Bolores e leveduras

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CAPÍTULO 7
CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS
7.1. INTRODUÇÃO
A maioria das informações e orientações contidas nesse capítulo são da American Public Health Association 
(APHA), descritas na 4ª Edição do Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods 
(Downes & Ito, 2001). Quando diferentes ou complementares às do Compendium, foram também incluídas 
recomendações da 17ª Edição do Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Wehr & Frank, 
2004), específicas para a análise de produtos lácteos.
Os bolores e leveduras constituem um grande grupo de microrganismos, a maioria originária do solo ou do ar. 
Os bolores são extremamente versáteis, a maioria das espécies capaz de assimilar qualquer fonte de carbono 
derivada de alimentos. A maioria também é indiferente com relação às fontes de nitrogênio, podendo utilizar 
o nitrato, os íons de amônia e o nitrogênio orgânico. Entretanto, se for necessário utilizar as proteínas ou os 
aminoácidos como fonte tanto de nitrogênio quanto de carbono, várias espécies vão apresentar um 
crescimento limitado. As leveduras, de maneira geral, são mais exigentes do que os bolores. Muitas são 
incapazes de assimilar nitrato e carboidratos complexos, algumas exigem vitaminas e outras, como 
Zygosaccharomyces bailii, por exemplo, não conseguem utilizar a sacarose como única fonte de carbono. 
Esses fatores, de uma certa forma, limitam a gama de alimentos susceptíveis à deterioração por leveduras.
Os bolores e leveduras são também bastante resistentes à condições adversas, como pH ácido e atividade de 
água baixa. A maioria das leveduras apresenta atividade de água mínima de crescimento na faixa de 0,88 e a 
maioria dos bolores na faixa de 0,80. Os bolores e leveduras capazes de crescer em atividades de água abaixo 
do limite de 0,85 são chamados de xerófilicos, e aqueles que crescem em altas concentrações de sal são 
chamados halófílicos. Com relação ao pH, os fungos são muito pouco afetados pela variação na faixa de 3,0 a 
8,0. Vários bolores que crescem abaixo de 2,0 e diversas leveduras abaixo de 1,5. Entretanto, quando o pH 
afasta-se do ótimo (geralmente próximo de 5,0) a velocidade de crescimento diminui e, se houver outros 
fatores de inibição (atividade de água, temperatura, etc.), seu efeito restritivo sobre a velocidade de 
crescimento torna-se mais acentuado.
A temperatura ótima de crescimento da maioria dos fungos encontra-se na faixa de 25 a 28oC, não crescendo 
bem nas temperaturas mesófilas (35-37oC) e raramente nas temperaturas de bactérias termotolerantes (45oC). 
Seu crescimento não é incomum sob condições de refrigeração (5oC), porém, abaixo de 10oC negativos os 
alimentos podem ser considerados microbiologicamente estáveis.
Os bolores deteriorantes de alimentos, como quase todos os outros fungos filamentosos, exigem oxigênio para 
crescimento, podendo ser considerados aeróbios estritos. No entanto, várias espécies, são eficientes em 
utilizar pequenas quantidades de oxigênio, de forma que o efeito do O2 é dependente da quantidade absoluta 
dissolvida no substrato, e não da concentração presente na atmosfera. Ao contrário dos bolores, muitas 
espécies de leveduras são capazes de crescer na completa ausência de O2 e em diferentes concentrações de 
CO2. Isso as torna os deteriorantes mais comuns de alimentos líquidos engarrafados, nos quais o crescimento 
dos bolores é limitado pela disponibilidade de oxigênio. Eventualmente, algumas espécies de bolores dos 
gêneros Mucor, Rhizopus, Byssochlamys e Fusarium podem crescer nesses produtos, provocando 
deterioração.
A consistência do alimento, assim como a atmosfera de armazenamento, exerce uma considerável influência 
sobre os tipos de fungos que irão provocar a deterioração do produto. Em linhas gerais, as leveduras 
predominam em alimentos líquidos, porque são unicelulares e se dispersam mais facilmente em líquidos. 
Além disso, substratos líquidos oferecem maior oportunidade para desenvolvimento de condições anaeróbias, 
ideais para as leveduras fermentativas. Os bolores, ao contrário, são favorecidos por substratos sólidos firmes, 
em cuja superfície há fácil acesso ao oxigênio. Por outro lado, essa afirmação não deve ser entendida como 
absoluta, sugerindo que leveduras não possam deteriorar alimentos sólidos ou bolores alimentos líquidos. 
Simplesmente, as leveduras são mais competitivas em líquidos, provocando alterações percebidas mais fácil 
ou rapidamente.
Os fungos infecciosos raramente são associados aos alimentos, porém, certas leveduras de origem alimentar 
podem desencadear reações alérgicas e alguns bolores podem provocar infecções em indivíduos 
imunodeprimidos. Vários bolores produzem micotoxinas, que são metabólitos tóxicos formados durante o 
crescimento. Os gêneros de bolores toxigênicos mais importantes são Aspergillus, Penicillium e Fusarium.
Métodos de análise de bolores e leveduras totais
A quantificação de bolores e leveduras em alimentos é feita pelo método de contagem padrão em placas, 
determinando-se o número de unidades formadoras de colônias (UFC). O método mais recomendado é o 
plaqueamento em superfície, para aumentar a exposição ao oxigênio e evitar o “stress” causado pelo meio de 
cultura quente. Vários meios podem ser utilizados:
O Capítulo 20 do Compendium (Beuchat & Cousin, 2001) recomenda o Ágar Dicloran Rosa de Bengala 
Cloranfenicol (DRBC), para alimentos com atividade de água superior a 0,95 e o Ágar Dicloran Glicerol 18 
(DG18), para alimentos de atividade de água menor ou igual a 0,95. O DRBC contém cloranfenicol, para 
inibir bactérias, além de dicloran e rosa de bengala, para restringir o espalhamento da colônia. O DG18, além 
de cloranfenicol e dicloran, contém também glicerol, que reduz a atividade de água do meio.
O Capítulo 8 do Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Frank & Yousef, 2004) 
recomenda o DRBC para produtos lácteos em geral e o Ágar Extrato de Levedura Glicose Cloranfenicol 
(YEGC) para amostras com predomínio de leveduras ou com leveduras injuriadas pelo processamento. 
Nesses produtos o DRBC recupera menos leveduras do que o YEGC. Para produtos não submetidos a 
tratamento térmico, acidificação ou outro tratamento que possa provocar injúrias às células, pode também ser 
utilizado Ágar Batata Dextrose Acidificado (PDA-AC), porém, algumas bactérias podem crescer neste meio 
(Taniwaki et al., 1999).
Outros métodos já oficializados pela AOAC (Association of Official Analytical Chemists) são os “kits” 
analíticos descritos na Tabela 7.1.
Tabela 7.1. “Kits” analíticos oficializados pela AOAC (Association of Official Analytical Chemists) para a 
contagem bolores e leveduras em alimentos.
Fabricante Nome do “kit Validação Aplicação
3M Microbiology 
Products
Petrifilm Yeast and Mold 
Count Plate
AOAC Official Method 
997.02
Alimentos
BioControl Systems Inc. SimPlate Yeast and Mold 
Color Indicator (YM-CI)
AOAC Official Method 
2002.11
Alimentos, ingredientes 
e amostras ambientais
Fonte: AOAC International, disponível no site <http://www.aoac.org/testkits/kits-microbiology.htm>, acesso em 10/02/06.
Fungos psicrotróficos
Os bolores e leveduras também apresentam cepas psicrotróficas, embora sejam menos estudadas do que as 
bactérias. Os fungos predominam em alimentos refrigerados, com baixa atividade de água, alta acidez ou 
condições de embalagem que inibam bactérias, incluindo, frutas, geléias e produtos fermentados (iogurte, 
queijos, embutidos, etc.). Os gêneros de leveduras mais encontrados são Candida, Cryptococcus, 
Debaromyces, Hansenula, Kluveromyces, Pichia, Saccharomyces, Rhodotorula, Torulopsis e Trichosporon. 
Os bolores são Alternaria, Aspergillus, Botrytis, Cladosporium,Colletotrichum, Fusarium, Geotrichum, 
Monascus, Mucor, Penicillium, Rhizopus, Sporotrichum, Thamnidium e Trichothecium.
O método tradicional de quantificação de psicrotróficos em alimentos é contagem padrão em placas, 
determinando-se o número de unidades formadoras de colônias (UFC) de aeróbios por grama ou mililitro. Os 
meios utilizados são o Ágar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol (DRBC), para alimentos em geral (pode 
ser substituído pelo PCA suplementado com 100mg/l de cloranfenicol) e o Ágar Dicloran Glicerol 18 
(DG18), para alimentos com atividade de água menor que 0,95. A temperatura de incubação é de 7+1oC por 
10 dias ou 17+1oC por 16 horas, seguido de mais 3 dias a 7+1oC.
Bolores termorresistentes
Os fungos, de maneira geral, apresentam baixa resistência ao calor, sendo destruídos com relativa facilidade 
por tratamentos térmicos brandos. Há, entretanto, exceções, pois certos fungos filamentosos do sub-reino 
Ascomycotina produzem esporos sexuais (ascosporos), capazes de sobreviver aos tratamentos térmicos. As 
espécies conhecidas são Byssochlamys fulva, Byssochlamys nivea, Neosartoria fisheri, Talaromyces flavus, 
Talaromyces bacillisporus e Eupenicillium brefeldianum, cujos ascosporos podem apresentar resistência 
térmica comparável à dos esporos bacterianos. Os ascosporos de B. fulva tem valor D90ºC de 1 a 12 min (Bayne 
& Michener, 1979) e valor z entre 6 e 7ºC (King et al., 1969). A resistência térmica de B nivea é ligeiramente 
inferior, com D88ºC de 0,75 a 0,8min e valor z entre 6 e 7ºC (Casella et al., 1990) e a de N. fischeri é similar à 
de B. fulva (Splittstoesser & Splittstoesser, 1977).
Os bolores termorresistentes são mais comumente associados com a deterioração de frutas e seus derivados, 
processados termicamente. Sua sobrevivência ao tratamento térmico pode resultar em crescimento com 
formação de micélios e, no caso de Byssochlamys, na completa alteração da textura, devido à produção de 
pectinases.
Os bolores termorresistentes são amplamente distribuídos no solo, porém, o número de esporos em frutas 
geralmente é baixo, não excedendo 1-10/100g ou ml dos produtos processados. Ainda assim, na etapa 
imediatamente anterior ao tratamento térmico, a presença de apenas cinco esporos/g de produto já é 
considerada um problema sério. Em alimentos processados assepticamente em altas temperaturas por curto 
tempo (UHT ou HTST), sem adição de conservantes, mesmo contagens ainda mais baixas são inaceitáveis. 
Por essa razão, o sucesso da detecção depende da coleta de amostras significativamente maiores do que as 
normalmente requeridas nas demais análises de alimentos. Essas amostras podem ser congeladas antes da 
análise, porque os esporos não são afetados pelo congelamento.
A detecção é baseada no tratamento térmico das amostras, para eliminação das células vegetativas de bolores, 
leveduras e bactérias, seguido do plaqueamento em um meio adequado ao crescimento de bolores, como o 
Ágar Batata Dextrose (PDA) ou o Ágar Extrato de Malte (MEA).
7.2. MÉTODO DE CONTAGEM TOTAL DE BOLORES E 
LEVEDURAS EM PLACAS
Método da American Public Health Association (APHA), descrito no Capítulo 20 da 4o Edição do 
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (Beuchat & Cousin, 2001). Incluídas 
também as recomendações específicas do Capítulo 52 do Compendium (Gray & Pinkas, 2001) para a análise 
de gomas, pectina e celulose e as do Capítulo 8 do Standard Methods for the Examination of Dairy Products 
(Frank & Yousef, 2004) específicas para a análise de produtos lácteos.
Antes de iniciar as atividades, ler atentamente as orientações do Capítulo 3, que apresenta todos os detalhes e 
cuidados envolvidos na contagem de microrganismos em placas, da seleção das diluições ao cálculo dos 
resultados. O procedimento descrito abaixo não apresenta esses detalhes, pressupondo que sejam conhecidos 
pelo analista.
7.2.1. MATERIAL REQUERIDO PARA A ANÁLISE
Preparacão da amostra e diluições seriadas
n Diluente: Água Peptonada 0,1% (H2Op) ou Tampão Fosfato pH 7,2 (PB)
n Tubos de diluição com 9ml de Água Peptonada 0,1% (H2Op) ou o Tampão Fosfato pH 7,2 (PB)
n Pipetas de 1 ou 2ml
n Observação: consultar o Anexo 2.2 do Capítulo 2 para verificar casos especiais em que o tipo ou volume de 
diluente variam em função da amostra analisada.
Contagem por plaqueamento em superfície
n Placas de Ágar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol (DRBC) (para alimentos com atividade de água 
maior que 0,95 e produtos lácteos em geral)
n Placas de Ágar Dicloran Glicerol 18 (DG-18) (para alimentos com atividade de água menor ou igual a 0,95, 
exceto produtos lácteos)
n Placas de Ágar Extrato de Levedura Glicose Cloranfenicol (YEGC) opcional para produtos lácteos com 
predomínio de leveduras ou com leveduras injuriadas)
n Alça de espalhamento (alça de Drigalski) mergulhada em etanol 70%
n Estufa incubadora regulada entre 22 e 25oC (25+1ºC para produtos lácteos) com termômetro calibrado
7.2.2. PROCEDIMENTO
O esquema geral de análise para contagem de bolores e leveduras em placas encontra-se descrito na Figura 
7.1.
Inserir Figura 7.1
Figura 7.1. Esquema geral de análise para contagem de bolores e leveduras em placas (Beuchat & Cousin, 
2001).
DRBC = Ágar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol, DG18 = Ágar Dicloram Glicerol 18
a) Preparação das amostras e diluições seriadas
Seguir os procedimentos descritos no Capítulo 2. Para alimentos de umidade intermediária, manter a amostra 
de molho no diluente por um certo período de tempo, para amolecer o produto e facilitar a liberação dos 
microrganismos presentes.
b) Inoculação
Selecionar três diluições adequadas da amostra e inocular (plaqueamento em superfície) 0,1ml de cada 
diluição em placas previamente preparadas e secadas, de um dos seguintes meios de cultura:
n Ágar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol (DRBC), para alimentos com atividade de água maior que 
0,95 e produtos lácteos em geral.
n Ágar Dicloran Glicerol 18 (DG-18), para alimentos com atividade de água menor ou igual a 0,95, exceto 
produtos lácteos. No caso da análise de matérias primas destinadas à formulação de produtos com atividade 
de água maior que 0,95, para verificar a contagem de potenciais deteriorantes do produto final, utilizar o 
Ágar DRBC.
n Ágar Extrato de Levedura Glicose Cloranfenicol (YEGC), opcional para produtos lácteos com predomínio 
de leveduras ou com leveduras injuriadas.
n Ágar Batata Dextrose Acidificado, opcional para produtos lácteos não submetidos ao calor, acidificação ou 
outro tratamento que possa provocar injúrias às células
Espalhar o inóculo com uma alça de Drigalski, das placas de maior para as placas de menor diluição, até que 
todo o excesso de líquido seja absorvido. Se as contagens estimadas na amostra forem menores do que 100/g 
ou ml, inocular 1ml da primeira diluição, distribuindo o volume por quatro placas, três com 0,3ml e uma com 
0,1ml.
Nota b1) Na análise de espessantes (gomas, pectina, celulose) a diluição inicial deve ser maior do que 1:10, em função da 
viscosidade desses produtos. Se as contagens esperadas são baixas, pode ser feito o plaqueamento direto de 1g da amostra na 
placa, espalhando o material por toda a superfície (Gray & Pinkas, 2001).
Nota b.2) Antes do uso, estocar as placas de DRBC ou DG-18 em geladeira, protegidas contra a luz, para evitar a 
fotodegradação do rosa de bengala, com formação de compostos inibidores para os bolores e leveduras.
c) Incubação
Aguardar que as placas sequem (mínimo 15 minutos) e incubar a 22-25oC por cinco dias, sem inverter, em 
pilhas de não mais de três placas, no escuro. Recomenda-se não contar as colônias antes de cinco dias, porque 
a movimentação das placas pode resultar em crescimento secundário (devidoao deslocamento de esporos), 
invalidando a contagem final.
Nota c.1. O Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Frank & Yousef, 2004) recomenda incubação a 
25+1oC por 5+0,5 dias para a análise de produtos lácteos.
Nota c.2) A International Commission on Food Mycology (ICFM) recomenda incubação a 25oC/5dias como condição padrão. 
Em regiões tropicais, recomenda 30oC/5dias para produtos estocados à temperatura ambiente (Pitt & Hocking, 1997).
d) Contagem das colônias e cálculo dos resultados
Para a contagem de colônias e cálculo dos resultados, selecionar as placas com 15 a 150 colônias e contar as 
colônias com o auxílio de uma lupa, em um contador de colônias.
Na placa selecionada, contar separadamente as colônias com aspecto filamentoso, cotonoso ou pulverulento, 
características de bolores, anotando o resultado.
Na mesma placa, contar as demais colônias, que podem ser de leveduras ou de bactérias, eventualmente 
capazes de crescer. Selecionar pelo menos cinco dessas colônias e verificar a morfologia das células ao 
microscópio, observando se a cultura é de leveduras, bactérias ou mistura de ambas. Para isso, pode ser feita 
uma montagem úmida ou uma coloração de Gram, conforme procedimento descrito no Capítulo 5. Considerar 
como confirmadas todas as colônias que apresentarem leveduras ou mistura de leveduras e bactérias. 
Determinar o número de colônias de leveduras na placa em função da porcentagem confirmada. Por exemplo, 
de 30 colônias contadas, cinco foram submetidas à confirmação e três foram confirmadas como leveduras 
(60%). Então, o numero de colônias de leveduras na placa é de 30x0,6=18.
O cálculo dos resultados deve ser feito de acordo com as orientações do Capítulo 3. Para calcular o número de 
UFC/g ou ml de bolores, multiplicar o número de colônias típicas de bolores por dez e pelo inverso da 
diluição. Para calcular o número de UFC/g ou ml de leveduras, multiplicar o número de colônias confirmadas 
como leveduras por dez e pelo inverso da diluição. Para calcular o número total de bolores e leveduras, somar 
o número de colônias de bolores e o número de colônias confirmadas como leveduras e multiplicar por dez e 
pelo inverso da diluição.
Exemplo
Diluição 10-2 (inoculados 0,1ml)
Total de colônias típicas de bolores na placa = 30
Colônias presuntivas de leveduras na placa = 40, cinco submetidas à confirmação, quatro confirmadas (80%)
Total de colônias de leveduras na placa = 40x0,8 = 32
UFC/g ou ml de bolores = 30x102x10 = 3,0x104.
UFC/g ou ml de leveduras = 32x102x10 = 3,2x104.
UFC/g ou ml de bolores e leveduras = (30+32)x102x10 = 6,2x104.
7.3. MÉTODO DE CONTAGEM DE FUNGOS PSICROTRÓFICOS
Método da American Public Health Association (APHA), descrito no Capítulo 13 da 4o Edição do 
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (Cousin et al., 2001).
O esquema geral de análise para contagem de fungos psicrotróficos em placas encontra-se descrito na Figura 
7.2.
Inserir Figura 7.2
Figura 7.2. Esquema geral de análise para contagem de fungos psicrotróficos em placas (Cousin et al., 2001).
DRBC = Ágar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol, DG18 = Ágar Dicloram Glicerol 18
Segue o mesmo procedimento da contagem total de bolores e leveduras, alterando a condição de incubação, 
que pode ser 7+1oC por 10 dias ou 17+1oC por 16 horas, seguido de mais 3 dias a 7+1oC.
Na preparação das amostras, a homogeneização em “stomacher” é mais indicada do que em liqüidificador, 
que pode favorecer a fragmentação dos micélios, alterando a contagem. Se for necessário usar liqüidificador, 
não ultrapassar dois minutos de homogeneização.
Os meios recomendados são o Ágar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol (DRBC), para alimentos em 
geral (pode ser substituído pelo PCA suplementado com 100mg/l de cloranfenicol) e o Ágar Dicloran Glicerol 
18 (DG-18), para alimentos com atividade de água menor que 0,95).
7.4. MÉTODO DE CONTAGEM DE BOLORES 
TERMORRESISTENTES
Método da American Public Health Association (APHA), descrito no Capítulo 21 da 4o Edição do 
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (Beuchat & Pitt, 2001).
7.4.1. MATERIAL REQUERIDO PARA A ANÁLISE
n Água destilada estéril
n Liquidificador ou “stomacher” e bolsas estéreis para homogeneização da amostra
n Ágar Batata Dextrose (PDA) com Antibióticos ou Ágar Extrato de Malte (MEA) com Antibióticos, em 
concentração 1,5
n Tubos de 200x30mm ou Erlenmeyers de 250ml
n Placas de Petri estéreis de diâmetro 150 mm
n Banho-maria fechado regulado a 75-80oC e termômetro calibrado
n Estufa incubadora regulada a 30+1oC e termômetro calibrado
7.4.2. PROCEDIMENTO
Atenção. Todas as etapas da análise para detecção de bolores termorresistentes devem ser realizadas em 
capela de fluxo laminar, para evitar a contaminação acidental da amostra por bolores do ambiente.
a) Choque térmico
a.1) Para a análise de frutas ou polpas contendo pedaços de frutas, pesar 100g da amostra 
em um copo de liquidificador estéril, adicionar 100ml de água destilada estéril e homogeneizar por 5min ou 
pelo tempo necessário para obter uma suspensão homogênea. Colocar o copo em uma bolsa plástica estéril e 
transferir para um banho-maria fechado, com a temperatura controlada entre 75 e 80oC. Manter no banho por 
90min, garantindo que a superfície do produto permaneça abaixo da superfície da água do banho.
Alternativamente, pesar 100g da amostra em uma bolsa plástica estéril, adicionar 100ml de água destilada 
estéril e homogeneizar em “stomacher”, por 2-4min. Após a homogeneização, transferir duas porções de 50ml 
para tubos de 200x30mm e colocar os tubos em um banho-maria fechado, com a temperatura controlada entre 
75 e 80oC. Manter no banho por 30min, garantindo que a superfície do produto permaneça abaixo da 
superfície da água do banho.
a.2) Para a análise de sucos de frutas não concentrados (Brix < 35o), transferir três porções 
de 50ml da amostra para tubos de 200x30mm e utilizar um dos tubos para ajustar o pH em 3,4-3,6, com 
NaOH 10%. Anotar o volume de NaOH consumido no ajuste e adicionar assepticamente, aos dois demais 
tubos, igual quantidade de NaOH 10% estéril. Descartar o tubo manuseado e transferir os dois demais para 
um banho fechado, com a temperatura controlada entre 75 e 80oC. Manter no banho por 30min, garantindo 
que a superfície do produto permaneça abaixo da superfície da água do banho.
a.3) Para a análise de sucos de frutas concentrados (Brix > 35o), pesar 100g da amostra em 
uma bolsa plástica estéril, adicionar 200ml de água destilada estéril e homogeneizar em “stomacher”. Após a 
homogeneização, transferir três porções de 50ml para tubos de 200x30mm, ajustar o pH e continuar a análise 
da mesma forma descrita para sucos não concentrados.
b) Inoculação
Distribuir as porções de 100ml em oito placas de Petri grandes (150mm de diâmetro) ou as porções de 50ml 
em quatro placas. Adicionar a cada placa, 10ml de Ágar Batata Dextrose (PDA) ou Ágar Extrato de Malte 
(MEA) com antibióticos e com 1,5 vezes a concentração normal. Misturar bem a amostra com o meio de 
cultura e aguardar solidificar.
Nota b.1) Pitt & Hocking (1997) descrevem o seguinte procedimento alternativo: Pesar 100g da amostra em um saco de 
“stomacher” ou duas porções de 50g em tubos de 200x30mm ou Erlenmaeyers de 250ml. Amostras líquidas com Brix > 35o 
devem ser diluídas, na proporção 1:1, com água peptonada 0,1%, antes do aquecimento. Amostras muito ácidas, devem ter seu 
pH ajustado em 3,5 a 4,0 com NaOH 10%. Colocar os tubos ou o saco de stomacher com a amostra num banho fechado, com 
a temperatura controlada à 80oC. Manter no banho por 30min, garantindo que a superfície do produto permaneça abaixo da 
superfície da água do banho. Após o choque térmico, misturar a amostra com 100ml de Ágar Batata Dextrose (PDA)ou Ágar 
Extrato de Malte (MEA), em dupla concentração, com antibióticos, previamente fundido e resfriado a 50-60oC. Homogeneizar 
bem e distribuir em cinco placas de Petri estéreis, vazias, aguardando a completa solidificação.
c) Incubação
Transferir as placas para uma bolsa plástica estéril, fechar bem a bolsa, para evitar o ressecamento do meio de 
cultura e incubar a 30ºC por até 30 dias, examinando semanalmente. A maioria dos esporos viáveis 
normalmente germinará e formará colônias visíveis em 7-10 dias, porém, esporos injuriados pelo calor 
poderão requerer um período adicional para desenvolver colônias.
d) Cálculo dos resultados
Contar as colônias desenvolvidas em todas as placas e calcular o resultado como número de esporos/100g ou 
ml.
7.5. BIBLIOGRAFIA
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