Ciclo de uma PCR 
 
 Um ciclo de PCR envolve três etapas: desnaturação, anelamento e extensão. A 
fita dupla do DNA alvo é desnaturada através da elevação da temperatura 
para 92°C a 95°C. Na etapa de anelamento, a temperatura é rapidamente reduzida 
para 35°C a 60°C, dependendo do tamanho e sequência do primer utilizado, permitindo 
a hibridização DNA-DNA de cada primer com as sequências complementares que 
flanqueiam a região alvo. Em seguida, a temperatura é elevada para 72°C para que a 
enzima DNA polimerase realize a extensão a partir de cada terminal 3’ dos primers. 
Esta extensão envolve a adição de nucleotídeos utilizando como molde a sequência-
alvo, de maneira que uma cópia desta sequência é feita no processo. Este ciclo é 
repetido por algumas dezenas de vezes. Uma vez que a quantidade de DNA da 
sequência alvo dobra a cada ciclo, a amplificação segue uma progressão geométrica de 
maneira que, depois de apenas 20 ciclos, é produzido mais de um milhão de vezes a 
quantidade inicial de sequência alvo. Esta escala de amplificação permite iniciar com 
quantidades mínimas de DNA (da ordem de picogramas ou nanogramas) e terminar a 
reação com grandes quantidades de DNA de uma sequência específica de interesse. 
 
 Porém, a construção de primers para amplificação via PCR depende do 
conhecimento prévio das sequências de nucleotídeos que flanqueiam a sequência de 
DNA de interesse. Para conhecer estas sequências é necessária a clonagem e 
sequenciamento da região. Em vista disso, com exceção de alguns genes de sequência 
conhecida, a PCR apresentou de início, um uso limitado como técnica para a obtenção 
de marcadores moleculares. 
 
 
 
 
PCR 
 
A técnica da PCR permite que um fragmento específico da molécula de DNA seja 
amplificado milhares de vezes em apenas algumas horas. Esta técnica revolucionou as 
pesquisas em biologia molecular, pois até então demorava-se muito tempo para a 
amplificação do DNA. A partir da PCR é possível obter-se cópias de uma parte do 
material genético em quantidade suficiente que permita detectar e analisar a sequência 
que é alvo do estudo. A reação pode ser comporada a uma procura por uma única 
pessoa em uma grande cidade e cloná-la ao ponto de poder povoar toda a cidade. 
A reação explora função natural da enzima chamada de taq- polimerases, extraída 
da bactéria Thermus aquaticus, que é uma enzima termoestável, fato de imensa 
importância uma vez que a reação se processa em ciclos de diferentes temperaturas, 
como será dito mais adiante. 
Este processo de amplificação do DNA foi inventado por Kary Mullis em 1983 e 
a primeira amplificação feita foi a da betaglobulina humana. Desde então, houve um 
aumento exponencial no número de publicações científicas que relatavam utilizar a 
técnica da PCR em experimentos, passando de 3 publicações em 1986 para 1700 em 
1990. Esta descoberta condecorou Kary Mullis com o prêmio Nobel de Química dez 
anos após sua invenção. O fato central que faz a PCR tão útil é que todo organismo vivo 
possui sequências de nucleotídeos no DNA que são únicas e específicas para cada 
espécie. 
Esta reação permite a amplificação de qualquer seqüência de DNA coletada de 
amostras de materiais biológicos como sangue, urina, outros fluidos corporais, cabelo e 
fragmentos teciduais. Amostras de microorganismos, células vegetais ou animais 
mesmo que com milhares de anos, também podem ser detectadas pela PCR. 
Para a execução da técnica da PCR é preciso que se tenha conhecimento prévio da 
seqüência do ácido nucléico que se deseja amplificar, dita "seqüência alvo." A partir 
disto, desenham-se dois iniciadores ("primers") para dar partida ao processo de síntese 
em um local específico.Um "primer" serve para sintetizar a seqüência alvo no sentido 
3’- 5’e outro para o sentido inverso isto é, 5’-3.’ O "primer" é uma pequena seqüência 
de nucleotídeos que hibridiza no início da seqüência alvo que se quer amplificar e da 
qual ele é complementar. Ao reconhecer o "primer," a polimerase sintetiza uma cópia 
complementar, obedecendo à informação contida na seqüência de DNA que será 
replicada (sintetizada). 
 
Etapas do processo: 
 
Extração do DNA da amostra que se pretende estudar 
Purificação do DNA 
Preparação de uma mistura chamada Master Mix, que conterá todas as substâncias 
necessárias à sintese de novas cópias de DNA 
Incubação em um termociclador, que é o aparelho responsável pela execução de todos 
os ciclos da reação aquecendo e resfriando o/os tubo/s 
Eletroforese em gel de poliacrilamida dos produtosda PCR 
Revelação e fixação do gel 
 
Reagentes da PCR: 
 
Solução tampão para se garantir pH e concentrações iônicas adequadas à reação 
Deoxinucleosídeos trifosfatos ( dATP, dGTP, dCTP, dTTP ) que atuam como 
tijolos na construção das moléculas de DNA 
Os primers 
A Taq-polimerase 
H2O 
Mg+2 para optimizar a reação (nem sempre é usado) 
O DNA extraído da amostra 
Alguns adjuvantes quando necessário 
 
A reação em si – os ciclos: 
 
Existem três fases básicas ou ciclos para cada reação de PCR. Cada ciclo contém 
um ou mais passos e duas variáveis em cada passo: a temperatura e a duração. 
Etapa de desnaturação inicial: consiste de um único passo de desnaturação a 94ºC 
por 5 minutos. Dificilmente altera-se esta etapa. 
O bojo da PCR toma local neste ciclo, que é subdividido em três: 
1) Etapa de anelamento; este é o passo que habilita os primers a anelar a fita 
simples desnaturada. O tempo necessário para anelamento é de 30-45 segundos. 
2) Etapa de extensão. É neste passo que a Taq polimerase age para estender o 
molde. Regularmente ela é realizada a temperatura de 72º (a atividade enzimática ótima 
é de 76 - 79ºC), dificilmente altera-se a temperatura de 72º. Uma regra para se estimar a 
extensão do tempo é a de que para cada 1000 nucleotídeos atribuímos 1 minuto. Outra 
fórmula popular é calcular 60 bases por segundo. 
3) Etapa de desnaturação: A desnaturação da molécula de DNA formado serve 
como molde para o próximo ciclo. Ela é realizada a temperatura de 93-94ºC. Nesta 
temperatura a enzima tem uma meia vida de cerca de 1 hora. 
Estes três passos são repetidos 30-40 vezes em particular para análises de 
digestão. Se os ciclos excederem esta quantidade eles poderão introduzir mutações com 
a Taq polimerase. 
Etapa de extensão final. Isto é feito com um único ciclo em dois passos: um passo 
de anelamento o qual é idêntico ao passo de anelamento na segunda etapa de PCR 
(mesmo tempo e mesma temperatura). O segundo é a de extensão longa temperatura 
idêntica ao passo de extensão, porém com duração de 3-5 minutos ( 72ºC) por 5 
minutos. Isto habilita toda amplificação semi-iniciada a se completar. 
 
 
 
 
Diferentes aplicações da PCR: 
 
 Estudo do padrão de expressão gênica (transcritos raros) 
 Seleção de clones recombinantes 
 Sequenciamento direto de produtos amplificados 
 Detecção de mutações em genes específicos 
 Estudos diagnósticos de doenças infecciosas, detecção de bactérias, vírus e 
protozoários parasitas 
 Diagnóstico pré-natal em caso de risco 
 Elucidação de relações evolutivas entre espécies, utilizando material 
arqueológico 
 Grande valia na Medicina Forense (impressão digital de DNA) 
 
 
 
Revelação da PCR em gel de poliacrilamida; 
 
 
 
Como a PCR é utilizada na Ciência Forense 
 
A ciência forense consiste na aplicação de procedimentos científicos para ajudar a 
resolver assuntos de cunho legal. Na cena de qualquer crime, uma série de provas físicas 
pode ser deixada, vinculando um criminoso a um crime ou ajudando a reconstruir a 
sequência de eventos que ocorreram. 
Em investigações criminais, alguns fios de cabelo, células da pele, sangue ou 
outros fluidos corporais podem ser deixados no local e o DNA recolhido a partir dessas 
amostras tem a capacidade de indicar uma solução ao crime. 
 
Impressão Digital Genética 
Assim como os indivíduos tem características únicas que o difere dos demais 
como estatura, cor dos olhos e cabelo, o DNA também possui uma característica única e 
permite distinguir um indivíduo de outros com muito mais precisão e menores chances 
de erro. Cada indivíduo é geneticamente diferente de todos os outros, constituindo uma 
verdadeira “impressão digital genética”, por isso a análise do perfil de DNA é tão 
importante para os cientistas forenses, uma vez que a possibilidade de se encontrar duas 
pessoas iguais por esse método é de uma em 10 trilhões. 
 
As vantagens da técnica de PCR 
Muitas vezes a quantidade de DNA disponível para análise é limitado, com a 
técnica de PCR, o menor vestígio de DNA encontrado pode ser amplificado, 
aumentando a quantidade de material e proporcionando o suficiente traçar o perfil 
genético e assim garantir a análise. 
A PCR ou Reação em Cadeia da Polimerase é uma técnica utilizada diariamente 
nos laboratórios e possibilita a amplificação de um dado fragmento da amostra de DNA 
inicial de forma exponencial. Graças ela, um teste genético pode ser iniciado a partir de 
uma única célula, pois o DNA será́ multiplicado in vitro em quantidade suficiente para 
ser detectado no teste. Assim, pequenas quantidades de amostras recolhidas a partir de 
uma cena de crime podem ser comparadas com o DNA de outras pessoas, identificando 
ou descartando suspeitos durante uma investigação. A PCR também pode ser usada no 
teste de paternidade, em que existe uma comparação entre os indivíduos, confirmando 
ou descartando seu parentesco, identificando os pais biológicos da criança. 
 
Prática Forense 
Antes de se identificar o perfil genético é realizada a extração do DNA da amostra 
e só então empregada a técnica de PCR para amplificar o material. 
 
Material genético para a análise de DNA 
O DNA pode ser encontrado em todas as células vivas do nosso corpo. 
Sangue – embora a maioria das células vermelhas não contenha, também é 
formado por células brancas que contém DNA e pode ser obtido mesmo de pequenas 
amostras. 
Cabelo – principalmente na raiz, pois o comprimento pode até ser utilizado para 
alguns processos de tipagem, mas não outros. 
Saliva – a saliva tem células da boca, então qualquer traço de saliva permite a 
identificação do DNA. 
Pele – tocar um objeto pode deixar células suficientes para a tipagem de DNA. 
Osso – normalmente utilizados para identificação de corpos, que podem ter até 
décadas. 
Existem também outras amostras de onde é possível extrair o DNA como urina, 
fezes, dentes, sêmen e outros fluidos corporais. 
 
A extração do DNA 
A impressão digital genética do DNA (ácido desoxirribonucleico), representada 
pelo material genético básico de cada indivíduo é composta de uma substância existente 
nos cromossomas, constituída de uma extensa fita dupla de nucleotídeos com as bases 
de adenina (A), timina (T), guanina (G) e citosina (C). 
A extração do DNA, em termos simples, é a remoção de ácido 
desoxirribonucleico a partir das células da amostra, usado muitas vezes como um passo 
inicial em diversos processos. 
Como acontece a extração: 
1. Quebra da célula (lise) para expor o seu DNA, conseguido geralmente através da 
mistura ou trituração da célula. 
2. O próximo passo envolve quebrar e emulsionar a gordura e as proteínas que 
formam a membrana da célula, processo realizado através da adição de soluções 
de sais e detergentes. 
3. O DNA é separado a partir da solução líquida por meio da adição de um álcool e 
da centrifugação 
4. Após todo esse processo o DNA está pronto para ser utilizado na próxima etapa, 
a PCR. 
 
PCR (Polymerase Chain Reaction) na análise forense 
A quantidade de provas de DNA obtidas durante a investigação de um crime é 
frequentemente muito pequena. A PCR é uma técnica que permite a amplificação 
exponencial de DNA para cerca de 10.000 pares de bases, ou seja, uma única cópia de 
um fragmento de DNA pode ser amplificada para milhões de cópias em apenas algumas 
horas. A PCR é especialmente benéfica na amplificação de quantidades pequenas ou 
amostras degradadas. 
O ciclo de PCR consiste em três etapas principais: desnaturação (separação da 
dupla fita de DNA), emparelhamento (iniciadores determinam a região a ser copiada) e 
extensão (conhecida como alongamento, aenzima taq polimeraze complementa a fita, 
formando novamente uma dupla fita). 
 
Eletroforese 
Os fragmentos de DNA resultantes são então processados usando eletroforese. A 
separação e detecção destes fragmentos resulta em um padrão único de bandas, a 
impressão digital genética. Este padrão é usado em investigações criminais para 
comparar o DNA do suspeito com DNA encontrado no local do crime. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Pontos Principais: 
 A reação em cadeia da polimerase, ou PCR, é uma técnica para fazer muitas 
cópias de uma região específica do DNA, in vitro (em um tubo de ensaio, ao 
invés de um organismo). 
 A PCR depende de uma DNA polimerase termoestável, a Taq polimerase, e 
requer primers de DNA projetados especificamente para a região de interesse 
do DNA . 
 Na PCR, a reação é repetida ciclicamente através de uma série de alterações de 
temperatura, o que possibilita a produção de muitas cópias da região de 
interesse. 
 A PCR tem muitas aplicações práticas e em pesquisa. Ela é rotineiramente usada 
em clonagens de DNA, diagnósticos médicos e análises forenses de DNA. 
 
O que é PCR? 
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica rotineira de laboratório 
usada para fazer muitas cópias (milhões ou bilhões) de uma região específica do DNA. 
Essa região do DNA pode ser qualquer objeto de interesse do pesquisador. Por exemplo, 
pode haver um gene cuja função o pesquisador queira compreender ou um marcador 
genético usado pelos cientistas forenses para correlacionar o DNA da cena do crime 
com os suspeitos. 
Tipicamente, o objetivo da PCR é fabricar quantidade suficiente da região de 
interesse do DNA, de modo que essa possa ser analisada e utilizada de alguma outra 
maneira. Por exemplo, DNA amplificado por PCR pode ser enviado 
para sequenciamento, visualizado por eletroforese em gel, ou clonado em plasmídeo 
para futuros experimentos. 
A PCR é usada em muitas áreas da biologia e medicina, incluindo pesquisa em 
biologia molecular, diagnósticos médicos e mesmo alguns ramos da ecologia. 
 
Taq polimerase 
Assim como a replicação de DNA em um organismo, a PCR requer uma enzima DNA 
polimerase que faça novas fitas de DNA usando as existentes como moldes. A DNA 
polimerase tipicamente usada na PCR é chamada de Taq polimerase, em homenagem à 
bactéria resistente ao calor da qual ela foi isolada (Thermus aquaticus). 
T. aquaticus vive em fontes termais e de água quente. Sua DNA polimerase é bastante 
estável ao calor e é mais ativa à 70°C (temperatura em que as DNA polimerases 
humanas ou de E. coli seriam disfuncionais). Essa estabilidade ao calor torna a Taq 
polimerase ideal para PCRs. Como veremos, a alta temperatura é usada repetidamente 
na PCR para desnaturar o DNA molde, isto é, separar suas fitas. 
 
Primers de PCR 
Como outras DNA polimerases, a Taq polimerase consegue fabricar DNA somente 
quando lhe é dado um primer, uma sequência curta de nucleotídeos que fornece um 
ponto de partida para a síntese de DNA. Em uma reação de PCR, o pesquisador 
determina a região do DNA que será copiada, ou amplificada, pelos primers que ela ou 
ele escolher. 
Os primers de PCR são pedaços curtos de DNA de fita simples, geralmente por volta 
de 202020 aminoácidos de comprimento. Dois primers são usados para cada reação de 
PCR, e eles são projetados de modo que englobem a região de interesse (região que 
deve ser copiada). Isto é, são dadas sequências que os farão se ligar a fitas opostas do 
DNA molde, bem nas extremidades da região a ser copiada. Os primers se ligam ao 
molde por pareamento de bases complementares. 
 
 
 
DNA molde: 
 
5' TATCAGATCCATGGAGT...GAGTACTAGTCCTATGAGT 3' 3' 
ATAGTCTAGGTACCTCA...CTCATGATCAGGATACTCA 5' 
Primer 1: 5' CAGATCCATGG 3' Primer 2: 
Quando os primers são ligados ao molde, eles podem ser estendidos pela polimerase, e a 
região que está entre eles será copiada. 
 
As etapas da PCR 
Os principais ingredientes de uma reação PCR são a Taq polimerase, primers, DNA 
molde e nucleotídeos (blocos que compõem o DNA). Os ingredientes são reunidos em 
um tubo, juntamente com cofatores de que a enzima precisa, e passam por repetidos 
ciclos de aquecimento e resfriamento que permitem que o DNA seja sintetizado. 
As etapas básicas são: 
1. Desnaturação (96°C): Aquece fortemente a reação para separar, ou desnaturar, 
as fitas de DNA. Isso proporciona um molde de fita simples para a próxima 
etapa. 
2. Anelamento (555555 - 656565°C): Resfria a reação para que os primers possam 
se ligar às suas sequências complementares no DNA molde de fita simples. 
3. Extensão (72°C): Eleva a temperatura da reação para que a Taqpolimerase 
estenda os primers, sintetizando novas fitas de DNA. 
 
 
Este ciclo se repete 252525 - 353535 vezes em uma reação típica de PCR, que 
geralmente ocorre em 222 - 444 horas, dependendo do comprimento da região de DNA 
a ser copiada. Se a reação for eficiente (funcionar bem), a região de interesse pode gerar 
de uma ou poucas cópias até bilhões. 
Isso porque não é apenas o DNA original que é utilizado como molde a cada vez. Ao 
invés, o novo DNA feito em uma rodada pode servir de molde na próxima rodada de 
síntese de DNA. Há muitas cópias dos primers e muitas moléculas de Taq polimerase 
flutuando pela reação, então o número de moléculas de DNA pode aproximadamente 
dobrar a cada rodada do ciclo. Esse padrão de crescimento exponencial é mostrado na 
imagem abaixo. 
 
 
Uso da eletroforese em gel para visualizar os resultados da PCR 
Os resultados de uma reação PCR são geralmente visualizados (tornam-se visíveis) através do uso 
da eletroforese em gel. Eletroforese em gel é uma técnica na qual fragmentos de DNA são puxados 
por uma corrente elétrica através de uma matriz de gel, e que separa os fragmentos de DNA de 
acordo com o tamanho. Um padrão, ou escada de DNA, é tipicamente incluído para que o tamanho 
dos fragmentos nas amostras da PCR possa ser determinado. 
Fragmentos de DNA de mesmo comprimento formam uma "banda" no gel, que pode ser vista a olho 
nu se o gel for pigmentado com um corante que se liga ao DNA. Por exemplo, uma reação de PCR 
produzindo um fragmento de 400400400 pares de bases (pb) apareceria desta maneira no gel: 
 
Uma banda de DNA contém muitas e muitas cópias da região de interesse do DNA, não apenas uma 
ou algumas cópias. Como o DNA é microscópico, muitas cópias têm de estar presentes antes que 
possamos vê-las a olho nu. Isso é uma grande parte do porquê de a PCR ser uma ferramenta 
importante: ela produz cópias suficientes de uma sequência de DNA de modo que possamos ver ou 
manipular aquela região de DNA. 
Aplicações da PCR 
Através da PCR, uma sequência de DNA pode ser amplificada milhões ou bilhões de vezes, 
produzindo cópias suficientes de DNA para serem analisadas por outras técnicas. Por exemplo, o 
DNA pode ser visualizado por eletroforese em gel, enviado para sequenciamento, ou digerido por 
enzimas de restrição e clonado em um plasmídeo. 
A PCR é usada em muitos laboratórios de pesquisa e também tem aplicações práticas em ciências 
forenses, testes genéticos e diagnósticos. Por exemplo, a PCR é utilizada para amplificar genes 
associados a desordens genéticas a partir do DNA de pacientes (ou do DNA fetal, nos casos de teste 
pré-natal). A PCR também pode ser utilizada para testar se há DNA bacteriano ou viral no corpo de 
um paciente: se o patógeno estiver presente, pode ser possível amplificar regiões de seu DNA a 
partir de uma amostra de sangue ou tecido. 
 
Amostra-problema: A PCR nas ciências forenses 
Suponha que você esteja trabalhando em um laboratório de ciências forenses. Você acabou dereceber uma amostra de DNA de um cabelo deixado em uma cena de crime, juntamente com 
amostras de DNA de três possíveis suspeitos. Seu trabalho é examinar um marcador genético em 
particular e verificar se algum dos três suspeitos coincide com o DNA do cabelo para esse marcador. 
O marcador vem em dois alelos, ou versões. Um deles contém uma única repetição (região marrom 
abaixo), enquanto o outro contém duas cópias da repetição. Em uma reação PCR com primers que 
atuam na região de repetição, o primeiro alelo produz um fragmento de DNA de 200bp, enquanto o 
segundo produz um fragmento de DNA de 300bp: 
 
 
Mais sobre PCR e ciências forenses 
Em testes forenses reais com o DNA da cena do crime, os técnicos fariam uma análise conceitual 
similar à representada no exemplo acima. Contudo, uma série de marcadores diferentes (não apenas 
o único marcador do exemplo) seria comparada entre o DNA da cena do crime e o DNA do suspeito. 
Ademais, os marcadores usados em análises forenses típicas não vêm apenas em duas formas 
diferentes. Em vez disso, eles são altamente polimórficos (poli = muitas, morfo = formas). Isto é, 
eles vêm em muitos alelos que variam minimamente em comprimento. 
O tipo mais comum de marcadores usado nas ciências forenses, chamado microssatélites (STRs na 
sigla em inglês), consiste em várias cópias da mesma sequência curta de nucleotídeos que se repetem 
(tipicamente, 222 a 555nucleotídeos de comprimento). Um alelo de um STR pode ter 20 repetições, 
enquanto outro pode ter 18 e um outro apenas 10. 
Por meio do exame de múltiplos marcadores, cada um dos quais vem em muitas formas de alelos, os 
cientistas forenses podem montar uma "impressão digital" singular a partir de uma amostra de DNA. 
Em uma análise típica de STR usando 13 marcadores, as chances de um falso positivo (duas pessoas 
tendo a mesma "impressão digital" de DNA) são menores que 11 em 10 bilhões! 
Embora possamos pensar na evidência de DNA sendo usada para condenar criminosos, ela tem tido 
um papel crucial na exoneração de pessoas falsamente acusadas (incluindo algumas que estavam 
presas há muitos anos). A análise forense também é usada para estabelecer paternidade e identificar 
restos mortais de cenas de desastres.