Relatório - Bactéria competente

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Ana Paula Cardoso							4º Ano (Noturno)
Biologia Molecular – Relatório
TEMA: Preparo de bactéria competente
OBJETIVO: Tornar bactérias (linhagem de E. coli DH5 α) aptas para viabilizar a introdução do DNA recombinado por meio de choque térmico, o qual induz formação de poros na parede das bactérias e facilita entrada de DNA.
PROCEDIMENTOS: Inicialmente foi realizado um pré-inóculo em 5mL de Luria-Bertani, incubação a 37ºC por 16-18h, sob agitação (200rpm). Após crescimento das bactérias, diluiu-se em 15mL de LB as bactérias em fase de crescimento exponencial (ideal).
Antes de iniciar o procedimento de transformação, as células foram submetidas ao repouso por 5 min em banho de gelo a fim de interromper o metabolismo das mesmas. O processo de transformação ocorreu através de choque térmico (quimiocompetente), por incubação em solução fria de cloreto de cálcio, a que se segue um choque térmico de curta duração, por 3 vezes repetindo centrifugação por 5 min, a 1600xg a 4ºC, posteriormente retirando sobrenadante e adicionando solução fria de CaCl2- com glicerol (utilizado para evitar formação de cristas de água no meio). Por fim, a alíquota de 200µL é transferida para microtubos.
RESULTADOS: Cálculo da verificação da eficiência de transformação. É necessário contar o número de colônias transformantes e estimar a eficiência de transformação (número de colônias por micrograma de DNA utilizado na transformação). A cada micrograma de DNA deve-se ter, no mínimo, 1x106 unidades formadoras de colônia.
Foram contadas 176 colônias e 10ng/µL do plasmídeo pUC 18.
Segue o raciocínio para obter o valor da concentração de DNA em µg:
1ng ______1000µL
X ___________10µL
X = 0,1ng
1µg ______ 103
X _________ 0,1ng
X = = 10-4
Foram contadas 176 colônias, portanto: = 1,76.106. Este resultado confirma que a bactéria está apta para receber o DNA recombinado.