IMUNODIAGNÓSTICO

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IMUNODIAGNÓSTICO
Será visto alguns testes que utilizam o princípio da imunologia, o Ag e o AC.
Quando pesquisa o Ag é o teste indireto e, quando pesquisa AC (mais fácil, coleta o sangue e separa o soro, que contém os AC) é o teste direto.
 
A reação que será analisada é a de antígeno com anticorpo, estes podem ser feitos em laboratório, podendo colocar junto a um antígeno e ver se ocorre alguma reação, da mesma maneira pode haver antígenos incubados em laboratórios.
 
A pesquisa de AC será para a identificação de um animal doente, para avaliar a vacinação (se os níveis de AC estão adequados) ou estabelecer a prevalência de uma doença no rebanho (se faz uma amostragem do rebanho com o soro e faz um teste de AC verificando a porcentagem de animais que apresentam a prevalência de certo AC e então de determinada doença).
 
Existem reagentes utilizados no processo, o principal é o soro, sendo obtido através do sangue coagulado. 
É mais fácil usar o soro do que o plasma, pois não há necessidade de esperar coagular.
Também tem os antígenos (se está sendo pesquisado AC é necessário o uso de antígenos para ter a ligação e isso poder ser visualizado), antiglobulinas (AC marcado, são AC que se ligam em AC, marcada com alguma substância que irá auxiliar na identificação do teste).
Podem também ser utilizados AC monoclonais (se está pesquisando um antígeno, utilizada um AC que pode ser monoclonal, que é mais específico, se direciona especificamente a uma determinada área do antígeno, é mais homogênea, já os policlonais reconhecem mais de uma região de um antígeno, ligando-se em vários epítopos).
 
Os AC policlonais derivam de diferentes linhagem de LB e assim dirigidos a diferentes epítopos do antígeno.
Os AC monoclonais são AC produzidos de uma única linhagem de LB e assim todos dirigidos para o mesmo epítopo.
Os AC policlonais são produzidos por uma técnica simples, a partir de uma cobaia que recebe uma injeção do antígeno purificado. Depois espera-se um tempo para acontecer a soroconversão (produção de LB, AC contra o Ag...), feito a coleta de sangue, separado o soro e purificado os AC que o animal produziu durante a resposta imune. 
 
No caso dos monoclonais (tecnologia mais recente, mais difícil de fazer) o animais também receberá uma injeção (vacina com o Ag), irá produzir AC da mesma maneira, e então, os LB de diferentes linhagens produzidos são coletados do animal, separados e fundidos com células de mieloma (células que tem capacidade de se multiplicar independentemente e ficam produzindo o AC). Isso forma os hibridomas (método feito em lab) conseguindo selecionar quais linhagens de LB irão ser usadas, pois cada uma tem a capacidade de produzir um AC específico. São colocadas em cultivo e os AC são purificados, podendo serem usados em testes.
 
Os AC monoclonais possuem uma auto especificidade, alta homogeneidade (apenas um AC na solução) e ausência de AC não específico (pois no modo policlonal, o AC pode entrar em contato com outros antígenos e produzir outros AC, no monoclonal são produzidos exatamente o que se quer). 
As desvantagens é que são mais caros, se o epítopo for destruído mesmo que o antígeno esteja presente este não será identificado.
Técnica mais trabalhosa por ser mais específica.
 
Os Ag policlonais são de menor custo, tem capacidade de detectar o antígeno mesmo que vários epítopos tenham sido destruídos e é mais fácil de se obter.
As desvantagens é que possui menor especificidade, menor homogeneidade e há a possibilidade de presença de AC não específicos.
 
Estes testes podem ser classificados em 3 grupos, separados de acordo com o que se vai visualizar no teste:
Teste de ligação primária: medem diretamente a interação entre Ag e AC (visualiza a interação Ag + AC)
Ex: a Imuno Fluorescência (IF) direta, onde há um AC que se liga diretamente no Ag e o Ag é então marcado com uma fluorescência que é emitida, observada no microscópio.
Teste de ligação secundária: medem as consequências da formação de imunocomplexos in vitro.
Ex: a Fixação do Complemento, onde quando ligados (Ag + AC) há ativação do SC, e pode ser observada a ação do SC numa hemácia, que se rompe pela ativação.
Teste de ligação terciária: medem as consequências da resposta imune in vitro.
Ex: soroneutralização.
 
 
Coisas a serem observadas na escolha de um teste:
Sensibilidade: porcentagem de resultados positivos em pacientes com a doença. É definida pela proporção de animais com a doença em interesse que tem o resultado do teste positivo, indica o quão bom é o teste para identificar os indivíduos doentes. Quanto maior a sensibilidade, maior o poder de detectar a doença.
99% de sensibilidade significa que somente 1% dá falso negativo.
Especificidade: porcentagem de resultados negativos em pacientes sem a doença. É medido em animais saudáveis. Proporção de animais sem a doença que tem o teste negativo, indica o quão bom o teste é para identificar os indivíduos não doentes.
95% significa que, 95% dos pacientes sem a doença serão identificados e 5% serão falsos negativos.
Um teste será mais sensível quando apresentar menor resultados falsos negativos e mais específicos quando apresentar menos resultados falsos positivos.
 
Os testes podem ser classificados em outros grupos, onde é observado:
Precipitação: formação do complexo Ag + AC. 
Difusão em ágar gel.
Aglutinação: é o agrupamento de partículas por moléculas de AC que se ligam a antígenos na superfície de partículas adjacentes. O AC se liga e há uma aglutinação, formando grumos.
Imunoensaios: reagentes marcados (pode ser o Ag ou o AC) com imunoflorescência ou ELISA (AC ligado a uma enzima que age sob o substrato e muda a cor do meio).
 
TESTES
TITULAÇÃO DE ANTICORPOS
É uma forma de mensurar níveis de AC específicos.
O soro (ou amostra com Ag) a ser testado sofrerá uma diluição seriada (concentrações decrescentes) e encubados com uma quantidade fixa de antígeno.
A reação ocorre nos tubos e no último tubo no qual a reação ocorrer, será classificado como tubo de titulação.
Ex: ocorre uma reação de precipitação, formando os grumos. 
Pode testar só o soro não diluído, e em outro adicionar uma quantidade de antígeno, usando os dois tipos, com soro diluído e não diluído.
Se o soro possuir AC, vai ocorrer a ligação com o Ag e vai precipitar.
Analisa-se até onde a reação consegue ocorrer, até quanto de diluição ainda ocorre aglutinação. 
TÍTULO: maior diluição dos AC onde ainda há manifestação da reação.
 
ELISA (Ensaio Imuno Enzimáticos Ligado a uma Enzima)
É um dos métodos mais utilizados para determinar a concentração de antígenos e AC.
Apresenta alta sensibilidade e especificidade.
Pode ser tanto qualitativo como quantitativos.
Se baseia na ligação Ag-AC, que são detectados através de reações enzimáticas, sendo o AC marcado com essa enzima que age sobre um substrato mudando a coloração do meio.
 
É feito em uma base sólida, uma placa de polietileno, e podem ser feitas 96 amostras, pois são 96 poços na placa.
É analisado em quais dos poços ocorreu a reação, através da visualização da mudança de coloração ou colocando a placa num aparelho de escpectofotometria, que gera uma avaliação quantitativa.
É necessário um AC purificado, um Ag purificado, e sempre é feito um controle positivo e negativo (para que se possa ter certeza que o teste está dando certo), solução tampão de lavagens (sempre que se adiciona um reagente deve-se colocar também uma solução), conjugado (AC ligado a uma enzima) e cromógeno (substância incolor que na ocorrência de oxidação ou ação da enzima produz cor).
 
Geralmente, usa-se soro como amostra, utiliza-se pipetas e um espectrofotômetro que converte a intensidade da luz em valores numéricos, fazendo um gráfico.
Utilizado no diagnóstico de várias doenças, como diarreia viral bovina, herpesvírus bovino tipo I, rotavírus, doenças autoimunes, tôxinas, hormônios, indústria de alimentos como salmonela, listeria.
 
Vantagens: testar várias amostras ao mesmo tempo, realização relativamenterápida, simples e de custo baixo e médio, método altamente sensível-específico, alto grau de confiabilidade, com pouco risco de dar falso negativo ou positivo. 
Desvantagens: necessidade de uma mão de obra específica, os reagentes podem degradar facilmente (luz e temperatura, precisam ser bem conservados), devido a alta sensibilidade e especificidade, variação na pipetagem, tempo de incubação e alteração de resultados.
 
Há 3 tipos de ELISA:
ELISA indireto: 
Pesquisa o AC, com uma placa revestida com o antígeno.
Adiciona nos poços uma solução com antígeno que se adere a placa, necessitando de uma solução de lavagem para que aquilo que não se ligou a parede seja removido.
Coloca uma segunda solução (soro) que, se houver AC, irá se ligar ao Ag, fazendo uma nova lavagem para remover o que não ligou.
Adiciona o conjunto que se liga aos AC, uma nova lavagem é feita e adiciona cromógeno e o substrato que se for oxidado pela ação enzimática haverá desenvolvimento de cor.
ELISA direto ou sanduiche:
A pesquisa é por Ag, a placa é revertida com AC.
Faz uma lavagem e adiciona a amostra, que se houver Ag específicos contra os AC, vai se ligar.
É feita mais uma lavagem e adiciona o conjugado que se liga aos AC's.
Mais uma lavagem.
Cromógeno e substrato são adicionados, se o cromógeno for oxidado pela ação da enzima ocorre a reação que altera a coloração do meio.
ELISA por competição
É pesquisado o Ag, sensibilizando a placa com AC.
Há uma lavagem para retirar os AC's livres e então adiciona-se duas soluções: uma com o Ag a ser pesquisado e uma segunda solução que possui um Ag já marcado (conjugado) com uma enzima. 
O Ag marcado e o da amostra competem pelo sítio de ligação no AC, portanto o que estiver em maior concentração vai se ligar ao AC.
É feita uma lavagem para retirar os Ag não capturados e adiciona-se o cromógeno e substrato.
Se houver uma grande ligação do Ag marcado com o AC, ocorrerá a emissão de cor.
Se houver Ag não marcado ligados em maios quantidade a cor não aparece. 
Dentre as enzimas que convertem o substrato pro colorido, a mais utilizada é a peroxidase, que catalisa uma reação com água e oxigênio. Essa reação que seleciona o cromôgeno e altera a cor da reação, porém podem também ser usadas cataleses, fosfatase alcalina.
 
IMUNODIFUSÃO EM AGAR GEL
Técnica simples, rápida e de baixo custo.
Pesquisa apenas AC.
É um teste qualitativo, só indica se tem ou não tem. 
Observa-se a precipitação do complexo Ag/AC.
Os poços são feitos no gel, que permite a passagem das proteínas (tanto AC quanto Ag). Acrescenta-se o poço do meio o Ag, e nos outros (ao redor) o soro teste e em alguns o controle positivo. Se houver anticorpos (específicos) no soro os dois reagentes se difundirão para todos os lados, e onde se encontram no ágar, formam uma linha de precipitação branca. 
Após 48 horas, pode ser feito a leitura, de onde houve a precipitação do AC/Ag.
É um teste que costuma ser usado em anemia infecciosa equina, leucose bovina e artrite e encefalite caprina.
Vantagens: é um teste bastante específico, pode-se testar várias amostras, tem baixo custo.
Desvantagens: a sensibilidade é baixa, a leitura é subjetiva e só prova-se qualitativamente.
 
HEMAGLUTINAÇÃO
Teste direto pela pesquisa de Ag, sendo que neste caso são apenas vírus.
Só funciona com alguns destes vírus (os que apresentam na sua superfícies algumas estruturas capazes de aglutinar eritrócitos).
Coloca-se a amostra junto com uma solução de hemácias, e se houver vírus, ocorre ligação e sedimentação em forma difusa. Caso contrário, os eritrócitos que não se aglutinam se depositam pela ação da gravidade no poço, formando um botão de hemácias. 
É qualitativo, mas pode ser feito o quantitativo se ocorrer diluição seriada da amostra.
O título se dá pelo maior resultado dado nas diluições.
Ex: se parar de aglutinas na 4ª diluição, o titulo é 1 para 4.
 
INIBIÇÃO DA HEMAGLUTINAÇÃO
Pesquisa do AC.
É um teste indireto.
Coloca-se o vírus em contato com o soro do indivíduo, é inoculado e espera-se a reação ocorrer (Ag + vírus), assim o anticorpo neutraliza a ação do vírus no processo de aglutinação, ou seja, o vírus não consegue aglutinar as hemácias. É portanto, o contrário da reação anterior.
Se ocorrer aglutinação não há AC.
 
Sorologia pareada
Para dosar AC no soro de pacientes pode ser feita por sorologia pareada, é utilizada quando, por exemplo, o animais apresenta AC, foi vacinado, e portanto apresenta o título de AC. Conforme passa os anos, este título começa a cair, não sendo suficiente para combater a doença. É, então, coletada amostra do soro do animal na fase aguda (inicio da doença) e depois de duas semanas (fase covalescente), e se comparado a duas houver um aumento do título de AC de pelo menos 4 vezes, significa que é uma infecção recente e é uma soroconversão, podendo ser usado como diagnóstico. Se medir na fase covalescente e o nível de amostra estiver igual, ele não tem a doença e os AC são da vacina. 
 
Usos da inibição da hemoglutinação: em parvovírus suínos, canino, influenza e parainfluenza (pois possuem aglutinina no seu envelope e também conseguem aglutinar), assim nem todos os vírus podem ser usados neste teste. 
Vantagens: é de baixo custo, rápido, boa especificidade e sensibilidade e fácil execução.
Desvantagens: só pode ser usado pra certos tipos de vírus e necessita de espécies doadoras de hemácias para fazer a aglutinação.
 
FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO
Técnica que também utiliza eritrócitos, a partir da hemaglutinação, onde utiliza-se a capacidade citolítica que é a capacidade de ativar o Sistema Complemento para formar o MAC, onde destrói o eritrócito que elimina a hemoglobina.
É um método sorológico para detectar AC, mas também pode ser usado para detectar a presença de Ag.
O AC vai estar na membrana dos eritrócitos e ligando-se com o Ag, vai ter uma mudança na região FC, expondo alguns sítios que ativam o Sistema Complemento pela via clássica.
Pode ser qualitativo ou quantitativo, quando é feita a diluição seriada da hemácia e pode ser observada a máxima diluição onde a reação ocorre.
Primeiro é feito uma incubação do soro teste para inativar as proteínas do SC que podem alterar o resultado. 
Tem-se então o soro com AC, adiciona o sistema hemolítico (hemácia coberta com Ag), o AC se liga no Ag expondo o sítio de ligação, iniciando e ativando o SC, que insere o complexo de ataque a membrana no eritrócito, rompendo a célula e liberando hemoglobina. Isso é centrifugado e observado uma solução avermelhada.
Se não tiver AC, a hemácia permanece intacta e quando centrifugado forma o botão no fundo.
É usada também para pesquisa de Ag, incubando o soro com AC monoclonais, que é dirigido pro Ag pesquisado, portanto, há ligação do AC com o Ag e não há ativação do SC nem formação do MAC.
 
IMUNOFLUORESCÊNCIA
Permite detecção e localização de Ag ou de AC.
Se utiliza o AC marcado (secundário) com fluorocromo que absorve luz UV e luz visível. 
 
Imunofluorescência direta
 Pesquisa o Ag, utiliza-se o AC marcado na solução, espera ele se ligar, faz uma lavagem pra remover o que não se ligou e coloca isso numa lâmina pra observar o que está emitindo luz.
Vantagens: alta especificidade e sensibilidade, possibilidade de detecção de proteínas intracelulares em sua localização (se fizer um corte no tecido consegue encontrar onde estão as proteínas)
Desvantagens: alto custo e pode ter uma certa subjetividade na leitura.
Imunofluorescência indireta
Mesmo princípio para pesquisa de AC.
O Ag é padronizado, é fixado na lâmina, e é colocado o soro do paciente.
Se tiver AC, vai se ligar. 
Utiliza-se um segundo AC marcado com substância fluorescente, se houver AC no soro, o conjugado reage com o AC específico para Ag.
Observa isso no microscópio de fluorescência. 
 
IMUNOHISTOQUÍMICA
Semelhante a imunofluorescência, mas em vez de estar marcado com o fluorocromo, está marcado com enzima (parecido com o ELISA).
Adiciona-se substrato e a substancia de cor.
Mais utilizado para detectarantígeno.
 
SORO NEUTRALIZAÇÃO
Técnica utilizada para pesquisar AC contra toxina ou vírus.
Para o vírus ou toxina se ligar na célula precisa se ligar no receptor dela para entrar na célula, e deseja-se ver se o AC tem o necessário para neutralizar esse vírus. 
É incubado o soro teste com a toxina ou vírus, colocado em cultivo celular, se o resultado for positivo, os AC vão ocupar os receptores da toxina e do vírus, que se conjugariam com a célula, impedindo a cultura celular.
Se não tiver o AC, o vírus entra na célula, destrói tudo.
Vantagens: é específica, sensível e pode ser feita diluição seriada.
Desvantagens: precisa do cultivo de células ou cobaia.