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CURSO: Transformação genética de plantas
Estudo Dirigido: Clonagem e Isolamento de genes
Qual a aplicabilidade da enzima de restrição na tecnologia do DNA recombinante?
R: As enzimas de restrição são essenciais na tecnologia do DNA recombinantes. Elas servem para inserir um gene de interesse em um vetor plasmidial através do corte promovido por elas. A (s) mesma (s) enzima (s) deve ser usada para cortar o DNA e o vetor para haver um encaixe perfeito.
Considere que você quer produzir uma planta transgênica A, que sintetiza uma proteína de uma planta B. Para isto, o gene que codifica para esta proteína tem que ser isolado da planta B. Partindo do pressuposto que a planta possua entre 25.000 e 50.000 genes, sugira a técnica que você usaria para isolar este gene em questão.
 	
R: Para isolar um gene, é mais vantajoso construir bibliotecas de DNA. Dois tipos podem ser preparados:
Biblioteca de DNA genômico – neste caso o genoma do organismo é clivado por endonucleases de restrição em fragmentos, resultado em um grande numero de sequencias. Estes fragmentos são inseridos em um vetor e depois cada fragmento é amplificado por clonagem, usualmente em bactéria.
Biblioteca de Cdna – OS rnaM PRESENTES EM UM TECIDO ESPECÍFICO SÃO ISOLADS E DEPOIS TRANSCRITOS EM CdnaS CORRESPONDENTES POR TRANSCRITASE REVERSA. Os cDNAs são inseridos em um vetor e amplificado por clonagem. Diferente dos fragmentos obtidos na biblioteca de DNA genômico, o cDNA resultando contém genes inteiros, sem os introns, e podem após a transformação, ser expresso em procariotos para sintetizar proteínas. Já que o cDNA não contém região promotora, tal expressão requer um promotor procariótico para ser adicionado ao cDNA.
 Considere o fragmento de DNA:
5´-AAGAATTGCG – 10pb
AATTCGACTTAA – 12 pb
GGG – 3pb
CCGCGCCGAAGCTTTAAAGGTTATATTTCC-3’ – 30pb
Quantos fragmentos resultarão da clivagem com as seguintes enzimas e indique o número de pares de bases de cada fragmento:
EcoRI: ( G’AATTC): _________________________________________________________
HaeIII: ( GG’CC): ___________________________________________________________
NotI: (GC’CCGG): _
Não faz corte_______________________________________________
Com as três enzimas juntas: Gera 4 fragmentos com as enzimas juntas.
Represente, em um gel de agarose, em que locais seriam esperadas bandas de DNA, considerando o marcador informado:
55 pb
45 pb
27 pb
 
b
 
De forma resumida, explique as 3 metodologias de transformação de plantas e em quais casos você as usaria?
R: As 3 metodologias são: 
Métodos diretos: biobalística e eletroporação – 
A técnica de biobalísta visa inserir o DNA de interesse usando micropartículas de ouro e a vácuo. O DNA entra pelo meristema da planta,e portanto, é integrado em células que estão em divisão celular. Muito usado em plantas de Arabidopsis thaliana.
Eletroporação é usada em protoplastos de células vegetais. Geralmente é usado em plantas que não são susceptíveis à infecção por Agrobactéria, como por exemplo, diversas monocotiledônias.
Método indireto: via Agrobacterium tumefaciens – Inspirado no sistema natural de infecção desta bactéria que acomete plantas dicotiledônias, essa metodologia insere o DNA de interesse em uma planta em estudo através do co-cultivo ou pelo Floral Dip. Este último é bastante usado na planta modelo Arabidopsis thaliana, pela imersão dos botões florais destas plantas. Com um surfactante no meio de cultura da Agro, que permite que o DNA exógeno seja inserido através de um ferimento promovido por esta substância, o DNA se integra ao genoma vegetal e passado para a progênie, por herança mendeliana. 
No caso do co-cultivo, é usado em explantes de plantas que tenham um ciclo de vida muito longo para emitir os botões florais, ou que não sejam facilmente acometidas pela Agro.
Nos dois casos, as plantas são selecionadas posteriormente em meio de cultivo contendo o antibiótico de resistência de acordo com o plasmídeo utilizado.
5. Indique a resposta para cada um dos passos que você deverá seguir para clonar um fragmento de 200 pb no vetor plasmidial pUC18:
Passo I
( ) hidrolisar o vetor plasmidial com uma endonuclease presente na região de multiclonagem;
( X) hidrolisar o vetor plasmidial com uma endonuclease presente na região de multiclonagem e o DNA de interesse com a mesma enzima;
( ) hidrolisar o vetor plasmidial com uma endonuclease presente na região de multiclonagem e o DNA de interesse com outra enzima;
Passo II
(X ) preparar a ligação do inserto ao vetor utilizando DNA-ligase;
( ) permitir que o vetor se circularize usando a DNA-ligase;
( ) hidrolisar novamente o DNA de interesse para ligá-lo ao vetor.
Passo III
( ) replicar o DNA de interesse;
( ) transformar bactérias com o DNA circular;
(X ) transformar bactérias com o DNA recombinante;
A seleção de promotores e de genes repórteres apropriados permite a expressão definida de um gene inserido. Quais os tipos de mais usados?
R: O Promotor mais usado é o 35S, que é constitutivo.
E os genes repórteres mais usados são o que codifica para β-Glucoronidase – GUS – que produz uma cor azul com reage com a substância X-Gluc. As plantas com o transgene deverão produzir essa coloração, e pode ser visualizado na lupa ou a olho nu.
O outro gene é a proteína GFP, de comprimento de onda fluorescente. As plantas transformadas podem ser analisadas in vivo. A planta de interesse é coletada e visualizada no microscópio confocal.
 
15) Considere a seqüência 5’ 3’ de DNA:
	1
	ACGTAGCTAG TAAAGTCTGT CCTTGATAGA 
AGCTTCGACT GACTAGTACT
	51
	GGACTATCAC CTTGAAGGAC CTGTGGACTT AGTCTGATCG TGACCGTAAG
Este fragmento de DNA foi colocado em uma solução com a endonuclease de restrição HindIII que reconhece a seqüência 5’-AAGCTT-3’ e hidrolisa o DNA entre os dois resíduos de ácido adenílico. Responda:
(a) quantos pb apresenta o fragmento de DNA? 100pb
(b) quantos fragmentos de DNA resultarão da digestão com HindIII? 2
 (c) quantos pb apresentam cada um dos fragmentos?
 30pb e 70pb