Microbiologia Geral - VÍRUS

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VÍRUS
BACTERIÓFAGOS
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Características Gerais dos Vírus
ACELULARES
PARASITAS INTRACELULARES OBRIGATÓRIOS;
. NÃO POSSUEM METABOLISMO PRÓPRIO;
. MATERIAL GENÉTICO PODE SER DNA OU RNA;
. PRODUZEM O RNAm. RNAr (RIBOSSÔMICO) E RNAt (TRANSPORTADOR), SÃO DA CÉLULA HOSPEDEIRA. 
FILTRÁVEIS
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AGENTES INFECCIOSOS
 Relacionada a receptores específicos na superfície celular do hospedeiro; 
Homem
Animais
Plantas
Micro-organismos
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ESTRUTURA VIRAL
Virion = partícula viral completa
O ácido nucléico é envolvido por uma cobertura protéica denominada capsídeo
O capsídeo é formado por subunidades protéicas denominadas capsômeros.
Em alguns vírus, o capsídeo é coberto por um envelope.
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Estrutura típica de um vírus 
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Capsídeo
Proteínas codificadas pelo genoma viral (protômeros);
Proteção e rigidez;
Simetria: 
Icosaédrica Helicoidal Complexa
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Vírus Icosaédricos
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Vírus Helicoidais
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Vírus Complexos
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Envelope viral
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CLASSIFICAÇÃO
Segundo o hospedeiro
vertebrados
invertebrados
plantas
bactérias (Bacteriófagos)
fungos (Micovírus)
Segundo o tipo de ácido nucléico
DNA
RNA
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CLASSIFICAÇÃO
Presença ou ausência de envoltório:
-envelopados
-não envelopados
Estrutura e simetria do capsídeo (icosaédrica, helicoidal, complexa)
Composição química
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Vírus complexos
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Em relação a reprodução dos vírus, podemos dizer que eles podem realizar um ciclo lítico ou um ciclo lisogênico. 
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Replicação viral – ciclo lítico
Adsorção;
Penetração;
Indução;
Replicação;
Maturação;
Liberação.
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TEMPO DE RUPTURA (duração de um ciclo completo) – tempo decorrido desde a adsorção até a liberação do fago (20 a 60 min para muitos bacteriófagos e 8-40 h para células animais).
TAMANHO DA POPULAÇÃO LIBERADA – número de novas partículas virais liberadas de uma única célula (usualmente 50 a 200
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CICLO LISOGÊNICO
Não ocorre a ruptura da célula;
Alguns fagos podem realizar ambos os ciclos, alternadamente (fagos temperados);
O fago incorpora seu DNA ao genoma do hospedeiro (profago);
O fago permanece latente – LISOGENIA;
As células bacterianas passam a ser denominadas de células lisogênicas e tornam-se imunes à reinfecção pelo mesmo fago.
Transdução especializada.
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Figura 2. Ultra estrutura e esquema representativo aproximado, respectivamente, dos bacteriófagos isolados.
Figura 2. Ultra estrutura e esquema representativo aproximado, respectivamente, dos bacteriófagos isolados.
Figura 2. Ultra estrutura e esquema representativo aproximado, respectivamente, dos bacteriófagos isolados.
Figura 2. Ultra estrutura e esquema representativo aproximado, respectivamente, dos bacteriófagos isolados.
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O CULTIVO DE BACTERIÓFAGOS EM LABORATÓRIO
Os bacteriófagos podem crescer em culturas bacterianas em meio líquido ou em meio sólido;
MÉTODO DE PLACA (ou ENSAIO DE FORMAÇÃO DE PLACAS DE LISE) para a detecção e contagem das placas virais ou placas de lise;
O método se baseia no ciclo lítico dos bacteriófagos;
Formação de placas virais na superfície do meio, indicando a lise celular;
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Cada placa corresponde, teoricamente, a uma única partícula viral da suspensão original. Logo, a concentração das suspensões virais, medida pelo número de placas formadas, é dada em unidades formadoras de placas (pfu). 
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Lisogenia
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 O uso de fagos é de grande interesse para o controle de infecções bacterianas, e tem se expandido muito no ramo da medicina, agricultura, aquicultura e indústria de alimentos.
Esses fagos também representam alternativas viáveis, de baixo custo, não tóxicos ao meio ambiente, para uso como ferramentas de controle biológico no tratamento de efluentes. 
 
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OBJETIVO
Geral
 Isolar fagos com potencial para ser utilizados como agentes complementares no tratamento de efluentes
Específicos
Isolar populações de bacteriófagos, enumerar estas populações virais e determinar a viabilidade de fagos fora da célula hospedeira, a partir de amostras coletadas na Estação de Tratamento de Esgotos (ETE) do Campus do Pici.
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Material e Métodos
Isolamento de bacteriófagos.
 Coleta de Amostras da Estação de Tratamento de Esgotos (ETE) do Campus do Pici.
Filtração com papel de filtro
 Filtração em membranas Millipore (0.45µm, USA)
 O filtrado, supostamente contendo fagos foi conservado sob condições assépticas, em refrigerador regulado a 8-10° C
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Enumeração de bacteriófagos pelo método da placa viral.
 Foi usada a técnica de cultura em dupla camada. Uma alíquota de 100 µL do filtrado foi adicionado a 200 µL de uma cultura de Escherichia coli em fase exponencial de crescimento (24 horas, 35°C). 
 Essa mistura de fagos-bactérias foi vertida em um tubo de ensaio contendo 5 mL de Agar Nutritivo semi-sólido (0,75%). Esse material foi agitado em vórtex durante 30 segundos e derramado na superfície de uma camada de 4 mm de Agar Base (Agar Nutritivo 1,5%) (SPILKI et al., 2004)
 Quando o ágar semi-sólido solidifica, os fagos têm sua motilidade comprometida, infectando somente as bactérias que lhe são adjacentes. 
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 Os fagos se reproduzem lisando as células do hospedeiro formando zonas claras, ou placas fágicas na zona de crescimento bacteriano. 
 Uma vez que cada partícula viral irá formar somente uma placa fágica, a contagem do número de placas indicará a concentração inicial de fagos na amostra original. 
 A viabilidade dos bacteriófagos fora das células hospedeiras foi avaliada a cada 15 dias, usando a mesma metodologia, durante aproximadamente 60 dias.
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Especificidade viral
A especificidade dos bacteriófagos foi testada usando a mesma metodologia frente as seguintes cepas de Enterobactérias do Laboratório de Microbiologia Ambiental do Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará: Escherichia coli (A), Serratia marcescens (B), Proteus mirabilis (C), Salmonella enteritidis ATCC 2438 (D), S. thiphinurium ATCC 846 (E), Enterobacter aerogenes ATCC 13048 (F) e Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 (G).
Manutenção dos bacteriófagos
A cultura viável de bacteriófago para E. coli foi mantida por incubação de uma alíquota de 50 mL da suspensão de bacteriófagos em 3 mL de uma cultura da bactéria em fase exponencial de crescimento em Caldo Nutritivo a 8-10°C.
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RESULTADOS
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O monitoramento da viabilidade do fago específico para E. coli em meio livre de células mostrou que houve uma redução de 1/3 da população viral inicial após 30 dias. Com 45 dias a população deste fago estava praticamente extinta (Figura 2).
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 Foi possível isolar e quantificar populações de quatro bacteriófagos a partir de amostras de águas residuais da ETE- PICI-UFC. 
 Dentre os quatro tipos de fagos isolados, três se mostraram potencialmente eficazes contra as bactérias Escherichia coli, Salmonella thiphinurium e Proteus mirabilis.
 Os resultados indicaram que a suspensão viral pode ser mantida sob refrigeração por períodos de estocagem de até 30 dias, sem riscos de perder a sua capacidade infectante
 Esses fagos representam alternativas viáveis, de baixo custo, não tóxicos ao meio ambiente, para uso como ferramentas de controle biológico em Estações de Tratamento de Esgotos (ETE).
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Conclusões
 O isolamento de fagos específicos pode ser realizado a partir de fagos presentes em águas residuais de estações de tratamento de esgotos
A partir destes isolados é possível a obtenção de fagos líticos de maneira
prática, rápida e de baixo custo.
Os fagos líticos podem ser ferramentas promissoras como agentes complementares aos métodos já existentes para reduzir o número de bactérias patogênicas numa estação de tratamento. 
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Figure: Figure 09-03
Caption:
Comparison of naked and enveloped virus, two basic types of virus particles. 
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