FIM VACINA

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Relatório de aula prática vacina: Desenvolvendo uma vacina contra o Schistosoma mansoni :
A Esquistossomose Mansoni é uma doença parasitária que atinge a América do Sul , no Brasil até o ano de 2014 estimava-se que 1,5 milhões de pessoas viviam em áreas propicias a disseminação e risco de contrair a parasitose. As regiões que apresentam os maiores índices da doença são as localidades que não possuem saneamento básico de qualidade, haja visto que o parasita trematódeo Schistosoma mansoni é disseminado através de excretas humanas e presença de moluscos, que transmitem o parasita por fazerem parte do ciclo do verme. Dessa forma a doença é classificada como endêmica e atinge todas as regiões do país com maior expressão no Norte e Nordeste (BRASIL. Ministério da Saúde).
A Esquistossomose é uma doença crônica cujo ciclo de vida depende dos diferentes hospedeiros e formas do agente patológico. Nisso os ovos são eliminados por humanos ou animais ,em locais com água como rios e seus afluentes ou tanques , nesse ambiente serão liberados os miracídios que penetram em caramujo de água doce pertencentes ao gênero Biomphalaria. No interior desses caramujos há a evolução para o estágio de larva denominada de esporocito, esses originaram cercárias que são liberadas na água , essa forma de vida possui cauda em forma de forquilha ,esse estágio do parasita é a forma infectante do ser humano. As cercárias ao penetrar na pele perdem a cauda e disseminam-se pela corrente sanguínea na forma de esquistossômulos, esses migram posteriormente para o pulmão e mais tarde para o fígado, essa forma desenvolve-se e há acasalamento dos vermes no interior do corpo, logo deposita-se ovos no vasos sanguíneos , forma-se o embrião miracídio que fica no interior de ovo e produz substâncias que permite a passagem desse para o intestino. Os ovos podem ainda fica retido no fígado, parede intestinal e bexiga causando inflamação granulamentosas (PARSLOW.et, al .2015).Os sintomas da patologia diferem de acordo com a gravidade e estágio da doença podendo haver dermatite , edema , eritema ,anorexia, desnutrição ,dor abdominal febre e vômito hepatoesplenomegalia, isto é, o fígado e o baço aumentam de tamanho , além de outros órgãos (PODEUS.et,al.2008).
Devido os sintomas da doença e um quadro de morte desencadeado quando não há o tratamento faz-se necessário o diagnóstico precoce e o tratamento .Para isso deve-se levar em conta o histórico do paciente em relação aos sintomas ou passagem por áreas de alta incidência da doença além da utilização de exames laboratoriais e complementares como hemograma e parasitológico de fezes , utiliza-se ainda ELISA de captura ,ultrassonografia e biopsia de tecidos acometidos na maioria dos casos da infecção. Diante do diagnósticos positivos o tratamento indicado , na maioria dos casos, é o Oxamniquine® ou Praziquantel® em dose única, via oral. Esses fármacos costumam ter eficácia de 80% em adultos e 70% em crianças ate 15 anos de idade (PODEUS.et,al.2008).
Perante o severo quadro clínico da Esquistossomose e da alta incidência da doença no Brasil é de suma importância estratégias que controlem , amenizem e eliminem esse problema de saúde publica. Dessa forma uma das melhores alternativas a se desenvolver é a produção de uma vacina que possibilite a imunização e consequentemente prevenção com a diminuição da incidência desse problema no território brasileiro como um todo.
Nesse contexto para o desenvolvimento da vacina é necessário conhecer os mecanismos por trás da produção e desenvolvimento da mesma para se ter eficiência. Nisso é importante discutir o papel principal dos adjuvantes nesse processo de produção de vacinas. O adjuvante é uma substancia administrada com o imunógeno , e induz o processo inflamatório local e possibilita a liberação lenta do antígeno em um maior espaço de tempo, portanto, aumenta a resposta imune ao antígeno( VAZ.et,al.2014).
Diante da função primordial na estimulação da defesa imune realizado pelo o adjuvante é essencial a escolha correta e mais adequada desse para obter uma boa vacina. Dessa forma o ideal é um adjuvante que promova concentração do antígeno no local correto da inoculação e aumente a presença do imunógeno por um tempo adequado , a fim de obter resposta satisfatória. Ao buscar esses princípios as vacinas humanas são desenvolvidas com sais insolúveis como sais de alumínio (fosfato ou hidróxido) e fosfato de cálcio, haja vista que esses formam micropartículas que facilitam indução de inflamação e as menores podem ser fagocitadas , assim há o processamento das moléculas (VAZ.et,al.2014).No caso da esquistossomose será utilizado o hidróxido de alumínio pois esses estimulam , preferencialmente, respostas do perfil Th2 , logo é o adjuvante mais adequado (BERGQUIST.et,al.2005). Isso levara principalmente a produção de IgE e ativação de eosinófilos como também elevada concentração de IL-13 ,IL-5 e IL4. (ABBAS.et,al.2015).
 Nesse cenário devido a utilização de um adjuvante insolúvel, deve-se escolher corretamente o local para administrar a vacina. Nesse contexto o mecanismo de ação do adjuvante é de deposito insolubilizando a solução administra, por isso não deve ser utilizada na via endovenosa .Dessa forma a via correta de administração é a injetável intramuscular pois nela os processos anteriormente descritos serão mais eficientes (VAZ.et,al.2014). Nisso a aplicação deve ser preferencialmente na via intramuscular profunda sendo a porção anterolateral da parte superior da coxa o melhor local . (PARSLOW.et, al .2015) .
Diante da utilização do adjuvante os antígenos dessa vacina são de origem protéica. O critério da escolha deve-se a estimulação mais eficiente realizada por proteínas no papel de induzir resposta imune adaptativa mais desenvolvida e eficiente. Esse mecanismo ocorre devido a capacidade que as proteínas possuem de se ligar as células T através dos Complexos de Histocompatibilidade Principal . Nesse contexto há a estimulação de respostas humorais como também contribuem para a formação de memória imune (MURPHY, K . 2014).
Nesse contexto a vacina devera estimular a resposta inata, humoral e celular, pois essas são dependentes umas das outras para melhor eficácia no combate a infecções . Para isso inicialmente deve estimular a imunidade inata com ativação e recrutamento de fagócitos como neutrófilos ,principalmente, para secreção de substâncias microbicidas. Soma-se a isso o papel da partícula proteica que ativa as células dendríticas a realizarem apresentação do peptídeo através do Complexo de Histocompatibilidade Principal do tipo II (MHC-II) esse ira sinalizar para linfócitos T CD4+ , e esses induzirão ao perfil Th2 . Nesse contexto Th2 ira mediar reações com IgE , mastócitos e eosinófilos , isso será feito através da IL-4 que estimula produção de IgE ( se ligara a eosinófilos e mastócitos ) e IL-5 que estimula o desenvolvimento de eosinófilo e os ativa. Nessa perspectiva IgE liga-se ao patógeno e a eosinófilos, levando esses a secretar conteúdos microbicidas . Concomitantemente a ativação de B também induzira a produção do anticorpo de IgE (ABBAS.et,al.2015).
Nesse cenário a vacina eficiente deve induzir a maturação de afinidade e formar células B de memória o que ocorre quando há ativação de células T auxiliares. A ativação que leva a esse processo inicia-se com a partícula administrada juntamente com o adjuvante. Essas ações são melhores induzidas pela reação no centro germinativo, haja vista o importante papel exercido pelas células T CD4 + especificas para antígenos proteicos (ABBAS.et,al.2015).
Para o desenvolvimento dessa vacina foi escolhido uma proteína do Schistosoma mansoni , essa escolha contou com o auxílio de ferramentas ligadas a bioinformática. Para isso foi essencial a utilização de sites como o PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/) , IEDB ( Immune Epitope Database and Analysis Resourse / http://www.iedb.org/) , Expansy (https://www.expasy.org/) e I-TASSER (https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/).
Nesse sentido a parte inicial da pesquisa foi realizada com PubMed. Nessa plataforma delimitou-se o filtro para proteína e ao digita-se o nome do Schistosoma mansoni apareceu diversas proteínas relacionadas ao parasita. Diante da variedade escolheu-se a proteína “putative surface protein PspC [Schistosoma mansoni]” que possui epitopos com sequências de aminoácidos possíveis para o desenvolvimento da vacina entre os 582 que compõem a proteína. Posteriormente esses aminoácidos passaram por testes no site do IEDB que confirmaram a viabilidade da sequência. Vale salientar que para as etapas seguintes do desenvolvimento da vacina o PubMed forneceu um sequência FASTA da composição da proteína, esse código foi importantes para as etapas que serão citadas ao longo desse trabalho. Dessa forma a sequência fornecida foi : 
MFRPHGGRPRNKIDRNIHVSRSDSISGRCEYNVENNSVNHYNERQCNEENSRRYSYLATD
PITHSLPETKLVRSQSVRHYKEAWATHDPIGYMHRTSTSYKTDKVRGMKHFPCNKNSDDP
VTHRLSIDHHRQQHRPQLTYTASKSRFNTLRANTNPITHQQKNISSDQSPIELNDETSTI
GDFNEVTIGNVSAVPENRKLRRALRNPITGEGMCDSDYIDLLKLPSEYYFRRNRDTLSST
LNIHPHSPPVQPSSTTTPSTNTAVSVKKVPAQKDANSTSKPTASKPRHQTPPPPSQPTLT
QQPPKLEPKVEKSTPQPIEKKVIRPKKPEMLTEKQPVKENKQPVGSVTQSQPITETQLST
KEAEPQTPKMVAEPQTLETEKQKTPKEVAKPQTPKTEKPEAPKETVKLQTPETGEPQTPK
GATNPQKLEAEIPQAPKEVAKPQTPKTEELKMPKEIVIPETSGKTAELHTPVETPITPAS
HTLEESTAETKSAGKPVPQSLSEELELAIGESKSPQPPTSSSNNKIRDGMSEDLHSPAVQ
SPPTSEANSFVDNKMSRLSDAQTLKNDLTPRPSTELPETGEA
Figura 1 :Sequência FASTA.
Nesse contexto, após a escolha da proteína o próximo passo foi determinar as sequências compatíveis para antigenicidade , acessibilidade ,MHC-I e MHC-II no site IEDB. Isso foi realizado através das ferramentas B Cell Epitope Prediction e depois escolheu-se Kolaskar & Tongaonkar Antigenicity e Emini Surface Accessibility Prediction , através dessas analises foi possível ver que o epitopo é eficiente para a resposta humoral, essa conclusão partiu da observação das tabelas e gráficos gerados pelo o programa ,nessa visualização o desenvolvimento da vacina será mais eficiente dos aminoácidos 289 a 295 por serem igualmente antigênicos e acessíveis , a seguir serão expostos os gráficos e os significados que expressam essa conclusão . Além disso para conferir os MHCs a ferramenta utilizada foi MHC I Binding e MHC II Binding todavia o resultado não foi satisfatório para nenhum dos tipos , entretanto isso será discutido a seguir diante das tabelas geradas que concluem essas constatações.
Nesse contexto os gráficos e tabelas abaixo indicam as regiões de igualdade entre a acessibilidade e a antigenicidade. Nisso as regiões amarelas nos gráficos indicam imunogenicidade e em verde as regiões não imunogênicas e as tabelas possuem os valores que reforçam os resultados gráficos. Vale salientar que as tabelas expressas aqui irão mostrar apenas as regiões compatíveis para o desenvolvimento da vacina. No processo os escores para antigenicidade e acessibilidade foram respectivamente nos valores de 1.003 e 1.000 , valores superiores ao cut-off dessas propriedades. Os gráficos e tabelas seguem inferiormente:
Figura 2 : Gráfico de Antigenicidade .
Figura 3 : Gráfico Acessibilidade.
Figura 4 :Antigenicidade e Acessibilidade. 
Após essas analises foram realizadas as observações referentes aos Complexos Principais de Histocompatibilidade . Nesse sentido utilizou-se o alelo HLA-A*02:01 para o MHC-I e o alelos DPB1*01:01 para o MHC-II. Nisso verificou se poderia haver estimulação de resposta celular a partir da observação da mesma sequência que ira estimular a resposta humoral .Para tanto deve-se observar os valores do IC-50 , todavia concluiu-se que não haverá MHC de nenhum tipo para esses aminoácidos pois o programa não calculou esse parâmetro de avaliação nos dados da tabela que foi gerada para o MHC-I na sequência de aminoácidos que vão de 289 a 295 que seriam analisados, além disso na tabela do MHC-II ,esses aminoácidos obtiveram IC-50 elevados ,valor esse que deveria ser 50 para gerar resposta , esses dados segue abaixo:
Figura 5: MHC-II e seu IC-50.
Posteriormente foi utilizado o site https://swissmodel.expasy.org/interactive para modelagem da proteína analisada. Nisso a sequência FASTA foi digitada na target sequence, ao gera o modelo foi realizado o download do mesmo .Após isso essa modelo foi direcionado ao programa PyMOL, para modelagem tridimensional e marcação do epitopo. Entretanto a proteína gerada não apresentou a sequência de aminoácidos 289 a 295 , o que significa que houve erro no Expasy no momento de forma o modelo . Diante disso foi necessário utilizar outra ferramenta que foi o site o I-TASSER para uma modelagem mais eficiente , nesse site (https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/) ao abri-se a página aparece um único quadrado superior para digitar sequência FASTA na parte inferior ha três triângulos onde o primeiro é para o email institucional, o segundo para senha e o terceiro (ID) para o nome da proteína mais inferiormente foi desativado o quadrado de Keep my results public e clicou-se em Run I-TASSER .Nesse contexto após 48 horas o site enviou o modelo correto da proteína e esse foi trabalhado novamente no PyMOL.
Nesse cenário para a modelagem foi encaminhada para o PyMOL. Nesse programa selecionou-se a cor vermelha para colorir e homogeneizar a proteína , colocando-a na forma de surfase. Posteriormente selecionou-se o epitopo 289 a 295 e esse foi corado com a cor verde para destacar a região. Dessa forma foi concluído que essa sequência é uma região acessível ou imunogênica na superfície da molécula . Isso estar expresso nas figuras 6 e 7 a seguir :
Figura 6: Putative surface protein PspC [Schistosoma mansoni] no modo surface.
Figura 7: Putative surface protein PspC [Schistosoma mansoni] modo cartoon.
Diante do exposto para o desenvolvimento da vacina contra Schistosoma mansoni foi possível entender que a putative surface protein PspC [Schistosoma mansoni] não é viável para o desenvolvimento da vacina. Isso deve-se a característica dos MHCs que não serão estimulados por essa molécula ,nesse contexto não ocorrera formação dos plasmócitos de vida longa e não ocorrera a estimulação para o perfil de Th2 que um importante linfócito para a resposta a proteína do parasita causador da patologia. Vale salientar que mesmo estimulando a formação de anticorpos a vacina não terá a eficiência adequada para desencadear uma imunidade competente e duradoura (ABBAS.et,al.2015) .Desse modo os resultados que seriam obtidos com a fabricação dessa vacina com essa proteína não seriam vantajosos , logo não é viável produzi-la pois a isso é de elevado custo e não haveria boa aceitação populacional devido o ineficiente efeito de imunidade prolongada.
Referências:
BRASIL. Ministério da Saúde. Portal da Saúde , Esquistossomose.< http://portalsaude. saude.gov.br/index.php/oministerio/principal/secretarias/svs/esquistossomose> acessado em 15 de Setembro de 2017 as 18:00h.
PARSLOW, T.G; STITES, D.P; TERR, A. I ; JOHN,I.M.B.O.D.E.N. Imunologia Médica. 10. ed. Guanabara Koogan: Rio de Janeiro, 2015.
PODEUS,L.C; AGUIR,L.R; QUININO,L.M; CONSTANÇA,B.A.R.B.O.S.A. A ocorrência das formas aguda e crônica da esquistossomose mansônica no Brasil no período de 1997 a 2006: uma revisão de literatura. Epidemiologia e Serviço de Saúde. Brasília: 2008. 
VAZ,A.J.;TAKEI,K.;EDINEIA,B.U.E.N.O. Imunoensaios: fundamentos e aplicações. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2014.
BERGQUIS, R.N; LEONARDO, L.R; GRAHAM, M.I.T.C.H.E.L.L.Vaccine-linked chemotherapy : can schistosomiasis control benefit from an integrated approach?. TRENDS in Parasitology : 2005.
ABBA, A. K.; LICHTMAN,A.H.; PILLAI, S.H.I.V. Imunologia celular e molecular. 8. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2015.
MURPHY, K . Imunobiologia de Janeway. 8. ed. Porto Alegre: Artmed, 2014.