B cereus
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B cereus


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do manitol.
Cuidado: O MYP e o KG podem permitir o crescimento de B. anthracis, patogênico, com colônias 
indistinguíveis das colônias de B. cereus. Para prevenir riscos de contaminação do analista e do laboratório, 
recomenda-se: 1) que o manuseio das placas seja feito sobre bandejas e não diretamente sobre as bancadas, 2) 
que ao trabalhar em capela de fluxo laminar se utilize um modelo vertical, adequado ao manuseio de 
patógenos, 3) que se mantenha ao alcance das mãos um frasco de desinfetante como solução de cloro a 
100ppm ou solução de álcool iodado, para descontaminar qualquer descarga inadvertida de material 
contaminado, 4) que o descarte seja precedido da descontaminação em autoclave a 121oC/30min, 5) que toda 
a área de trabalho seja prontamente descontaminada, uma vez concluídas as análises.
c) Confirmação das colônias no Grupo B. cereus
Selecionar pelo menos cinco colônias típicas bem isoladas para a confirmação. Se houver menos de cinco 
colônias, selecionar todas.
Aplicar o teste confirmatório rápido de Holbrook & Anderson (descrito no item c.1). Havendo necessidade ou 
interesse em uma verificação mais rigorosa das características típicas do grupo, aplicar também as provas 
bioquímicas (descritas nos itens c.2 a c.6). Se as colônias obtidas no KG ou MYP forem bem típicas, o teste 
confirmatório rápido de Holbrook & Anderson pode ser substituído pelas provas bioquímicas.
c.1) Teste confirmatório rápido de Holbrook & Anderson (coloração de esporos e 
glóbulos de lípidios intracelulares). As colônias obtidas no KG podem ser submetidas ao teste 
confirmatório rápido diretamente da placa de contagem. As colônias obtidas no MYP devem ser repicadas em 
tubos com Ágar Nutriente (NA) inclinado e incubadas a 30oC/24h, antes da realização do teste. Procedimento:
3 Preparar um esfregaço da cultura, tomando o inóculo no centro da colônia, se a cultura estiver com 24h, 
ou na borda da colônia, se a cultura estiver com 48h. Deixar secar naturalmente e fixar na chama com o 
mínimo de calor. 
3 Cobrir o esfregaço com Solução Aquosa 5% de Verde Malaquita e corar a quente durante dois minutos. 
Para aquecer a solução de verde de malaquita, há três opções: 1) colocar a lâmina sobre um suporte 
vazado e o suporte sobre um banho ou frasco com água sob fervura, para aquecer com o vapor de água. 
2) colocar sob a lâmina um \u201cswab\u201d com álcool em chamas, até observar a saída de vapor (sem ferver). 3) 
passar a lâmina cuidadosamente na chama de um bico de Bunsen, até a emissão de vapor (sem ferver), 
pelo menos duas vezes, com intervalo de um minuto.
3 Após o tempo de contato de dois minutos, lavar a lâmina em água corrente, secar com lenço de papel 
(apenas encostar a lâmina no lenço de papel, sem esfregar) e cobrir com Solução de Sudan Black (0,3% 
peso/volume em etanol 70%) por 20min.
3 Descartar o excesso de corante, secar com lenço de papel e lavar a lâmina com xileno (PA), por cinco a 
dez segundos. Cuidado. O xileno é inflamável e os vapores são irritantes e depressores do sistema 
nervoso central, podendo provocar dor de cabeça, tontura, náusea, perda de consciência e outros 
sintomas. Manusear com luvas, em capela de exaustão. Não descartar o excedente na pia, manter na 
capela de exaustão até evaporar.
Nota) O Manual da Oxoid (2000), na descrição do meio Bacillus cereus Selective Agar Base (CM 617), recomenda substituir 
o xileno por Citroclear (H.D. Supplies, 44 Rabans Close, Rabans Lane Industrial Estate, Aylesbury, Buckinghamshire, 
England, HP19 3RS).
3 Secar imediatamente com com lenço de papel e cobrir com Solução de Safranina 0,5% por 20 segundos.
3 Lavar em água corrente, secar com lenço de papel e observar ao microscópio óptico com objetiva de 
imersão. Os membros do grupo B. cereus vão apresentar a) glóbulos de lipídios corados de azul escuro, 
dentro do citoplasma das células, b) esporos centrais a subterminais, sem dilatação do esporângio, 
corados de verde pálido, c) células vegetativas, coradas de vermelho.
c.2) Teste de utilização anaeróbia da glucose (opcional). Inocular uma alçada da cultura em um 
tubo de Caldo Vermelho de Fenol 1% glicose, previamente desaerado (fervura por 15 minutos em banho, com 
as tampas afrouxadas, seguida do imediato resfriamento em banho de gelo). Cobrir a superfície do caldo com 
óleo mineral ou vaselina líquida estéril e incubar a 35oC/24h. Alternativamente, em lugar de cobrir o meio 
com óleo ou vaselina, pode-se incubar os tubos em atmosfera anaeróbia, obtida por um dos métodos 
relacionados no Capítulo específico de Clostridium perfringens. Observar se há ocorrência de viragem ácida 
do indicador, alterando a cor do meio de vermelho para amarelo (teste positivo) ou se o meio permanece com 
a cor inalterada (teste negativo). As cepas de B. cereus utilizam a glucose anaerobicamente.
c.3) Teste de decomposição da tirosina (opcional). Estriar uma alçada da cultura na rampa de um 
tubo de Ágar Tirosina inclinado e incubar a 35oC/48-72h. Observar se há desenvolvimento de uma zona clara 
e transparente de decomposição e dissolução dos cristais de tirosina, na região abaixo da rampa (teste 
positivo), ou não formação dessa zona, mantendo o meio opaco inalterado (teste negativo). As cepas de B. 
cereus decompõem a tirosina rapidamente, formando uma zona de 3-4mm de profundidade em 48-72h. É 
também comum o escurecimento do meio ao longo da região de crescimento, com desenvolvimento de uma 
coloração castanha.
c.4) Teste de Voges-Proskauer (opcional). Inocular uma alçada com inóculo leve da cultura em um 
tubo de Caldo VP Modificado para Bacillus e incubar a 35oC/48h. Adicionar, para cada 1ml de cultura, 0,6ml 
de solução de \u3b1-naftol 5%, 0,2ml de solução de KOH 40% e uma pitada de cristais de creatina, na ordem 
indicada. Agitar vigorosamente, deixar descansar e observar periodicamente, por até uma hora, o 
desenvolvimento de uma cor vermelha no meio de cultura (teste positivo). A permanência do meio na cor 
amarelada dos reagentes indica teste negativo. As cepas de B. cereus são VP positivas.
c.5) Teste de redução do nitrato (opcional). Inocular uma alçada com inóculo pesado da cultura em 
um tubo com 3-4ml de Caldo Nitrato e incubar a 35oC/24h. Após a incubação, adicionar aos tubos 0,25ml de 
cada um dos reagentes para teste de nitrato (A = Solução 0,8% de ácido sulfanílico; B = Solução 0,5% de \u3b1-
naftol). Observar o desenvolvimento de uma cor rósea avermelhada em no máximo dez minutos (teste 
positivo). Em caso negativo, adicionar uma pitada de pó de zinco, deixar em repouso por dez minutos e 
observar se o meio permanece com a cor inalterada (teste positivo) ou adquire uma coloração rósea 
avermelhada (teste negativo). A maioria das cepas de B. cereus reduz o nitrato, sendo poucas as cepas 
negativas para essa característica.
c.6) Teste de resistência à lisozima (opcional). Inocular uma alçada da cultura em um tubo de 
Caldo Nutriente suplementado com 0,001% de lisozima, inoculando também um tubo de Caldo Nutriente não 
suplementado (controle). Incubar a 35oC/48h e observar se ocorre crescimento nos dois tubos (teste positivo) 
ou apenas no tubo controle (teste negativo). As cepas de B. cereus são resistentes à lisozima.
d) Diferenciação das espécies do Grupo B. cereus
Esses testes aplicam-se às culturas confirmadas como pertencentes ao Grupo B. cereus, para diferenciação das 
espécies dentro do Grupo.
d.1) Coloração de cristais de toxinas intracelulares (Método de Sharif & 
Alaeddinoglu, 1988). Inocular uma alçada da cultura na rampa de um tubo de Ágar Nutriente (NA) 
inclinado e incubar a 30oC/24h. Manter o tubo à temperatura ambiente por três dias, para envelhecer a cultura, 
permitir a formação de esporos e a lise dos esporângios. Preparar