Marcadores Moleculares

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Prof. Dr. José Luis da C. SilvaProf. Dr. José Luis da C. Silva
PCR 
MARCADORES MOLECULARES
 
Histórico da PCRHistórico da PCR
Kornberg (1960) – Isolou e caracterizou a DNA polimerase. O isolamento 
desta enzima possibilitou o desenvolvimento da síntese “in vitro” de cadeias 
de DNA. Em poucos anos, o sequenciamento e a síntese de 
oligonucleotídeos tornaram-se rotina nos laboratórios de pesquisa;
Karl Mullis (1983) – Técnica de PCR – polymerase chain reaction – 
possibilita a amplificação “in vitro” de ácidos nucléicos. O advento da PCR 
acelerou os estudos de genomas de vários organismos, pois possibilitou a 
clonagem e o sequenciamento de DNA. 
Karl Mullis (1987) – Patenteou a técnica e vendeu para a empresa 
Hoffmann-La Roche em 1991.
 
Kary Mullis – 1983 (Prêmio Nobel 1993)
 
Princípios da técnica de PCRPrincípios da técnica de PCR
 Síntese enzimática “in vitro” de cópias de DNA a Síntese enzimática “in vitro” de cópias de DNA a 
partir da seqüência alvo;partir da seqüência alvo;
 A especificidade é dada pelo uso de primers A especificidade é dada pelo uso de primers 
(iniciadores) específicos para o gene ou região (iniciadores) específicos para o gene ou região 
do DNA de interesse;do DNA de interesse;
 A utilização de dois primers delimitam o alvo e a A utilização de dois primers delimitam o alvo e a 
repetição dos ciclos da PCR dá origem a bilhões repetição dos ciclos da PCR dá origem a bilhões 
de cópias do alvo.de cópias do alvo.
 
Amplificação de seqüências pela 
Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Uma DNA polimerase resiste a temperatura, a 
Taq polimerase, da bactéria Thermus 
aquaticus é usada para catalisar o crescimento 
a partir de primers de DNA. Pares de primers 
em filamentos opostos são ampliados um em 
cada direção ao outro. Após o término da 
replicação do segmento entre dois primer (um 
ciclo), dois novos dúplices são desnaturados 
por aquecimento para gerar moldes 
unifilamentares.
 
Etapas da PCREtapas da PCR
1) Desnaturação – abertura da dupla fita do DNA (94° 1) Desnaturação – abertura da dupla fita do DNA (94° 
C/100° C)C/100° C)
2) Anelamento (hibridização) dos primers em T° C mais 2) Anelamento (hibridização) dos primers em T° C mais 
baixabaixa
3) Reação de polimerização (síntese) da fita complementar 3) Reação de polimerização (síntese) da fita complementar 
pela Taq DNA polimerasepela Taq DNA polimerase
Repetição por 30 a 40 ciclos – animação Repetição por 30 a 40 ciclos – animação 
 
Reação de PCR em Termociclador
 
Eletroforese em gel de agarose visualização 
dos amplicons (fragmentos amplificados)
 
Variações da PCRVariações da PCR
 RT-PCRRT-PCR
 Nested-PCRNested-PCR
 PCR MultiplexPCR Multiplex
 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
 Real time PCR ( PCR em tempo real)Real time PCR ( PCR em tempo real)
 
RT – PCR
“Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction”
 
RT – PCR
 
RT – PCR
 
“Cycle threshold”
Limiar da fase
exponencial
 
Fluoróforos: absorvem e emitem luz em λ específico
 
Taq-Man (Fluoróforo + Quencher)
 
Taq-Man
 
“Molecular Beacon” : primers em estrutura secundária
Diferentes cores
 
 Marcador molecular é todo e qualquer fenótipo molecular Marcador molecular é todo e qualquer fenótipo molecular 
oriundo de um gene expresso (como em isoenzimas) ou de um oriundo de um gene expresso (como em isoenzimas) ou de um 
segmento específico de DNA (expresso ou não).segmento específico de DNA (expresso ou não).
 Marcadores genéticos são unidades herdáveisMarcadores genéticos são unidades herdáveis
 Quando o comportamento do marcador segue as leis de herança Quando o comportamento do marcador segue as leis de herança 
de Mendel (quando analisado o seu comportamento em uma de Mendel (quando analisado o seu comportamento em uma 
população segregante), ele pode adicionalmente ser definido população segregante), ele pode adicionalmente ser definido 
como um marcador genético.como um marcador genético.
Marcadores molecularesMarcadores moleculares
 
 A molécula de DNA sofre alterações (mutações). As mutações A molécula de DNA sofre alterações (mutações). As mutações 
são mais toleradas quando acontecem em regiões não-são mais toleradas quando acontecem em regiões não-
codificantes, e as mutações tornam-se estáveis, sendo codificantes, e as mutações tornam-se estáveis, sendo 
transmitidas aos seus descentes.transmitidas aos seus descentes.
 Como é muito grande a variação no número e no tipo de mutações Como é muito grande a variação no número e no tipo de mutações 
estáveis do DNA – fenômeno conhecido como polimorfismo estáveis do DNA – fenômeno conhecido como polimorfismo 
genético – é possível identificar uma pessoa com base no seu genético – é possível identificar uma pessoa com base no seu 
padrão de polimorfismo.padrão de polimorfismo.
 Para reconhecer os locos (sítios) onde ocorrem essas mutações, Para reconhecer os locos (sítios) onde ocorrem essas mutações, 
há diferentes técnicashá diferentes técnicas..
marcadores
cromossoma
 
1. Mutações pontuais - SNPs
A. ATCTCGTGATTCCTAGTCGTA
TAGAGCACTAAGGGATCAGCAT ex. Sítio EcoRI
B. ATCTCGTGATTATAGTCGTA
TAGAGCACTAATATCAGCAT
2. Pequenas deleções e/ou inserções - InDels
A. ATCTCGTCTAGTCGTA
TAGAGCAGATCAGCAT
B. ATCTCGT---GTCGTA
TAGAGCA---CAGCAT
Origem do Polimorfismo MolecularOrigem do Polimorfismo Molecular
 
Classificação de Marcadores Classificação de Marcadores 
MolecularesMoleculares
 
 Marcadores de DNA (moleculares)Marcadores de DNA (moleculares)
Vantagens:
- Não é objeto de influências ambientais;
- Potencialmente ilimitado em número;
Desvantagem:
Maior desvantagem é a necessidade de técnicas 
e equipamentos mais complexos.
 
Marcadores moleculares
• Hibridação
– RFLP – (Restriction Fragment Length Polymorphism)
– Minissatélites – VNTR –(Variable Number of Tandem Repeats)
• Amplificação de DNA (Técnica de PCR)
– RAPD – (Random Amplified Polymorphic DNA)
– SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions)
– Microssatélites –SSR (Simple Sequence Repeats)
– AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
- SNPs (Single Nucleotide Polymorphism)Single Nucleotide Polymorphism)
 
RFLPRFLP - Restriction Fragment Length - Restriction Fragment Length 
PolymorphismPolymorphism
 RFLP examina diferença em tamanho de RFLP examina diferença em tamanho de 
fragmentos de restrição de DNA fragmentos de restrição de DNA 
específicosespecíficos
 Polimorfismo deriva de mutação pontual, Polimorfismo deriva de mutação pontual, 
inserção, deleção inserção, deleção 
 Utiliza-se DNA celular totalUtiliza-se DNA celular total
 Requer DNA puro de alto peso molecularRequer DNA puro de alto peso molecular
 
• Polimorfismo evidenciado pela fragmentação do DNA com Polimorfismo evidenciado pela fragmentação do DNA com 
enzimas de restrição e observado pela hibridização de sondas enzimas de restrição e observado pela hibridização de sondas 
marcadas de DNA (Southern blots) com radioatividade ou marcadas de DNA (Southern blots) com radioatividade ou 
compostos que desencadeiam uma reação luminescência.compostos que desencadeiam uma reação luminescência.
• Para que o polimorfismo seja detectado, é necessário que as Para que o polimorfismo seja detectado, é necessário que as 
seqüências de nucleotídeos nas fitas de DNA de dois ou mais seqüências de nucleotídeos nas fitas de DNA de dois ou mais 
indivíduos comparados sejam distintas.indivíduos comparados sejam distintas.
 
Metodologia de RFLPMetodologia de RFLP
1 . Digerir DNA emfragmentos pequenos1 . Digerir DNA em fragmentos pequenos
2. Separação dos fragmentos por gel 2. Separação dos fragmentos por gel 
eletroforeseeletroforese
3. Transferência de fragmentos de DNA para 3. Transferência de fragmentos de DNA para 
filtrofiltro
 
Metodologia de RFLPMetodologia de RFLP
4. Visualização dos fragmentos de DNA4. Visualização dos fragmentos de DNA
 sondas marcadas (sondas marcadas (3232P) ou a frioP) ou a frio
5. Análise dos resultados5. Análise dos resultados
 bandas analisadas para alelos e/ou bandas analisadas para alelos e/ou 
presença/ausênciapresença/ausência
 diferenças em padrão de bandas reflete diferenças em padrão de bandas reflete 
diferenças genéticasdiferenças genéticas
A escolha de sonda/enzima de restrição A escolha de sonda/enzima de restrição 
é crucialé crucial
 
digestão
1
1
52
3
4
2
5
4
3
DNA
Digestão de DNA Genômico e Digestão de DNA Genômico e 
Separação em GelSeparação em Gel
Separação
em gel
 
Eletroforese
 
Transferência para Membrana de Transferência para Membrana de 
Nylon ou NitroceluloseNylon ou Nitrocelulose
1
2
3
4
5
 
MARCAÇÃO DA SONDA 
(EX.: MATERIAL RADIOATIVO – [32P] γATP,[32P] αdNTP)
 
Hibridização com sondas radioativas Hibridização com sondas radioativas 
em Nylon ou Nitroceluloseem Nylon ou Nitrocelulose
 
Hibridização com sonda marcada Exposição em filme de Raios-X
 
Aplicação dos RFLPs na medicina forenseAplicação dos RFLPs na medicina forense
 
Interpretação de resultados
1
2
3
4
5
6
1 2 3 4 5 6
Sítio alvo para sonda
Sítio de restrição
Inserção
 
Marcador RFLP na anemia falciforme
 
13
8
2
5
6
Análise de Diversidade e Filogenia Análise de Diversidade e Filogenia 
por RFLPpor RFLP
13 5 6 2 8
11
9
A B C
4
A B C
 Kb
 
 Utiliza um único primer ao invés de um par de primers.Utiliza um único primer ao invés de um par de primers.
 O primer único tem seqüência arbitrária, e portanto sua seqüência O primer único tem seqüência arbitrária, e portanto sua seqüência 
alvo é desconhecida.alvo é desconhecida.
 Uma característica fundamental dos marcadores RAPD é o fato Uma característica fundamental dos marcadores RAPD é o fato 
deles se comportarem como marcadores dominantes. Dominância deles se comportarem como marcadores dominantes. Dominância 
do ponto de vista da interpretação relativa entre genótipo e do ponto de vista da interpretação relativa entre genótipo e 
fenótipo de um indivíduo. fenótipo de um indivíduo. 
 Embora a grande maioria dos marcadores RAPD possuam Embora a grande maioria dos marcadores RAPD possuam 
comportamento "dominante", existe a possibilidade de se comportamento "dominante", existe a possibilidade de se 
amplificar marcadores co-dominantes , ou seja, amplificar ambos amplificar marcadores co-dominantes , ou seja, amplificar ambos 
os alelos de um loco. os alelos de um loco. 
RAPD - Random Polymorphic DNARAPD - Random Polymorphic DNA
 Amplificação Randômica de DNA Polimórfico Amplificação Randômica de DNA Polimórfico
 
 Obtenção de "fingerprinters' (impressões digitais) Obtenção de "fingerprinters' (impressões digitais) 
genômicos de indivíduos, variedades e populações.genômicos de indivíduos, variedades e populações.
 Análise estrutural e diversidade genética em populações Análise estrutural e diversidade genética em populações 
de melhoramento e bancos de germoplasma.de melhoramento e bancos de germoplasma.
 Estabelecimento de relacionamentos filogenéticos entre Estabelecimento de relacionamentos filogenéticos entre 
diferentes espécies.diferentes espécies.
 Construção de mapas genéticos de alta cobertura Construção de mapas genéticos de alta cobertura 
genômica e a localização de genes de interesse genômica e a localização de genes de interesse 
econômico.econômico.
Características do RAPD:Características do RAPD:
 
Base genética dos marcadores RAPDBase genética dos marcadores RAPD
 
RAPD inter-específico de RAPD inter-específico de EimeriaEimeria
600 pb -
J-20J-20
- e
sc
ad
a 
10
0 
pb
 
- E
. a
ce
rv
ul
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- E
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- E
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ne
tti
- E
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at
ri
x
- C
on
rr
ol
e
 
VNTR - Variable Number of Tandem RepeatsVNTR - Variable Number of Tandem Repeats
Número variável de repetições seriadasNúmero variável de repetições seriadas
Características do VNTR:Características do VNTR:
• Seqüências repetitivas agrupadas ou espalhadas ao longo do Seqüências repetitivas agrupadas ou espalhadas ao longo do 
genoma.genoma.
• São constituídas por blocos cujo número de unidades São constituídas por blocos cujo número de unidades 
repetitivas é variável, gerando polimorfismos. repetitivas é variável, gerando polimorfismos. 
• Blocos de unidades repetitivas formadas por 1 a 4 pb no Blocos de unidades repetitivas formadas por 1 a 4 pb no locuslocus 
hipervariável são conhecidas como hipervariável são conhecidas como microssatélitesmicrossatélites. Unidades . Unidades 
de 5 a cerca de 100 pb são denominadas de 5 a cerca de 100 pb são denominadas minissatélitesminissatélites..
 
• São observados através de digestões do DNA genômico São observados através de digestões do DNA genômico 
seguidas de ensaios de Southern blot com sondas homólogas às seguidas de ensaios de Southern blot com sondas homólogas às 
regiões do minissatélite.regiões do minissatélite.
• Obtém-se um padrão de múltiplas bandas devido ao caráter Obtém-se um padrão de múltiplas bandas devido ao caráter 
multilocus.multilocus.
• Os padrões de múltiplas bandas constituem os chamados “DNA Os padrões de múltiplas bandas constituem os chamados “DNA 
fingerprints” e permitem discriminar indivíduos e estabelecer fingerprints” e permitem discriminar indivíduos e estabelecer 
graus de parentesco e consangüinidade.graus de parentesco e consangüinidade.
Características do VNTR:Características do VNTR:
 
Características do VNTR:Características do VNTR:
• São obtidos através de PCR de São obtidos através de PCR de lociloci específicos. específicos.
• Cada "ilha" microssatélite, independente do elemento repetido Cada "ilha" microssatélite, independente do elemento repetido 
(CA, TG, ATG etc.) constitui um loco genético altamente variável, (CA, TG, ATG etc.) constitui um loco genético altamente variável, 
multialélico, de grande conteúdo informativo.multialélico, de grande conteúdo informativo.
• A análise de vários A análise de vários loci loci permite estabelecer relações de permite estabelecer relações de 
paternidade e identificação personalizada, através dos alelos paternidade e identificação personalizada, através dos alelos 
encontrados nos indivíduos.encontrados nos indivíduos.
• Não requerem Southern blots. A análise consiste no PCR de Não requerem Southern blots. A análise consiste no PCR de 
vários vários lociloci, eletroforese em gel e interpretação., eletroforese em gel e interpretação.
 
 
Vantagens e limitações dos marcadores microssatélites
• A expressão co-dominante e o multialeslismo, os marcadores 
SSR (seqüências simples repetidas = microssatélites) são os que 
possuem o mais elevado conteúdo de informações de 
polimorfismo na terminologia de marcadores moleculares.
• Os SSR são muito mais freqüentes e distribuídos ao acaso, 
permitindo a mais completa cobertura de qualquer genoma 
eucarioto.
• A maior limitação da tecnologia microssatélite é a grande 
quantidade de trabalho necessário para o desenvolvimento 
prévio dos marcadores.ModelosModelos
Eletroforese em gelEletroforese em gel
Análise de casos molecularesAnálise de casos moleculares
SemináriosSeminários
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