PREPARAÇÕES MICROSCÓPICAS CORADAS

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PREPARAÇÕES MICROSCÓPICAS CORADAS
As preparações coradas são os exames microscópicos mais comumente empregados em microbiologia, pois proporcionam uma melhor visualização dos microrganismos, permitindo diferenciar vários tipos morfológicos, assim como, o estudo de suas estruturas, quando da utilização de técnicas específicas de colorações. 
COLORAÇÃO DE GRAM
O método de Gram se baseia no fato de que o complexo formado entre o iodo (lugol) e a violeta de genciana (“complexo iodo-pararosa-anilina”) permanece retido dentro da célula de algumas bactérias mesmo após o tratamento subsequente com o álcool (“agente descorante”). Estas bactérias são denominadas Gram positivas ou que tomam o Gram. Outras bactérias chamadas Gram negativas ou que não tomam o Gram descoram facilmente pelo álcool. Entretanto, se após a ação do álcool se efetuar uma coloração de fundo utilizando-se a fucsina básica, as bactérias Gram negativas aparecerão coradas em vermelho, ao passo que as Gram positivas se apresentarão roxas, isto é, conservarão a cor violeta do complexo iodo-violeta de genciana. 
O mecanismo da coloração de Gram não está ainda bem definido, porém, se relaciona indubitavelmente às diferenças de permeabilidade da parede celular. Nas bactérias Gram positivas a parede é constituída essencialmente por um componente mucopeptídico e o tratamento com álcool resulta uma desidratação e consequente diminuição da permeabilidade, o que impede ou dificulta a eluição do complexo iodo-corante. O mesmo não acontece nas bactérias Gram negativas, nas quais o solvente orgânico atua em sentido contrário determinando aumento de permeabilidade celular. A coloração de Gram é de elevada importância para a sistemática em bacteriologia, pois divide as bactérias em dois grandes grupos: GRAM POSITIVAS e GRAM NEGATIVAS, que reagem diferentemente frente a muitos agentes físicos e químicos.
PREPARO DOS CORANTES DA COLORAÇÃO DE GRAM
1.- CRISTAL VIOLETA FENICADO:
1.1 - Fórmula:
	Cristal violeta
	 1,0
	G
	Álcool a 95GL
	10,0
	Ml
	Fenol fundido
	 2,0
	G
	Água destilada
	100
	Ml
1.2 - Fenol fundido: para manter o fenol fundido dissolver em Banho-Maria a 50-60C e adicionar 10% de água destilada.
1.3 -. Preparo: triturar o cristal violeta em um gral. Adicionar o álcool, homogeneizar. Juntar o fenol fundido. Acrescentar aproximadamente 50 ml de água destilada, misturar e transferir para um frasco âmbar de rolha eesmerilhada. Lavar o gral 2 a 3 vezes com o restante de água destilada. Deixar em repouso durante 24 horas. Filtrar em papel ou algodão para outro frasco âmbar de rolha esmerilhada. Estocar. 
NOTA: Quando da transferência do corante em estoque para frascos conta-gotas filtrar novamente com papel de filtro ou algodão. 
2 - MORDENTE (sol. de lugol)
2.1 -Fórmula:
	Iodo
	1,0
	g
	Iodeto de potássio
	2,0
	g
	Água destilada
	300
	mL
2.2 - Preparo: triturar o iodo com iodeto de potássio em um gral. Adicionar aos poucos a água destilada. Misturar bem. Filtrar e estocar em frasco âmbar de rolha esmerilhada.
3 - AGENTE DESCORANTE (álcool)
Usar apenas solventes P.A. podendo-se empregar o álcool etílico 95 à mistura de álcool-cetona (1:1); ou a de éter-cetona na proporção de (1:3).
4 - Corante de fundo (fucsina básica)
Preparo: diluir a fucsina de Ziehl (ver método de coloração de Ziehl) 1:10 em água destilada. Filtrar em papel ou algodão e estocar em frasco âmbar de rolha esmerilhada.
Atividade prática
Fazer a desinfecção da bancada de trabalho com álcool 70%;
Lavar as mãos com água e sabão ( lavagem higiênica).
Em uma lâmina desengordurada e seca faça um esfregaço utilizando uma suspensão bacteriana (não esquecer de passar a alça bacteriológica no álcool areia antes de flambá-la).
Fixar o esfregaço passando-o três vezes pela chama 
Cobrir o esfregaço por 1 minuto com cristal violeta.
Escorrer o corante, cobrir 1 minuto com lugol.
Lavar em água corrente de baixa pressão.
Descorar com álcool-cetona (tempo delicado 10-20 segundos).
Lavar em água corrente de baixa pressão.
Corar com fucsina de Ziehl 1:10 durante 30 segundos.
Lavar em água corrente de baixa pressão.
Deixar secar espontaneamente ao ar.
Leitura ao microscópio com objetiva de imersão.
Fazer o desenho das observações ao microscópio
Classificar as bactérias observadas em relação à morfologia e coloração
Fazer a desinfecção da bancada de trabalho com álcool 70%;
Lavar as mãos com água e sabão ( lavagem higiênica)
TABELA PARA QUANTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS
	Quantificação em cruzes
	Quantificação nominada
	Número de bactérias por campo
	+
	Raras
	1 a 5
	++
	Poucas ou algumas
	6 a 15
	+++
	Moderada ou muitas
	16 a 30 
	++++
	Numerosas
	Mais 30
* Desenhar as lâminas observadas em aula prática