Citometria de fluxo biomedicina unipac jf

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Citometria de fluxo
BIANCA L. VITAL, NATHÁLIA C. MARTINEZ E YAGO ZAINOTTE | 
PROF. HUGO FAJARDO – PATOLOGIA GERAL – UNIPAC JF - BIOMEDICINA
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O que é?
Para que serve?
Quais as vantagens?
Como é o procedimento?
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O que é?
 Determinar características estruturais e funcionais de células e partículas biológicas
 Quantificação precisa de parâmetros celulares físico-químicos
 Parâmetro essencial para acessar a condição clínica e definir tratamentos mais específicos
para cada doente
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Laser Hidrodinâmica Ótica Computação
Ferramenta combinada:
O que é?
 Separar, contar, examinar e classificar células e detectar biomarcadores em proteínas
 Análise simultânea e multiparamétrica – CITOMETRIA DE FLUXO MULTIPARAMÉTRICA
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• Cito
• Célula
• Metria
• Medição
• Fluxo
• Movimento
• Suspensas em 
líquido
Marcos Históricos da Citometria de Fluxo 
(FC)
Fases do ciclo 
celular
Teste de 
anticorpos
Estudo sobre o 
cariótipo
1975
Medição de 
condições 
fisiológicas pela 
técnica 
citofluorimétrica
(pH intracelular e 
estado redox)
1979 a 1980
Utilização das
ficobiliproteínas como 
fluorocromos;
Utilização da coloração
fluorocromática laranja de 
acridina em DNA e RNA.
1982
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Primeiro Citômetro 1970- Henzenberg
Para que serve
APLICAÇÃO DA TÉCNICA NA PESQUISA E NAS ANÁLISES CLÍNICAS
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Principais aplicações da técnica:
 Hematologia: diagnosticar e tratar diferentes complicações - análise das funções 
de células sadias . 
 evidenciar a natureza patológica.
 Cancerologia: detecção da célula patológica, diagnóstico de linfomas.
medição de conteúdos anormais de DNA no seu núcleo. 
 Imunologia: identificação de subtipos de células que estariam levando às 
disfunções de imunidade.
 Transplantes, avaliações do sistema imune, imunologia do tumor e 
quimioterapia.
 Patologia: Apoio para o diagnóstico e prognóstico da enfermidade;
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 Modelo mais aplicado para análise celular:
 pesquisas clínicas laboratoriais no controle de células T CD4+ em pacientes 
portadores do vírus HIV (mais antiga e uso em larga escala)
 na investigação de doenças onco-hematológicas (leucemias agudas e linfomas)
 Biologia molecular: Análise de DNA (Ciclo celular e ploidia de tumor);
 Desenvolvimento de fármacos;
 Análise de subpopulação linfocitária;
 Quantificação de células progenitoras “stemcell”;
8Principais aplicações da técnica:
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Fonte: DB - Diagnósticos do Brasil
Imunofenotipagem e 
marcadores 
celulares:
• Identificação e distinção de
• tipos celulares.
• Anticorpos monoclonais –
análise quantitativa e 
qualitativa dos CD.
• Diagnósticos hematológicos: 
linfomas e leucemias.
• Aids e outras doenças 
infecciosas.
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Quais as suas vantagens?
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Quais são as vantagens da FC?
 O método para coleta de material costuma ser simples e indolor.
 Mede múltiplos parâmetros em células individuais simultaneamente; 
 Grande número de células analisadas com relativa rapidez:
 Disponibilidade de amplo perfil de anticorpos específicos;
 Análise de antígenos de superfície, intracitoplasmáticos e intranucleares;
 Compreensão minuciosa sobre linhagem, estado de ativação ou a patologia 
celular.
 Ampla aplicabilidade, desde pesquisa até imunologia, farmacologia, 
oceanografia.
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Como é o procedimento?
TÉCNICA BASEADA NO EMPREGO DO LASER ÓPTICO
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Conheça o citômetro:
1) Sistema fluido- Fluxo de células
2) Sistema óptico - Fonte de luz
3) Sistema eletrônico -Detector e conversor do sistema analógico para o digital
4) Sistema de amplificação
5) Sistema computacional - Computador para análise dos sinais
Equipamentos mais modernos analisam simultaneamente várias partículas, isolando e 
separando-as de acordo com características específicas.
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O procedimento
1. Seleção de anticorpos 
específicos para o 
antígeno celular que 
permite caracterizar a 
população das células 
de interesse.
2. Marcação com 
fluorocromos 
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Créditos da Imagem: Apostila FIOCRUZ Citometria de Fluxo – Imunofenotipagem e Avaliação da Produção de Citocinas
Fluorocromos
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Créditos: http://www.ibgm.med.uva.es/servicios/citometria-de-flujo/
Fibroblastos por imunofluorescência.
IMAGEM: Imunofluorescência de células 
tumorais múltiplas cultivadas em cultura de 
tecidos.
Créditos: News Medical Life Science
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Figura: imagem confocal de 
imunofluorescência de fibroblastos 
com retículo endoplasmático em 
amarelo e citoesqueleto em cian.
Créditos: News Medical Life 
Science
O citômetro de fluxo – conjunto de 
sistemas:
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SISTEMA FLUIDO
• Introduz e alinha as 
partículas para análise
SISTEMA ÓPTICO
• Gera e coleta os sinais 
de luz
SISTEMA ELETRÔNICO
• Converte os sinais 
ópticos em sinais 
eletrônicos para análise 
em computador
O citômetro de fluxo – conjunto de 
sistemas:
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SISTEMA FLUIDO
• 3. Coletada a amostra, 
células em suspensão:
• 4.“Câmara” - Introduz e 
alinha as células uma a uma 
por diferença de pressão. 
Créditos da imagem : 
http://labs.umassmed.edu/socolovskylab/research~flow_cytometry.html
Sistema fluido:
 Diferença de pressão:
 Baixa: análise qualitativa
 Alta: análise quantitativa
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1. O fluorocromo ligado ao 
anticorpo absorve a 
energia do laser e 
rapidamente emite essa 
energia em forma de luz, 
em comprimentos de 
ondas específicos de 
acordo com o 
fluorocromo empregado.
FIGURA1. Citômetro de Fluxo BD FACSVerseTM 
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Créditos da imagem: mbioscience.com 
Sistema fluido – o procedimento
O citômetro de fluxo - componentes 
principais:
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SISTEMA ÓPTICO
• 5. Impacto da luz do laser
• Fonte emissora luz do laser.
• FSC – (Forward Scatter) 
tamanho relativo da célula. 
• SSC (Side Scatter): 
granulosidade ou 
complexidade da célulda.
Créditos da imagem: Câncer Research Institute, Queen’s University at Kingston
Procedimento – sistema óptico 24
Créditos da imagem: Sistema óptico do Citômetro de Fluxo BD FACSVerseTM
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Créditos da Imagem: Apostila FIOCRUZ Citometria de Fluxo – Imunofenotipagem e Avaliação da Produção de Citocinas
Procedimento - continuação
 6.Realizada a separação individual celular é feita a análise, contagem, e qualificação das 
micropartículas suspensas em fluxo, em meio líquido. 
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Gráfico de dispersão. Créditos da imagem https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Picoplancton_cytometrie.jpg
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Gráficos de analise de resultados obtidos por 
citometria de fluxo. 
(a)gráfico monoparamétrico (CD3) com respectivo 
pico das células negativas para a marcação 
com os AcMo anti-CD3 (25%) e pico das células 
positivas para esta marcação (75% - linfócitos T); 
(b)gráfico bi paramétrico (CD3 x CD8) dividido em 
quatro quadrantes (Q), nos quais se avalia o 
percentual das células positivas somente para o 
CD3 (Q1), células negativas para a marcação de 
CD3 e de CD8 (Q2 - duplo-negativas), células 
positivas para a marcação de CD3 e de CD8 (Q3 
– duplo positivas), e células positivas somente 
para o CD8 (Q4).
O citômetro de fluxo - componentes 
principais:
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SISTEMA ELETRÔNICO
• “Conversor óptico-digital”
• Capta sinais ópticos e 
converte em sinais eletrônicos
• Para análise, processamento 
e emissão de resultados 
informatizada. 
Créditos: http://www.ibgm.med.uva.es/servicios/citometria-de-flujo/
SISTEMA ELETRÔNICO 29
Citômetro de fluxo
Citômetro de bancada 
(banch-up flow cytometers)
 Laser de argônio de baixa 
intensidade
 Laser He-Ne
 Refrigerado a ar
 Até 4 cores
Separador de células(cell 
sorters)
 Versão mais completa e 
complexa
 Vários componentes 
eletrônicos
 Laser de alta potência
 Refrigeração à água
 Até 11 cores
 Separação física das células
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FACS – principal tipo de citômetro 
de fluxo.
 Citômetro de fluxo: avaliação da emissão de fluorescência das 
células (FACS – Fluorescence Activated Cell Sorter).
 Feixe de laser + identificador de luz contagem individual das 
células íntegras em suspensão.
 Propriedades celulares mais analisadas: complexo mecanismo 
interno das micropartículas, o tamanho, granulosidade e a 
intensidade da fluorescência. 
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Interpretação dos 
dados
• Diversidade de 
informações
• Gating - refinamento e 
identificação sequencial 
das populações de células 
em pesquisa.
• Softwares
• Gráficos de dispersão:
• Tamanho das células
• 2D
• Proporção
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Interpretação dos 
dados 
• CD - cluster 
(agrupamento) de 
diferenciação –
identificação de 
populações celulares:
• CD3 – linfócitos
• CD4 – imunoglobulinas, 
linfócitos - importante 
papel no HIV
• CD45 – leucócitos;
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Aplicação prática – diagnóstico 
de leucemia
Exame imunohistoquímico
 Células sanguíneas ou amostra da 
medula óssea Análise 
Anticorpos monoclonais 
marcados com substâncias 
fluorescentes.
 Paciente com leucemia: as 
células possuem os mesmos 
antígenos (todos derivam das 
mesmas células)
Citometria de fluxo
 Importância: leucemias 
agudas!!!
 Determinar a linhagem celular, 
análise de clonalidade e estado 
de maturação das células 
leucêmicas, expressão de 
padrões de antígenos 
aberrantes típicos de 
determinados grupos de 
leucemias e acompanhamento 
do tratamento e detecção de 
doença residual mínima.
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Conclusão
 A Citometria de fluxo é uma técnica relativamente rápida e extremamente útil de 
ampla aplicabilidade com destaque para a pesquisa, a imunologia e a clínica, na 
qual é amplamente utilizada para diagnóstico e prognóstico relacionado ao HIV e 
às doenças onco-hematológicas.
 Pela tecnologia aplicada ao citômetro seu desenvolvimento tecnológico está 
correlacionado ao do laser óptico.
 Hoje sabemos que há o citômetro de massa que analisa ainda mais parâmetros que 
o citômetro de fluxo com a desvantagem de destruir a amostra analisada.
 Durante a pesquisa observamos a ampla atuação do biomédico nas diversas áreas 
de aplicação da técnica = OPORTUNIDADE!!!!!!
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OBRIGADO!
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Referências
 BRAGA, K. M. da S., etc. al. Citometria de Fluxo: Histórico, princípios 
básicos e aplicações em pesquisa; Disponível em: 
http://www.conhecer.org.br/enciclop/2016a/agrarias/citometria.pdf> 
Acesso em: Acesso em: 22 out. 2017.
 FERRAZ, R. Citometria de Fluxo Cell Shorting: fundamentos e 
aplicações; Disponível em: 
<http:/picf.ioc.fiocruz.br/Apostila%20de%20Citometria%20de%20Fluxo
%20%20sorting.pdf> Acesso em: 22 out. 2017.
 http://www.ibgm.med.uva.es/servicios/citometria-de-flujo
 http://diagnosticosdobrasil.com.br/wp-
content/uploads/2015/01/Citometria-de-Fluxo.pdf
 Cancer Research Institute, Queen’s University at Kingston; 
http://qcri.queensu.ca/cancer_biology_genetics/queens_university_bi
omedical_imaging_centre/services/flow_cytometry/what_is_flow_cyto
metry Acesso em: 22 de outubro de 2017.
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