B cereus
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B cereus


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um esfregaço da cultura, fixando levemente 
pelo calor. Cobrir o esfregaço por três minutos com uma Solução de Azul Brilhante de Coomassie (0,25g de 
azul brilhante de coomassie + 50ml de etanol absoluto + 7ml de ácido acético glacial + 43ml de água 
destilada). Lavar a lâmina em água corrente, aguardar secar e observar em microscópio óptico, sob imersão. 
As cepas de B. thuringiensis vão apresentar esporos livres não corados, células vegetativas (bastonetes) 
coradas de azul e cristais livres corados de azul intenso, tetragonais e bem menores do que as células 
vegetativas. No interior das células vegetativas (coradas de azul) os esporos e os cristais aparecem brancos. 
As cepas de B. cereus não produzem cristais.
Nota d.1) O procedimento descrito no Compendium é diferente, bem mais trabalhoso e utiliza metanol, tóxico, que deve ser 
manuseado com cuidado, evitando-se inalação ou contato com a pele (trabalhar com luvas e máscara protetora): Cultivar a 
cultura da mesma forma descrita acima e preparar o esfregaço. Cobrir o esfregaço com metanol por 30 segundos, descartar o 
excesso de álcool e flambar, para fixação definitiva. Cobrir em seguida o esfregaço com uma solução aquosa 0,5% de fucsina 
básica, aquecer delicadamente à chama, até a emissão de vapores, aguardar dois minutos e aquecer novamente até nova 
emissão de vapores. Aguardar 30 segundos, lavar a lâmina em água corrente, secar e observar ao microscópio óptico, sob 
imersão. As cepas de B. thuringiensis vão apresentar esporos livres e uma grande quantidade de cristais tetragonais corados de 
vermelho.
d.2) Teste de motilidade. Inocular a cultura em um tubo de Ágar Motilidade para B. cereus, por picada, 
no centro do meio e até a profundidade de 1cm do fundo do tubo. Incubar a 30oC/18-24h e observar se 
ocorreu migração das células para as regiões fora da linha de inoculação (motilidade positiva) ou se o 
crescimento restringiu-se à linha da picada (motilidade negativa). Opcionalmente, a característica de 
motilidade pode ser observada ao microscópio. Adicionar 0,2ml de água destilada estéril à rampa de um tubo 
de NA inclinado e estriar uma alçada da cultura na rampa umidificada. Incubar a 30oC/6-8h e transferir uma 
alçada da cultura, coletada do líquido na base da rampa, para uma gota de água destilada estéril depositada 
numa lâmina de vidro. Emulsionar o material, cobrir com uma lamínula e observar ao microscópio. As cepas 
de B. cereus e B. thuringiensis geralmente são ativamente móveis, enquanto as cepas de B. anthracis e B. 
mycoides são imóveis.
d.3) Verificação de crescimento rizóide. Depositar uma alçada da cultura no centro de uma placa de 
Ágar Nutriente (NA), sem espalhar. Incubar a 30oC/24-48h e observar se a colônia desenvolvida apresenta 
crescimento rizóide (a massa de células se estende para fora do ponto de inoculação, como raízes), 
característico das cepas de B. mycoides.
d.4) Verificação de atividade hemolítica. Inocular até seis culturas em uma placa de Ágar 
Tripticase de Soja suplementado com sangue de carneiro (TSA-Sangue), transferindo o inóculo para um único 
ponto do meio, por simples contato. Incubar a 30-32oC/24h e observar se há formação de um halo claro de 
hemólise em redor das colônias (teste positivo). As cepas de B. cereus são fortemente hemolíticas, produzindo 
halos grandes e bem nítidos, enquanto B. mycoides e B. thuringiensis são fracamente hemolíticos, produzindo 
halos menores ou, eventualmente, zona de hemólise restrita à região sob a colônia. As cepas de B. anthracis 
geralmente não são hemolíticas.
e) Cálculo dos resultados
Calcular o número de UFC/g ou ml em função do número de colônias típicas, diluição inoculada e 
percentagem de colônias confirmadas.
Exemplo: Diluição 10-1, plaqueamento em superfície, seis colônias típicas, seis submetidas à confirmação, 
três confirmadas (50%). UFC/g ou ml = 6x101x10x0,5 = 3,0x102.
11.3. MÉTODO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP)
Método da American Public Health Association (APHA), descrito no Capítulo 32 da 4o Edição do 
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (Bennett & Belay, 2001).
O método do NMP é uma alternativa que pode ser utilizada quando as contagens esperadas encontram-se 
abaixo do limite de detecção do plaqueamento, que é de 100 UFC/g. Antes de iniciar as atividades, ler 
atentamente as orientações do Capítulo 4, que apresenta todos os detalhes e cuidados envolvidos na contagem 
de microrganismos pelo NMP, da seleção das diluições ao cálculo dos resultados. O procedimento descrito 
abaixo não apresenta esses detalhes, pressupondo que sejam conhecidos pelo analista.
11.3.1. MATERIAL REQUERIDO PARA A ANÁLISE
Preparacão da amostra e diluições seriadas
n Diluente: Água Peptonada 0,1% (H2Op) ou Tampão Fosfato pH 7,2 (PB)
n Tubos de diluição com 9ml de Água Peptonada 0,1% (H2Op) ou o Tampão Fosfato pH 7,2 (PB)
n Pipetas de 1 ou 2ml
n Observação: consultar o Anexo 2.2 do Capítulo 2 para verificar casos especiais em que o tipo ou volume de 
diluente variam em função da amostra analisada.
Contagem presuntiva
n Tubos de Caldo Tripticase de Soja (TSB) suplementado com polimixina
n Estufa incubadora regulada a 30oC com termômetro calibrado
Confirmação
n Os mesmos itens requeridos na contagem em placas
11.3.2. PROCEDIMENTO
O esquema geral de análise de B. cereus pelo método do NMP encontra-se descrito na Figura 11.2.
Inserir Figura 11.2.
Figura 11.2. Esquema de análise para contagem de B. cereus pelo método do NMP (Bennett & Belay, 2001).
Para a preparação da amostra e diluições seriadas, seguir as orientações do Capítulo 2.
Inocular três alíquotas de 1ml das três primeiras diluições da amostra em uma série de três tubos de Caldo 
Tripticase de Soja (TSB) suplementado com polimixina B, na mesma concentração utilizada no Ágar Ágar 
Manitol Gema de Ovo Polimixina (MYP). Incubar os tubos a 30oC/48h.
Observar crescimento denso, típico de B. cereus e estriar uma alçada de cada tubo com crescimento em placas 
de MYP ou Ágar Kim-Goepfert (KG), incubando as placas a 30-32oC/20-24h. Verificar a formação de 
colônias típicas de B. cereus, descritas no item 11.2 e selecionar uma ou mais colônias de cada placa para 
confirmação, que deve ser feita seguindo os mesmos procedimentos descritos no item 11.2.
Anotar o número de tubos cujas culturas foram confirmadas e determinar o Número Mais Provável (NMP)/g 
conforme a orientação do Capítulo 4, usando uma das tabelas de NMP.
6.4. REFERÊNCIAS
BENNETT, R.W. & BELAY, N. Bacillus cereus. In: DOWNES, F. P., and K. ITO (ed.), Compendium of 
Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4th ed. American Public Health Association, 
Washington, D. C, 2001. Chapter 32, p.311-316.
DEAN, D.H., 1984. Biochemical genetics of the bacterial insect-control agent Bacillus thuringiensis: basic 
principles and prospect for genetic engineering. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 
2:341-363.
Di FRANCO, C., BECCARI, E., SANTINI, T. et al., 2002. Colony shape as a genetic trait in the pattern-
forming Bacillus mycoides. BMC Microbiology 2 (1): 33-48.
EUZÉBY, J.P., 2003. Dictionnaire de Bactériologie Vétérinaire. http://www.bacdico.net.
FDA (Food and Drug Administration), 2001. Bacteriological Analytical Manual Online, Capítulo 14. 
Disponível no site: http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-14.html (acesso em 16/01/06).
HOLBROOK, R. & ANDERSON, J.M., 1980. An improved selective diagnostic medium for the isolation 
and enumeration of Bacillus cereus in foods. Canadian Journal of Microbiology 26:753-759.
ICMSF (International Commission on Microbiological Specifications for Foods), 1996. Microrganisms in 
Foods 5. Microbiological Specifications of Food pathogens. Blackie