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Cromatografia Definição • Técnica de separação de componentes de uma amostra através de migração diferencial dos componentes das amostras entre as fases móvel e estacionária. • Quando combinada a técnicas de análise química pode ser qualitativa e quantitativa. • Ampla faixa de aplicação: H2 até macromoléculas. Princípios básicos • A separação dos compostos depende da interação entre as substâncias da mistura com: – Fase Estacionária: sólido ou líquido – Fase Móvel: líquido ou gás • As forças que influenciam: – Eletrostáticas, solubilidade, intermoleculares... Classificação • De diferentes maneiras Classificação: modo de separação • Adsorção(L-S): atrações intermoleculares dipolares. • Troca iônica Classificação: modo de separação • Partição (L-L): solubilidade da substância entre dois líquidos. • Exclusão molecular Classificação: forma física • Planar: CP (cromatografia em papel) ou CCD (cromatografia em camada delgada). Cromatograma: CCD • Técnica simples. • Separação dos componentes por migração diferencial sobre uma camada adsorvente . • Fase estacionária sólida (sílica, alúmina) e fase móvel líquida (solvente ou mistura de solventes). • Aplicações: micotoxinas, carotenóides, corantes... • Vantagens: – Fácil execução, rapidez, versatilidade (analítica ou preparativa), reprodutibilidade e baixo custo. CCD • Conceitos relevantes: – Polaridade placa e solvente – Técnica de aplicação das amostras – Revelação da placa (se necessário) – Cálculo do Rf (Fator de retenção) CCD • Técnica CCD • Solventes: Classificação: forma física • Coluna: CL (cromatografia líquida), CLAE (cromatografia líquida de alta eficiência), CG (cromatografia gasosa). CL • Fase estacionária: sólido empacotado em uma coluna de vidro ou aço. • Fase estacionária: solvente ou mistura deles. • Separação por adsorção. Interações do tipo: pontes de hidrogênio, forças eletrostáticas (Van der Waals: HCl), transferência de cargas. CLAE • Otimização da coluna clássica, uso de pressão, separação mais rápida e eficiente. • Diferentes amostras. Aplicação em amostras não voláteis e termolábeis. • Vantagens (em comparação à coluna clássica): – Maior resolução, sensibilidade, reprodutibilidade e rapidez. – Automação. CLAE • Equipamento: Partes: Bomba / Injetor / Coluna / Detector (UV / Fluorescência / Processador CLAE • Desvantagens – Custos de implantação e operação, treinamento constante, detectores, custo dos solventes (grau CLAE - 99% de pureza, Água – R$ 50,00 / L). • Aplicações: – Vitaminas, Lipídios, Aminoácidos / Proteínas, Pesticidas, Antioxidantes, Drogas (antidoping), Fármacos, Bactericidas, Surfactantes, Ácidos Graxos CLAE • Fase móvel: – Filtrada (2 a 5 m) e desgaseificada (retirada de O2 por ultrassom, vácuo ou refluxo). – Possibilidade de gradiente de eluição. Separação não isocrática. – Sempre sob alta pressão • Fase estacionária – Coluna analítica: – Características: inerte, diâmetro interno uniforme, e resistência (pressão e ataque da fase móvel). CLAE • Detectores – Componente mais caro do equipamento. – Características: alta sensibilidade, baixo ruído, linearidade, estabilidade, repetibilidade. – Tipos: espectrofotométricos (absorção no UV/vis – mais usado; IV – baixa sensibilidade; fluorescência – alta sensibilidade). • Registrador – Tempo de retenção. CLAE • Separação CLAE • Cromatogramas típicos CROMATOGRAMA • RESOLUÇÃO A sobreposição de picos não é adequada. Para evitar deve-se alterar os parâmetros de análise, CROMATOGRAMA • Exemplo de separação CROMATOGRAMA • PADRÃO Para identificação de compostos CROMATOGRAMA • QUANTIFICAÇÃO Área do triangulo CG • Uma das técnicas mais utilizadas. • Fase móvel é um gás (inerte) e a fase estacionária é pode ser um líquido ou um sólido. • Vantagens: – alta resolução, FM com menor resistência ao fluxo = colunas maiores (maior separação), alta sensibilidade. • Desvantagens: – somente compostos voláteis ou volatilizáveis, preparo da amostra (maior tempo), problemas de identificação da amostra. CG • Separação ocorre principalmente por adsorção / participação. • Processo pode ser isotérmico ou com gradiente de temperatura. CG • Gás de arraste: inerte, compatível com o detector, disponível. • Injeção da amostra: manual ou automatizado. CG • Coluna: principal componente, dois tipos – empacotada ou capilar. • Sangramento da coluna: em altas temperaturas a FM pode arrastar parte da FE, diminuindo o tempo de vida da coluna – Empacotada: comprimento de até 3 m, diâmetro de 1 a 4 mm. – Capilar: até 100 m de comprimento e diâmetro de 0,25 a 0,75 mm. CG • Detectores: rapidez, alta sensibilidade, baixo ruído, ampla faixa de resposta, seletividade (detectores universais e seletivos), não- destrutivos. Detector de ionização e chama: Usado em compostos que queime formando um composto com carga elétrica. Sensível, ampla faixa linear, porém destrutivo.
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