Biologia Molecular Resumo

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SÍNTESE E PROCESSAMENTO DE RNA
RNA
O RNA é uma molécula intermediária na síntese de proteínas, ela faz a intermediação entre o DNA e as proteínas.
Ele é formado por uma cadeia de ribonucleotídeos, que, por sua vez, são formados por um grupo fosfato, um açucar (ribose), e uma base nitrogenada (veja abaixo).
 
 
Esses ribonucleotídeos são ligados entre si através de uma ligação fosfodiéster entre o carbono 3' do nucleotídeo de "cima" e o carbono 5' do nucleotídeo de "baixo" (veja figura).
 
As principais diferenças entre o RNA e o DNA são sutis, mas fazem com que o último seja mais estável do que o primeiro. O RNA é formado por uma fita simples, o açúcar de seu esqueleto é a ribose e uma de suas bases pirimídicas (de anel simples) é diferente da do DNA. Ele possui Uracila ao invés de Timina. Veja a estrutura química das bases do RNA:
Os principais tipos de RNA são os RNAs mensageiros (mRNAs), os transportadores (tRNAs) e os ribossomais (rRNA). Os RNAs mensageiros são aqueles que codificam as proteínas e que devem ter seus códons lidos durante o processo de tradução. Os RNAs ribossomais fazem parte da estrutura do ribossomo, junto com diversas outras proteínas e são eles que catalisam a ligação entre dois aminoácidos na síntese de proteínas. Os RNAs transportadores são aqueles que fazem a conexão códon-aminoácido pois carregam um aminoácido específico de acordo com seu anticódon (complementar ao códon do mRNA).
É interessante notar que, por ser uma fita simples, o RNA pode formar pontes intracadeia, o que faz com que ele possa ter uma infinidade de arranjos tridimensionais, importantes em sua função.
 
TRANSCRIÇÃO
A transcrição consiste na síntese de RNA. Ela é realizada por um complexo enzimático cuja enzima chave é a RNA polimerase, composta de várias subunidades e que realiza a polimerização do RNA a partir de um molde de DNA.
Esse processo ocorre em três etapas principais, a iniciação, o alongamento e o término, cada um contendo fatores específicos que serão explicados adiante. A figura abaixo representa um esquema simplificado do processo.
A transcrição em eucariontes é bem mais complexa que em procariontes. Nos eucariontes a transcrição ocorre no núcleo, enquanto a tradução ocorre no citoplasma. Já nos procariontes tal separação celular não existe, sendo os dois processos muito bem acoplados no espaço. A separação temporal e espacial desses dois processos nos eucariontes permite a eles uma melhor regulação da expressão gênica.
Outra diferença é que o transcrito primário de mRNA dos eucariontes, ao contrário dos procariontes, é amplamente processado. O RNA nascente sofre uma série de alterações: aquisição de revestimento (cap) na sua extremidade 5’, cauda poli-A na extremidade 3’ e remoção exata de introns (splicing) para a formação de mRNAs maduros com mensagens contínuas. Alguns mRNAs maduros chegam a ser até dez vezes menores em tamanho que seus precursores.
 
TRADUÇÃO
Afinal, qual é o destino dos RNAs na bactéria? A verdade é que a vida média de um mRNA bacteriano é muito curta, raramente ultrapassando 60 segundos. Por que? Temos que ter em mente que a “vida" de uma E. coli dura meia hora. Neste intervalo ela passa por profundas transformações metabólicas. Por isso, um mRNA só é necessário por breves instantes, sendo em seguida descartado. Em eucariotos, contudo, os mRNA podem ter vida média muito mais longa. Os demais RNAs também tem uma vida média curta, porém bem maior que a dos mRNA pois são necessários de uma forma mais homogênea ao longo do ciclo de vida da bactéria. O “turn over” (substituição de uma molécula por outra mais nova) é um fenômeno geral e está relacionado com a instabilidade termodinâmica de qualquer estrutura a nível molecular.  
No caso dos mRNA de procariotos, a sua degradação é controlada por um processo engenhoso. A transcrição e a tradução estão de tal forma acopladas que, imediatamente após a síntese de um pequeno trecho de mRNA, os ribossomos já se ligam a este RNA nascente, protegendo-o da degradação pelas RNases bacterianas. O acoplamento da transcrição com a tradução é uma característica dos procariotos. Nos eucariotos o transcrito primário do DNA que dará origem a um mRNA é feito no núcleo, enquanto o mRNA e traduzido no citoplasma (recentemente um grupo de pesquisadores mostrou que pode haver tradução no núcleo! veja Iborra et al., Science 293:1139, 2001). A figura a seguir mostra o acoplamento da transcrição e da tradução.
Representação esquemática do acoplamento entre a transcrição e a tradução em procariotos.
 O processo de tradução se inicia pela ligação da sub-unidade menor do ribossoma a um sítio (sequência) específica no mRNA chamado RBS (ribosome binding site). Esta ligação é mediada, provavelmente, pelo pareamento de uma sequência do rRNA 16 S (que faz parte da composição da sub-unidade leve) com a sequência de Shine-Delgarno (ou RBS). À sub-unidade menor acopla-se, então, o primeiro tRNA (sempre para formil-metionina, em E. coli), e o conjunto desliza pelo mRNA até encontrar o códon AUG (identificado pelo anticódon correspondente no tRNA). Mais uma vez, é necessário um ajuste preciso da posição de início da leitura do mRNA pelo ribossoma. Para cada mRNA existem potencialmente três diferentes quadros de leitura (já que as bases são lidas em trincas), porém só um quadro de leitura é correto. Pode parecer estranho que uma sub-unidade aberta (sem o acoplamento prévio da outra), junto com um tRNA para formil-metionina, seja necessária para encontrar o códon de início da síntese proteica. Mas, se ponderarmos sobre a questão, veremos que o tRNA sozinho não poderia se ligar ao códon de iniciação, pois ele apenas reconhece um códon AUG (ou GUG) e desta forma se ligaria a qualquer uma destas trincas, em qualquer quadro de leitura, ao longo do mRNA. A sub-unidade leve, por sua vez, não tem como reconhecer o códon AUG, mas "sabe" onde é a sequência RBS e determina, assim, que a primeira trinca AUG abaixo de seu sítio de ligação será o início da síntese protéica. Então, fica claro que a associação das duas moléculas, tRNA e sub-unidade leve do ribossoma, é imprescindível.
Ao conjunto sub-unidade menor/ tRNA, já na posição exata para início da síntese proteica, liga-se, então, a sub-unidade maior, completando o ribossoma. O ribossoma tem formada, assim, uma cavidade P (à esquerda, no desenho), onde está o tRNA com a formil-metionina, e uma cavidade A, ainda vazia, a sua direita, aguardando a chegada do próximo tRNA transportando o aminoácido correspondente ao códon apresentado no fundo da cavidade. Quando isto acontece uma reação química (ligação peptídica) ocorre entre o primeiro aminoácido e o segundo, transferindo desta forma o primeiro para se ligar ao segundo, que permanece pelo seu lado ligado ao seu tRNA. O primeiro tRNA, agora ocupando a cavidade P do ribossomo, está descarregado. O ribossomo então desloca-se no mesmo sentido que já vinha fazendo, descartando assim o tRNA vazio (provisoriamente alojado numa cavidade E, que significa exit), posicionando o segundo tRNA com os dois aminoácidos a ele aderidos na cavidade P e liberando a cavidade A para receber um novo tRNA carregado. O processo se repete até que um sinal de terminação seja encontrado. Neste caso o ribossoma espera não um tRNA mas uma proteína conhecida como fator de terminação, que se liga no sítio A ao códon de terminação, desestabiliza o ribossomo e interrompe irreversivelmente a síntese. Há vários fatores proteicos chamados fatores de iniciação e fatores de alongamento que colaboram neste processo. Como as técnicas em genética molecular raramente lançam mão da síntese proteica in vitro, não nos deteremos mais neste assunto. O leitor é convidado a consultar os livros-texto sugeridos ou qualquer outro bom livro que trate do assunto a nível molecular (Bioquímica,Lehninger; p. ex.). A figura a seguir ilustra o mecanismo de síntese proteica em procariotos.
Neste modelo do processo de tradução há um sítio E ( “empty” = vazio), onde se aloja o tRNA descarregado antes de sair do ribossomo.Estão representados os diversos fatores que participam do processo de tradução, além do ribossoma e dos tRNAs. Para uma descrição do processo, cf. texto acima.
 Novamente, em eucariotos a complexidade do processo de transcrição/ tradução é consideravelmente maior. Isto se dá por duas razões: primeiro, os genes eucariotos costumam ser interrompidos por sequências que não codificam aminoácidos. Estas sequências, chamadas introns, e as sequências que serão empregadas pelo ribossoma (ou para formar tRNA ou rRNA) são transcritas para um longo RNA, chamado transcrito primário, ou ainda RNA heterogêneo nuclear. Deste transcrito primário têm que ser retirados os introns, o que é feito por um processo enzimático chamado “splicing” (lê-se “spláicin). Além disso o pré-mRNA ainda sofre outras alterações, como a adição de uma cauda poliA na extremidade 3´ e de um “cap" 7-meti guanosina na extremidade 5´ antes de se tornar um mRNA e poder passar ao citoplasma, onde será traduzido.
O splicing de RNA é catalizado pelo spliceossomo, formado pelas snRNP (pequenas ribonucleoproteinas nucleares) U1, U2, U5 e U4/U6, além de outros componentes, não representados na figura. Na primeira etapa do slicing o nucleotídeo ramificado A, próximo ao sítio de splicing 3’, ataca o sítio 5’ de splicing e corta o RNA.  A extremidade 5’ resultante fica ligada covalentemente ao A. Na segunda etapa, a extremidade 3’ do exon da esquerda, deixada livre na etapa anterior, ataca o sítio de splicing 3’ do intron, clivando o lariat (laço) e unindo os dois exons. O mecanismo de splicing mostrado acima é essencialmente igual para todos os mRNAs eucariotos que contenham um intron.  A figura a seguir mostra a forma com que o transcrito primário do gene para a ovalbumina de galinha é processado para gerar um mRNA maduro.
A figura mostra a remoção organizada de 7 introns necessários para a obtenção do mRNA de ovalbumina maduro, a partir do transcrito primário. Os sítios de splicing nas posições 5’ e 3’  estão representados pelas letras D e A (doador e aceptor, respectivamente).
PROCESSAMENTO
Após a transcrição, o RNA resultante é chamado de transcrito primário. Os transcritos primários de RNA mensageiro (mRNA), em procariontes, sofrem pouco ou nenhum processamento após sua síntese e, em geral, são traduzidos ainda durante a sua produção. Entretanto, nos eucariotos, o transcrito primário necessita de algumas alterações para adquirir maior estabilidade e caracterizar a molécula de RNA que irá para o citoplasma ser traduzida. O conjunto dessas alterações necessárias é chamado de processamento do RNA.
O RNA transportador (tRNA) e o RNA ribossômico (rRNA), ao contrário do mRNA procariótico, são gerados por quebras e outras alterações dos transcritos recém-sintetizados. De uma única cadeia nascente de RNA contendo regiões espaçadoras podem ser produzidas, por exemplo: três tipos de moléculas de rRNA e uma de tRNA, vários tipos de tRNA ou, até mesmo, várias cópias de um mesmo tRNA - sendo isso determinado pela seqüência do transcrito.
Entre outras modificações pós-transcricionais possíveis, podemos citar a adição de nucleotídeos aos términos das cadeias de RNA e a alteração de bases e de unidades de ribose dos RNAs. É comum em procariontes a adição da seqüência terminal CCA à ponta 3' de tRNAs e a metilação de algumas bases do rRNA, já em eucariontes o que normalmente ocorre é a metilação da hidroxila 2' de uma a cada cem unidades de ribose do rRNA.
Todas as moléculas de tRNA apresentam bases incomuns (ribotimidilato, pseudo-uridilato, etc.) formadas por alteração enzimática de um ribonucleotídeo padrão no tRNA precursor. Nos eucariontes, o processamento do transcrito primário que leva a formação do tRNA maduro inclui a clivagem da seqüência líder ou inicial 5'; o splicing ou processamento de introns; a substituição do terminal 3' UU por CCA e a modificação de várias bases.
O processamento de tRNAs é bem conservado entre as espécies de eucariontes, sendo a especificidade das enzimas de splicing mantida  ao longo da evolução. O gene de uma levedura, por exemplo, pode ser transcrito e processado por Xenopus, um anfíbio.
O processamento dos mRNAs em eucariotos é realizado em três etapas principais:
	
	Adição do cap 5';
	
	Splicing;
	
	Adição da cauda de poliadenilato;
Na figura a seguir você pode ver um esquema sobre processamento do RNA.
TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
Separando fragmentos de DNA: eletroforese em gel
 
Como vimos no item anterior, os fragmentos de DNA formados com a ação das enzimas de restrição possuem tamanhos diferentes. A técnica de separação dos fragmentos de DNA mais utilizada é a eletroforese através de géis de agarose. 
A agarose é um polissacarídeo (como ágar e pectina) que dissolve em água fervente e então gelifica quando esfria como a gelatina. Para realizar uma eletroforese, um gel de agarose é preparado, o DNA é introduzido em pequenos poços de gel, e então uma corrente elétrica é aplicada através do gel. Como o DNA é negativamente carregado, ele é atraído pelo eletrodo positivo. Entretanto, para chegar ao eletrodo positivo, o DNA deve migrar através do gel de agarose. 
Os fragmentos de DNA menores podem migrar através de um gel de agarose mais rapidamente que os fragmentos de DNA maiores. A velocidade de migração de fragmentos de DNA lineares através da agarose é inversamente proporcional a log10 de seus pesos moleculares.
É possível calcular o tamanho exato de um dado fragmento com base na sua razão de migração. Após a eletroforese em gel, os fragmentos de DNA normalmente são corados com brometo de etídeo, que possui afinidade pelo DNA e fluorece (torna-se visível) vivamente em contato com a luz ultravioleta. Dessa forma pode-se localizar as bandas que correspondem ao DNA. Os fragmentos de DNA podem, então, ser isolados e purificados a partir dos géis de agarose.
DNA RECOMBINANTE
Cada fragmento de DNA, que foi clivado e separado do resto do material genético, contém um ou mais genes. Lembre-se que cada gene origina uma proteína, portanto ao estudarmos o gene estamos estudando a proteína que ele codifica.
Mas o que devemos fazer para estudar o gene?
Devemos introduzi-lo no material genético (no DNA) de um hospedeiro para que ocorra a transcrição do gene, em mRNA, e a tradução em proteína.
O hospedeiro é um organismo que se multiplica (se reproduz) rapidamente, como por exemplo, as bactérias. Quando as bactérias se reproduzem por bipartição elas transmitem ao seus “filhos” o seu material genético, portanto se neste material conter o fragmento de DNA de estudo, em pouco tempo teremos milhões de bactérias com o gene.
O plasmídio é o material genético circular não ligado ao cromossomo que fica espalhado pelo hialoplasma das bactérias. Ele sofre o mesmo processo do DNA cromossomal de transcrição e tradução, além de, se multiplicar a cada divisão celular, passando uma cópia para cada célula “filha”.
 
O plasmídio é retirado das células bacterianas para que se possa inserir o gene de estudo, para depois recolocá-lo na bactéria.
Para entendermos melhor vamos conhecer esse processo passo a passo (acompanhe na figura):
Os pesquisadores querem estudar um gene humano que produz uma proteína que não se sabe a função.
Os pesquisadores “recortam” (utilizando enzimas de restrição), do DNA humano, o gene de interesse.
Esse fragmento de DNA contendo o gene é multiplicado por PCR para obtermos várias cópias do mesmo fragmento (ou da mesma informação).
A mesma enzima que clivou o gene do DNA humano é utilizada para clivar o plasmídio bacteriano. Lembre-se que o fragmento de DNA, ao ser clivado, gera pontas adesivas que são complementares ao plasmídio se este for clivado com a mesma enzima.
A seguir o plasmídio clivado é misturadocom os fragmentos de DNA (contendo o gene) e uma enzima chamada ligase “cola” os fragmentos ao plasmídio, produzindo o chamado DNA recombinante. Isso feito, o DNA recombinante é introduzido em uma bactéria hospedeira.
A bactéria hospedeira é colocada em um meio nutritivo seletivo, apenas aquelas que possuem o DNA recombinante crescem, formando colônias. Após muitas gerações de bactérias, o produto da expressão dos genes, as proteínas humanas, são purificadas das bactérias (são separadas das proteínas das bactérias).
PCR em tempo real - o sistema Taqman
Recentemente foi desenvolvido um sistema pela empresa Applied Biosystems (fundida com a Celera na atual Applera), para detectar o produto do PCR à medida em que esta vai sendo sintetizado na reação. O engenhoso sistema é baseado no uso de uma sonda, dirigida contra uma região interna da sequência que se deseja amplificar, e que tem dois fluorocromos, um em cada extremidade da sonda (um DNA fita simples). Na extremidade 5´ há um fluorocromo que só fluoresce se estiver distante fisicamente do fluorocromo na posição 3´. Este segundo fluorocromo funciona como capturador de energia (quencher) e não deixa com que a energia luminosa usada para excitar a sonda chegue em quantidade suficiente para excitar o primeiro fluorocromo. Estes dois fluorocromos estão representados como R e Q (para quencher). Quando o primer hibridiza na região 5´, a sonda também o faz no meio da sequência. À medida em que a Taq polimerase avança sintetizando a  fita nova, ela vai degradando a sonda à sua frente, liberando o fluorocromo R da sonda e permitindo que absorva energia e emita luz. A energia para a excitação dos fluorocromos provem de um feixe de laser que atravessa a amostra e o equipamento que faz isto chama-se PCR em tempo real (real time PCR) ou Taqman. A figura abaixo esclarece este princípio.
A medição da radiação é feita pelo aparelho, que taça um gráfico com a absorção obtida após cada ciclo de PCR. O ciclo em que o patamar (limite) de negatividade é ultrapassado está diretamente relacionado à quantidade de DNA molde na mistura. Com isto, a quantificação de DNA molde passou a ser não apenas possível, mais rápida. O sistema ainda é bastante dispendioso mas tenderá a se tornar mais barato à medida em que novos sistemas entrarem no mercado e um maior número de máquinas for disponível.
Sequenciamento de DNA
Até meados da década de 70 não era nada simples obter uma sequência de DNA, fosse ele fita simples ou dupla. De fato, trabalhar com DNA era muito mais complicado do que com proteínas e o conhecimento sobre os ácidos nucléicos avançava de forma lenta. No início da década de 80 uma técnica relativamente rápida de sequenciamento de DNA foi desenvolvida, que empregava a quebra de uma cadeia de DNA com diferentes produtos químicos e a visualização dos fragmentos gerados por eletroforese. Havia necessidade de fazer-se a marcação radiativa das moléculas porque a quantidade de material produzida era muito pequena e não podia ser detectada de outra forma. Mesmo com todas estas dificuldades houve então um rápido progresso no conhecimento de sequências de DNA. Poucos anos depois um novo avanço tecnológico foi alcançado pela introdução da técnica de interrupção da sequência pela incorporação aleatória de um nucleotídeo modificado (sem a hidroxila na posição 3´), que ficou conhecida como técnica de didesoxi ou dideoxi. Esta técnica suplantou imediatamente a anterior e permitiu o desenvolvimento de sequenciadores automáticos de DNA, sobre os quais versa este capítulo. Ainda se faz eventualmente o sequenciamento manual, mas é muito mais trabalhoso, caro e arriscado, pois emprega substâncias radiativas. De uma forma geral quando desejamos saber uma sequência de bases de um fragmento qualquer de DNA, purificamos o fragmento e enviamos para sequenciamento numa empresa prestadora deste serviço.
Mas, afinal, como produzir um DNA para sequenciamento e do que se trata a técnica de dideoxi?
A primeira parte da pergunta é crucial: de fato, se queremos sequenciar um trecho de DNA, temos que ter uma grande quantidade dele no nosso tubo de ensaio. Duas formas corriqueiras de se obter grandes quantidades de uma determinada sequência de DNA são a clonagem em plasmídeo e a PCR. Se o DNA que queremos sequenciar for o inserto de um plasmídeo, tudo o que precisamos é crescer 200 microlitros da bactéria com o plasmídeo e, empregando as técnicas já usuais de extração de DNA, obter o plasmídeo purificado, que será empregado na reação de sequenciamento.  Se ainda não tivermos o material clonado, podemos empregar a PCR e amplificar o trecho a ser sequenciado, purificando a banda do gel e usando o material assim obtido para iniciar a reação do sequenciamento. Neste caso, precisamos saber apenas as sequências das extremidades do trecho a ser sequenciado. 
A segunda parte da pergunta exige uma explicação mais detalhada.
Inicialmente, temos que recordar o que seja um didesoxinucleotídeo trifosfasto, ou ddNTP.  O precursor normal da síntese de DNA é o dNTP, ou desoxiribonucleotídeo trifosfato, que apresenta uma hidroxila na posição 3´. É a partir desta hidroxila que a fita nascente é estendida. Um ddNTP, entretanto, não tem esta hidroxila. Logo, se for incorporado a uma fita de DNA, interrompe a incorporação de outros nucleotídeos a partir dele. Se o ddNTP for marcado associado à radiação ou fluorescência, a fita interrompida ficará radiativa ou fluorescente e poderá ser detectada mais facilmente. Para fins desta aula vamos admitir que cada didesoxibase está marcada com uma florescência diferente. Portanto, as fitas terminadas em A, T, G ou C vão emitir cores diferentes quando excitadas com luz de um determinado comprimento (em geral, de um feixe laser).
Em seguida temos que entender como a reação de sequenciamento pode começar sempre exatamente da mesma base, a partir do DNA molde que adicionamos à reação. Para tal, basta recordarmos que uma nova fita simples só é sintetizada se tivermos um DNA molde, uma DNA polimerase, dNTPs (e neste caso, um pouco de ddNTPs fluorescentes) e, finalmente, um primer! É neste primer que reside o segredo do início exato da reação de extensão: o primer sempre pareia exatamente na posição esperada, jamais uma base antes ou uma depois, por exemplo. Por isso, todas as fitas estendidas a partir deste primer iniciam rigorosamente na mesma base, a partir do primer e copiando a fita molde.
Por fim, basta recordarmos que as fitas assim produzidas devem ser muito numerosas para poderem ser detectadas. Por isso, temos que começar a reação de sequenciamento com muito mais DNA do que uma reação de PCR. As fitas produzidas podem ser separadas pelo tamanho em eletroforese de poliacrilamida, e a base final da sequência da fita identificada pela fluorescência emitida quando a banda eletroforética correspondente à fita cruza o ponto do gel que é iluminado por um feixe de laser. Neste sistema de detecção a eletroforese não pára, as bandas passando no fim (em baixo) do gel é que são detectadas em movimento. Com isto, podemos identificar com precisão 600 a 700 bases a partir do primer.
Na figura abaixo exemplificamos como surgem as fitas simples estendidas a partir de um primer (seta preta pequena) que pareia com uma sequência específica (em vermelho) do plasmídeo (trechos em amarelo), no qual foi clonado um inserto (azul) entre os sítios de restrição EcoRI e XhoI. Observe que o inserto pode ter um comprimento muito variável, tipicamente entre 500 e 3000 pb. No exemplo estamos admitindo que, numa determinada posição na sequência do inserto, uma parte dele tem uma base A e outra uma base G. É o que ocorre se clonarmos um trecho de DNA de um alelo para o qual o doador é heterozigoto.  Observe também que, do lado direito do inserto, há uma sequência (em verde) na qual pode parear um outro primer, que será empregado no sequenciamento quando quisermos vir da direita para a esquerda sobre o inserto. Jamais, contudo, os dois primers são empregados simultaneamente, e por isto a reaçãode sequenciamento NÃO É UMA PCR!!! Por isso, não temos tanta preocupação com contaminação como nas reação de PCR: podemos fazer múltiplas reações de sequenciamento, lado a lado, numa placa de 96 micropoços e mesmo reutilizar boa parte do material plástico empregado no preparo do DNA ou na reação de sequenciamento, em si, bastando para isto lavar bem o material.
Ainda na figura, podemos ver que fragmentos de diferentes tamanhos são gerados, porém nunca (exceto no caso onde houver moldes de DNA com polimorfismo de base, como no caso A/G mostrado) dois fragmentos de igual tamanho terminarão em bases diferentes. Na parte de baixo da figura todos os fragmentos representados na parte de cima estão organizados por ordem de tamanho. Observe que:
a) podem existir muitos fragmentos (fitas simples estendidas a partir do primer) do mesmo tamanho, mas fatalmente terminarão na mesma base (exceto no caso do polimorfismo do DNA molde);
b) podem existir fitas terminado na mesma base (afinal, só temos 4 opções, A,T,G ou C!), com comprimentos diferentes. Não há qualquer restrição para isto.
c) há espaços mostrados na sequência, onde não havia nenhum fragmento gerado do tamanho esperado. Isto só acontece quando a reação gera poucos fragmentos, mas uma reação deste tipo gera centenas de milhares de fragmentos de cada tamanho e é muito pouco provável que existam sequências não representadas de um comprimento qualquer.
d) apenas onde há polimorfismo de base do DNA molde há fragmentos do mesmo tamanho terminando em bases diferentes (é o caso A/G).
Fragmentos de diferentes comprimentos gerados a partir do primer, interrompidos quando um didesoxinucleotídeo é incorporado na fita. Os didesoxinucleotídeos são marcados com substâncias fluorescentes diferentes, conforme a base (A,T,G ou C).
 
Quando os fragmentos gerados numa reação de sequenciamento são separados por eletroforese, os fragmentos menores vão à frente, seguidos dos demais, sendo a distância entre as bandas aproximadamente igual, pois representa sempre a diferença de uma base a mais ou a menos. A figura 8.2 mostra esquematicamente como esta separação acontece e como a fluorescência nas bandas é identificada, à medida em que elas atravessam um trecho do gel que é iluminado por um feixe laser (representado pela barra verde na parte de baixo do gel).  Observe que a distância entre as bandas é regular. Um gel pode permitir o sequenciamento de 600-700 bases para cada reação, e podemos correr até 96 reações por gel. Há no mercado também sequenciadores de DNA de última geração nos quais o gel foi substituído por um feixe de capilares, que são automaticamente preenchidos por um polímero, ao invés de gel. Cada reação de sequenciamento é separada no seu capilar e a fluorescência detectada individualmente. o que evita uma eventual confusão entre sequências causada pelos desalinhamentos das corridas eletroforéticas, comum nos géis. Há máquinas com feixes de 1 a 384 capilares. As maiores são capazes de produzir mais de 2 mil sequências em 24 horas.
Os fragmentos de diferentes comprimentos migram no gel, os menores na frente. São iluminados por um feixe de laser e fluorescem quando atravessam a janela do feixe. Um gel pode resolver 96 sequências simultaneamente. Os géis têm sido substituídos por capilares preenchidos de polímero nas máquinas mais modernas. As bandas pretas indicam ausência de material e são apenas um recurso gráfico usado aqui para indicar o espaço aumentado entre bandas que aconteceria neste caso. Entretanto, isto não ocorre na reação de sequenciamento finalizada, porque o número de fragmentos gerados é muito grande e a probabilidade de uma classe de tamanho não ser representada na reação é praticamente nula.
A fluorescência emitida pela passagem de uma banda pela janela de medição é registrada por um sistema de microcâmaras sensoras, que por sua vez transforma o sinal num gráfico, conhecido como eletroferograma. Os picos representam as bandas, e quanto mais altos e agudos mais qualidade têm, isto é, maior será a probabilidade de que a base registrada seja correta. O valor de qualidade é medido por um programa chamado Phred, que leva em conta vários parâmetros (espaçamento entre bandas, largura e altura do pico, intensidade absoluta do sinal, ruído de fundo, etc). Geralmente emprega-se como padrão aceitável de qualidade o valor Phred 20, que corresponde a aprox. 99% de certeza da base indicada. A figura 8.3 abaixo mostra um eletroferograma obtido no sequenciamento de um inserto de cDNA do parasita Leishmania chagasi. Observe que, neste trecho, a qualidade do sequenciamento é muito alta, com espaçamento regular dos picos (que indica espaçamento regular das bandas) e picos agudos. Não há nenhum polimorfismo de bases, nem poderia haver, pois esta sequência foi obtida a partir de um clone de cDNA.
Eletroferograma parcial de uma sequência de DNA obtida no sequenciador automático ABI3100 Prism, da Applied Biosystems, na Unidade de Genômica do Laboratório de Genética Molecular do Departamento de Genética da UFPE. Observe que os picos são agudos e regularmente separados, o que indica alta qualidade do sequenciamento neste trecho.
Clonagem gênica
         Criar seres novos têm sido, por bilhões de anos, o privilégio da Natureza, através do processo contínuo de mutação e seleção natural e por outros mecanismos de alteração do DNA que agora começam a ser compreendidos. Mas a humanidade sempre "criou" seus próprios seres, geralmente extraordinários. Os gregos eram particularmente imaginativos, e a mitologia clássica é cheia de monstros como a Quimera, o cão Cérbero, o Minotauro, a Medusa e um sem-número de outros híbridos. Como se verá mais adiante, a palavra quimera foi tomada de empréstimo na mitologia para designar as construções artificiais de moléculas (em geral DNA). Inicialmente a imaginação do homem atribuía a algum deus a geração dos seres monstruosos ou, ao contrário, extraordinariamente belos. A idéia de que estes seres podiam ser fabricados por um ser humano só veio muito depois, mas em várias partes do mundo os homens criaram "protocolos"  para a geração de vida a partir de material "morto", desde simples insetos até o próprio ser humano. A partir do meio do século XVIII a ciência começou a mostrar a verdadeira face da criação e a esclarecer a origem das ossadas que eram em parte o combustível para a imaginação dos homens naquele tempo: a vida só podia ser criada a partir da vida e os ossos imensos ou estranhos achados em toda a parte eram de seres extintos, mas que tinham sido produto da Natureza, como todos os demais.
            Ainda assim, alguns seres exóticos mais "queridos"  da humanidade permaneceram por todo o século XVIII e boa parte do século XIX e alguns passaram "vivos" pelo século XX até hoje! O unicórnio "viveu"  feliz por todo o século XVIII, as serpentes marinhas monstruosas alcançaram a metade do século XX e os duendes e fadas estão muito bem de saúde, "vivendo" entre nós, civilizados. Os lobisomens e vampiros andam mais desacreditados, mas sempre se deve esperar um retorno triunfal, às custas do cinema ou de um livro, lançados por bons marqueteiros...
            Entretanto, a criação de híbridos de verdade é muito mais difícil do que insinua o cinema ou pensam as pessoas, porque a maior parte das espécies têm algum tipo de restrição para o cruzamento com uma espécie diversa. Na melhor das hipóteses o híbrido costuma ser estéril. Esta é a regra entre animais. Os híbridos entre vertebrados, por exemplo, são raros, e quando ocorrem, em geral são estéreis. É o caso da mula e do burro, híbridos de cavalos e jumentos. Entre plantas, contudo, a obtenção de híbridos é muito mais fácil e uma enorme fração das plantas que hoje cultivamos é produto de cruzamento entre duas ou mais espécies.
            Uma abordagem mais simples à produção de novas formas de vida (ao menos em teoria) é a clonagem de genes de um organismo e a transfecção destes para outro organismo. A vantagem desta abordagem é que se pode selecionar da espéciedoadora apenas as marcas que interessam, evitando a introdução de genes indesejados. Adicionalmente, ela permite (também em teoria...) total controle sobre a construção final, contornando as recombinações que a Natureza produz durante a reprodução sexuada (entre indivíduos da mesma espécie ou não).
            Clonar genes parece simples a princípio, mas as ferramentas para cortar DNA e "emendar"  os fragmentos com um vetor (DNA que se replica e que desta forma conserva o pedaço "emendado" nele, chamado inserto) não eram conhecidas até o meio da década de 70.
1.Primeiros passos
         As primeiras tentativas de clonagem de genes foram feitas no fim da década de 70 com um vírus que infecta células de primatas (inclusive seres humanos): o SV40 (simian virus 40). Este vírus é capaz de entrar na célula do mamífero e em alguns casos integrar-se ao DNA cromossômico, em qualquer lugar do genoma. Ao sair, ocorre muitas vezes uma excisão anômala, e o vírus deixa no genoma da célula hospedeira uma parte de si, levando, ao contrário, um pequeno segmento do genoma da célula do primata. Ao invadir uma nova célula, o segmento transportado insere-se num outro ponto do DNA da célula hospedeira, totalmente diverso do que estava antes. Este procedimento embaralha o genoma e pode, ao acaso, produzir uma construção interessante, mas é muito grosseiro para permitir um avanço concreto no campo da clonagem. Adicionalmente, o SV40, assim como o fago l, do qual falaremos em outra aula, e vários outros vírus, têm uma limitação séria quanto ao tamanho de inserto que podem carregar, pois devem ser encapsulados para sair de uma célula e invadir a outra, e o volume do capsídeo não comporta muito mais DNA do que o que é normal no vírus. Desta forma, vetores virais empacotados em capsídeos devem ser previamente engenheirados de forma a que se retire um certo número de genes dispensáveis in vitro, fazendo espaço para mais bases do inserto.
       Como não havia uma forma simples e precisa de cortar DNA numa sequência ou posição específicas, produzindo segmentos de extremidades conhecidas, era impossível unir de forma eficiente um segmento de DNA de doador com as extremidades de um vetor (viral ou plasmidial, como veremos mais adiante). A falta desta tesoura molecular restringiu durante anos o avanço da nascente "engenharia genética", nome que a mídia deu ao que se chama nos meios acadêmicos de tecnologia do DNA recombinante. Além disso, o fato de todos os primeiros vetores de clonagem terem sido vírus que infectam o homem fez da engenharia genética uma tecnologia de alto risco. As legislações foram, compreensivelmente, duríssimas no princípio, com uma opinião pública inteiramente desfavorável, como ocorre hoje com a questão da clonagem de mamíferos. O cuidado era, contudo, muito importante. Apesar de todo cuidado, e um pouco antes das tentativas de se fazer engenharia genética de forma sistemática e abrangente, o SV40 acabou sendo o protagonista de uma infecção acidental de milhões de pessoas, através da vacina de poliomielite, nas décadas de 50 e 60. A infecção pelo SV40 não provocou, até onde se pode saber, qualquer problema de saúde nos indivíduos infectados, apesar de potencialmente ser possível a ação direta do vírus no organismo ou através de sua recombinação in vivo com o S2, um vírus humano.
            A legislação evolui bastante à medida em que a engenharia genética tornava-se mais segura. Paralelamente, a ciência da Biossegurança emergiu da união entre conceitos de biologia e de direito, resultando num corpo de normas e diretrizes bastante coerente, que se atualiza continuamente através de workshops, congressos e outros encontros técnicos entre especialistas do mundo todo (para detalhamento consulte o site da CTNBio - Comissão Técnica Nacional de Biossegurança)
CICLO CELULAR
Fase G0
A maioria das células que compõe os organismos multicelulares encontra-se diferenciada para exercer funções especializadas, não sendo mais capaz de se dividir. Considera-se que estas células não estão “dormentes” de verdade, uma vez que estão ativamente envolvidas em atividades de síntese e secreção proteicas. Este estado é conhecido como fase G0. Os neurônios e as hemácias são tipos de células que se encontram permanentemente em G0 até que elas ou o organismo morram. Porém, existem células que se encontram nessa fase e devido a um dano no órgão retornam a G1, continuando o ciclo. Um exemplo são as células hepáticas.
Fase G1
Durante a fase G1 do ciclo celular, cada célula toma uma decisão fundamental: ou continua outro ciclo e se divide, ou permanece em um estado de não divisão temporário ou permanente. A fase G1 é tipicamente a fase mais longa e variável do ciclo celular. Se a quantidade de nutrientes disponível for insuficiente, ou se as células receberem estímulos anti-proliferativos, como, por exemplo, um sinal para entrar em diferenciação terminal, a progressão do ciclo poderá ser retardada em G1 ou a célula poderá sair do ciclo ou entrar em G0. A progressão através de G1 é regulada por 2 pontos de controle: o ponto de restrição e o ponto de checagem de danos do DNA em G1. Esses dois pontos de controle são perdidos em muitas células cancerosas. Assim, essas células continuam a se dividir, mesmo na ausência de sinais ambientais apropriados e em presença de DNA danificado.
Fase S
A duplicação do DNA na subfase S é um evento muito importante do ciclo celular, pois garante que as células-filhas possam receber uma cópia exata de cada molécula de DNA da célula parental. As células humanas diploides, por exemplo, tem 2n = 46 cromossomos; portanto, uma célula em G1 é constituída por 46 moléculas de DNA (uma molécula para cada um dos 23 pares de homólogos). Durante a fase S, cada molécula de DNA dá origem à outra idêntica a ela, de tal forma que, em G2, a célula humana contém 92 moléculas de DNA, sendo que um dos 46 cromossomos contém duas moléculas de DNA (denominadas cromátides-irmãs) que se mantém associadas por complexos proteicos denominados coesina. Essas células continuam diploides, tendo 2n = 46 cromossomos, embora com o dobro do conteúdo de DNA. As subfases S e G2 ocorrem somente em células que irão se dividir e, na maioria, têm duração relativamente constante, de sete a oito horas para S e de duas a cinco horas para G2. A duplicação de DNA na interfase pode ocorrer também em células que contém cromossomos politênicos e em células poliplóides.
A SÍNTESE DE DNA OCORRE NA FASE S DA INTERFASE
Ainda que a mitose constitua morfologicamente a etapa mais espetacular do ciclo celular, é na interfase que ocorre a duplicação dos componentes da célula-mãe, bem como, em especial, a duplicação do DNA, pré-requisito essencial para que a divisão ocorra. Esse processo pode ser estudado por meio do emprego de precursores radioativos, utilizando-se de métodos bioquímicos ou radiofármacos, ou por citofotometria.
Quando precursores radioativos do DNA, como a timidina tritiada (timidina-H³), são dados às células por poucos minutos e estas são então processadas para radioautografia, pode-se observar, ao microscópio óptico, que células em divisão não incorporam a timidina-H³. Por outro lado, células que estavam replicando o DNA no momento da exposição à timidina-H³ produzem a imagem radioautográfica de núcleos marcados, verificando-se que apenas algumas células em interfase estavam replicando seu DNA.
A observação, a intervalos de tempo fixos posteriores à exposição, para detectar o momento em que o bloco de células marcadas entra em mitose, permite demonstrar, entre outros aspectos, que as células terminam a replicação do DNA pelo menos 2h antes da mitose. Portanto, nas células eucariontes, a duplicação do DNA está situada em um período intermediário da interfase e não ocupa toda essa fase. Essa descoberta possibilitou a divisão 
da interfase em 3 períodos sucessivos, ou a divisão do ciclo em quatro fases distintas, que foram chamadas G1, S, G2 e M. No período S ocorre a duplicação ou síntese do DNA, daí o nome dessa fase. A abreviaturaG provém do termo inglês gap (intervalo). O período G1 é o intervalo de tempo que transcorre desde o fim da mitose (M) até o início da síntese de DNA (S), por isso é também considerado período pós-mitótico ou pré-sintético. O período G2 é o intervalo entre o término da síntese de DNA e a próxima mitose, também denominado período pós-sintético ou pré-mitótico. 
PERÍODO S
O início da síntese de DNA marca o início do período S e, na grande maioria dos casos, é um ponto de não retorno do ciclo, que leva necessariamente à divisão celular. Durante o período S, a célula duplica seu conteúdo de DNA, elaborando réplicas perfeitas das moléculas de DNA que contém. Esse processo denomina-se replicação. Toda célula eucarionte diploide inicia seu ciclo em G1 com uma quantidade de DNA igual e 2C. Durante o período S, essa quantidade duplica, passando de 2C para 4C, e assim permanece até a fase do ciclo em que é igualmente repartida para as duas células-filhas, as quais voltam a ter, novamente em G1, a quantidade 2C idêntica à da célula de origem.
A replicação do DNA em células eucariontes guarda estreito paralelismo com a replicação de células procariontes. Por isso, o mecanismo de duplicação do DNA tem sido estudado, de preferência, nas células mais simples, como a bactéria Escherichia coli. No entanto, ainda que os resultados obtidos nessa célula procarionte sejam, na essência, válidos também para as células eucariontes, o processo nos eucariontes é muito mais complexo. Células eucariontes têm um genoma enorme, que deve ser duplicado com alta fidelidade uma única vez a cada ciclo celular, e isso deve ser feito dentro de pouco tempo, nas poucas horas ocupadas pelo período S. Soma-se isso ao fato de que, em células eucariontes, o DNA nuclear apresenta-se na forma de fibras de cromatina, formando um complexo com proteínas histonas. Portanto, é a cromatina que deve sofrer duplicação no período S, o que exige que não só o conteúdo de DNA seja duplicado, mas também a quantidade de histonas. Contrariando o que acontece com todas as demais proteínas celulares, as histonas são as únicas proteínas cuja síntese está confinada à fase S, ocorrendo simultaneamente com a síntese de DNA.
É neste período também que os primórdios de novos centríolos (chamados pró-centríolos) são observados, formando-se perpendicularmente a cada membro do par de centríolos existentes nas células.
 
A REPLICAÇÃO DO DNA É SEMI-CONSERVATIVA
Com base na molécula de DNA proposto por Watson e Crick, o mecanismo básico de replicação envolve a separação das cadeias de DNA, obtida pelo desenrolamento da dupla hélice, seguido pela cópia de cada cadeia, que serve como um molde para a síntese de uma nova cadeia complementar. A sequência de nucleotídeos da nova cadeia é fixada pelas regras de pareamento de bases, propostas por Watson e Crick. O correto pareamento das bases assegura uma replicação acurada da dupla hélice original.
Durante a replicação, as duas fitas do DNA original, também chamadas de parentais, são copiadas, originando duas moléculas-filhas, cada qual com somente uma das fitas recém-sintetizada. Diz-se, portanto, que a replicação é semiconservativa. Assim, cada nova molécula de DNA é cópia perfeita de uma molécula preexistente.
A replicação semiconservativa do DNA pode ser estudada por radioautografia, utilizando-se timidina-H3. Pode ainda, ser estudada usando-se um análogo estrutural da timidina, a 5’-bromo-desoxiuridina, que se incorpora ao DNA em substituição àquela base, no momento da replicação. A presença desse análogo na molécula de DNA pode ser detectada pela coloração diferencial nas cromátides-irmãs em cromossomos que alcançam a segunda mitose após a incorporação.
CARACTERÍSTICAS GERAIS DA REPLICAÇÃO DO DNA
Uma análise detalhada da duplicação do DNA demonstrou que a incorporação de precursores marcados, seja timidina-H3 ou o análogo da timidina, bromo-desoxiuridina, não se dá ao mesmo tempo em todas as moléculas de DNA de um núcleo, e que dentro de uma molécula, existe um padrão determinado de sequência de síntese; por isso se diz que a duplicação do DNA é assíncrona. Dentro de um dado tipo celular, regiões específicas do material genético, ou genes individuais, começam e terminam sua duplicação em momentos definidos na fase S. A eucromatina, que constitui a cromatina geneticamente ativa, começa a replicar primeiro, fazendo-o desde o início da fase S, enquanto a heterocromatina geralmente é a última a replicar, no final do período S, sendo considerada, portanto, de replicação tardia.
A velocidade de duplicação do DNA é calculada em torno de 30 mm por minuto, na Escherichia coli, e de 0,5 a 2,0 mm por minuto (ou o mesmo que 3.000 bases/min) nos núcleos das células eucariontes dos vertebrados. Com essa velocidade, se o processo começasse por um extremo da molécula de DNA e terminasse no outro, o genoma dos vertebrados gastaria um tempo muito longo para a sua replicação. Calcula-se que seria necessário 1 mês para um cromossomo humano replicar. Mas, isso realmente não acontece, e foi possível demonstrar que, enquanto em células procariontes a molécula de DNA inicia a replicação em um único local, chamado origem de replicação, em células eucariontes existem múltiplas origens. Assim, essas células solucionaram o problema de replicar seu enorme genoma no curto espaço de tempo de S e superaram a baixa velocidade de sua replicação. O número de origens de replicação depende do organismo, do tipo celular e é regulado ao longo do desenvolvimento. Esse número pode ser de uma origem a cada 3 ou 300 kpb (3 mil ou 300 mil pares de bases). Como exemplo, em um cromossomo humano médio existem, pelo menos, 200 pontos de origem. Como muitos genes ativos replicam no início da fase S, é possível que o papel de origens de replicação específicas seja o de coordenar a replicação do DNA com a transcrição dos genes.
Células eucariontes, ao iniciarem a replicação em várias origens, apresentam então muitas unidades de replicação distribuídas ao longo do genoma, as quais se denominam réplicons. Em cada núcleo de mamífero existem 20.000 a 30.000 réplicons. As unidades de replicação que iniciam simultaneamente a síntese de DNA constituem as chamadas famílias de réplicons (em inglês, replicon clusters), e diferentes famílias destas iniciam em diferentes tempos.
Cabe ressaltar que, a cada fase replicativa, todas as unidades de replicação do genoma nuclear são replicadas e que cada réplicon replica somente uma vez, dentro de um único período S. Um complexo enzimático isolado de leveduras, chamado complexo de reconhecimento de origem (ORC, em inglês), liga-se às origens de replicação e sinaliza para que outras proteínas reguladoras venham a se ligar também. Entre estas proteínas, está um grande complexo proteico, o complexo pré-replicativo ou pré-RC. Quando o complexo pré-RC liga-se a uma origem de replicação, o complexo ORC é fosforilado e o processo de replicação é iniciado. Depois de corrida a replicação, o complexo pré-RC se desliga daquela origem de replicação, impedindo outra leitura da mesma origem.
 
A REPLICAÇÃO É BIDIRECIONAL
Uma vez iniciada a replicação em cada ponto de origem, ela se propaga para os dois lados da molécula de DNA, ou seja, em ambas as direções, até encontrar, em qualquer ponto, os extremos das cadeias em formação dos réplicons adjacentes. A esse movimento para lados opostos se denomina replicação bidirecional. Estudos radioautográficos ao microscópio eletrônico do cromossomo de E. coli em divisão mostraram que a incorporação de timidina-H³ ocorre principalmente onde os dois filamentos de DNA da dupla hélice se separam. Esses locais têm a forma da letra Y e são chamados de forquilhas de replicação. A replicação bidirecional envolve duas forquilhas que se movem em direções opostas.
A REPLICAÇÃO É SEMIDESCONTÍNUA
A radioautografia demonstra também que as duas cadeias parentais da dupla hélice vão, ambas, sendo replicadas em cada forquilha de replicação que avança. A enzima responsável pela polimerização dos desoxirribonucleotídeosna síntese do DNA, a DNA-polimerase, polimeriza somente na direção 5’-3’, e, então, ambas as cadeias-filhas devem ser sintetizadas na direção 5’-3’. Mas, os dois filamentos de DNA da hélice dupla são antipararelos, isto é, um deles tem a direção 5’-3’ e o outro a direção contrária.
Tomando como referência o sentido do movimento da forquilha de replicação, a cópia da cadeia parental 3’-5’pode ser sintetizada continuamente. Essa cadeia-filha que avança na direção 5’-3’, recebe o nome de cadeia líder ou cadeia contínua (em inglês, leading strand). A outra cadeia parental, 5’-3’ tem de ser copiada de um modo intermitente, descontínuo, por meio da síntese de uma série de fragmentos, que depois de unidos dão origem a uma cadeia denominada cadeia retardatária ou cadeia descontínua (lagging strand). Os fragmentos da cadeia descontínua receberam o nome de fragmentos de Okazaki e são cadeias curtas com um comprimento aproximadamente constante de 1000 a 2000 nucleotídeos de E. coli e de 200 a 300 nucleotídeos em células eucariontes.
A REPLICAÇÃO DO DNA É REALIZADA POR ENZIMAS
Tanto as células procariontes como as eucariontes têm enzimas denominadas DNA-polimerases (DNApol), capazes de sintetizar DNA a partir de seus precursores. Para catalisarem essa síntese, os precursores de DNA devem estar presentes sob a forma de trifosfatos de desoxirribonucleosídios ou desoxirribonucleotídios trifosfatados. Os quatro desoxirribonucleotídios trifosfatados necessários para a síntese de DNA são dATP, dCTP, dTTP e dGTP, contendo as bases adenina (A), citosina (C), timina (T) e guanina (G), respectivamente. Além de serem moléculas estruturais, esses desoxirribonucleotídeos proporcionam energia para a síntese dos novos filamentos de DNA, porque, enquanto são precursores, estão trifosfatados, mas quando incorporados na nova cadeia do DNA são apenas na forma de monofosfatos. A ruptura das ligações fosfato excedentes fornece a energia necessária para a síntese de DNA. Simultaneamente, fosfato inorgânico é liberado. Todas as DNA-polimerases descobertas até hoje obedecem às seguintes propriedades:
cada desoxirribonucleotídio a ser incorporado é selecionado de modo que sua base nitrogenada seja complementar e possa então parear com bases da cadeia molde, sempre fazendo pareamentos AT e GC. Portanto, a sequência de bases na nova molécula de DNA depende exclusivamente da sequência existente na molécula antiga;
o crescimento da cadeia sempre se dá na direção 5’-3’, ou seja, a enzima sempre adiciona um monofosfato de desoxirribonucleosídio (com o fosfato ligado ao carbono que ocupa a posição 5’ da pentose – C5’) a um C3’ livre de um nucleotídio preexistente;
DNA-polimerases não conseguem iniciar a síntese de novo, todas requerem um segmento inicial de nucleotídios (chamado primer) para dar continuidade à cadeia. Elas só conseguem alongar cadeias preexistentes, e não podem juntar dois desoxirribonucleotídios por meio da formação de uma ponte fosfodiéster inicial.
Em E. coli, a principal enzima na duplicação do DNA é a DNA-polimerase III (pol III), da qual existem apenas 10 moléculas por célula. A DNA-polimerase I (300 a 400 moléculas por célula) e a DNA-polimerase II (40 moléculas por célula) são mais abundantes na célula, uma vez que têm funções adicionais no processo de reparo do DNA ou como exonucleases, removendo nucleotídios já incorporados.
Células eucariontes apresentam, pelo menos, quatro DNA-polimerases localizadas no núcleo. As DNA-polimerases α e δ são responsáveis pela replicação do DNA nuclear e corresponderiam à polimerase III e E. coli. Durante a replicação do DNA nuclear, parece que essas duas enzimas, em uma conformação dimérica, exercem, exercem suas funções simultaneamente. Em função de suas características particulares, presumivelmente, a poli-δ replica a cadeia contínua enquanto a poli-α replica de maneira descontínua a outra cadeia a retardatária. A polimerase ε parece estar relacionada com os mecanismos de reparo, embora sua função precisa permaneça incerta. A quarta enzima de localização nuclear, a DNA-polimerase β é pequena e funciona no processo de reparo. Ainda existe a DNA-polimerase γ que é responsável pela replicação do DNA presente nas mitocôndrias.
 
OUTRAS ENZIMAS ESTÃO ENVOLVIDAS NA REPLICAÇÃO
Para que o processo de replicação ocorra, são necessárias muitas outras enzimas com funções específicas, além das DNA-polimerases.
Inicialmente é preciso desenrolar as voltas da dupla hélice de DNA para expor os moldes de cadeia simples á ação polimerase, problema mais complexo na cromatina das células eurariontes, mas também existente no DNA circular enovelado das células procariontes. O desenrolamento da dupla hélice é feito pela enzima helicase, que trabalha em cada forquilha de replicação, á frente da polimerase, desenrolando progressivamente as cadeias em ambas as direções. A ligação da helicase só ocorre após a ligação de uma proteína chamada de DnaA, que, inicialmente, causa a separação das cadeias nas origens de replicação. Como as duas cadeias de DNA da molécula original estão firmemente ligadas graças a numerosas pontes de hidrogênio entre suas bases.  O processo de desenrolamento envolve também a quebra das pontes de hidrogênio, para separar as duas cadeias da dupla hélice que vão ser copiadas. Nesse processo atua também a helicase, consumindo energia fornecida pelo ATP. A porção desenrolada de DNA deve ser então estabilizada, o que é feito com a participação de proteínas específicas, as proteínas SSP (Single strand proteins) que ao se ligarem às regiões de cadeias simples do DNA, mantém os filamentos separados, enquanto se processa a replicação. Essas proteínas impedem que as pontes de hidrogênio entre as bases se refaçam, depois de desfeitas pela helicase, evitam que essas regiões sofram torções, além de protegerem os filamentos simples da eventual degradação por nucleases.
Dadas as características da molécula de DNA, no entanto, o desenrolamento da dupla hélice no ponto de origem leva a um superenrolamento positivo do DNA mais adiante, e essas voltas adicionais na hélice ainda se acentuam mais a medida que a forquilha de replicação aumenta de tamanho. Para impedir que esse superenovelamento ocorra, entram em ação enzimas denominadas DNA-tropoisomerases, dentre as quais um dos tipos é conhecido como DNA-girase. Essas enzimas, para relaxarem o stresse contorcional imposto pelo desenrolamento, introduzem quebras, seguidas de reuniões das ligações fosfodiéster na molécula de DNA, suas ações também consomem energia fornecida pelo ATP.
Como mencionado anteriormente, as DNA-polimerases não conseguem iniciar a síntese de DNa sem o atuxílio de uma pequena sequência inicial ou primer, porque ela só é capaz de adicionar nucleotódios a um polinucleotídio preenxistente. Esses primers são seguntos curtos de RNA, com 1 a 60 nucleotídeos de comprimento, dependendo da espécie cuja sequencia é, naturalmente complementar à do DNA molde. Os primers que fazem parte dos pequenos fragmentos de Okazaki da cadeia descontínua sáo produzidos pela ação de uma RNA-polimerase especial, denominada primase. Nas células eucariontes, a atividade de primase está localizada em subunidades DNA-polimerase α, mas o primer para a cadeia geral, sintetizado pela RNA-polimerase que em geral sintetiza a RNA na transcrição. Nos dois casos, a DNA-polimerase catalisam a extensão do  primer, formando sempre na direção de 5´ para 3´ um filamento de DNA que contém de outras DNA-polimerases, que apresentam atividade exonuclease 5´, os primers de RNA são removidos e substituídos por desoxirrobonucleotídios. Os fragmentos agora completos são finalmente unidos por outra enzima, a DNA-ligase.
REPLICAÇÃO E REORGANIZAÇÃO DA FIBRA DE CROMATINA
Nas células eucariontes, como a DNA está ligado a protéin, constituindo a cromatina, não é a penas o DA que deve ser relicado na fase S, mas também nas histonas, como já mencionado. O processo replicativo envolve então a passagem do conjunto de enzimas da replicação através da molécula de DNA, quese apresenta organizada em nucleossomos. A fibra nucleossomicas certamente se se desorganiza durante essa passagem, mas ainda não se sabe se, nesse momento as histonas são completamente dissociadas do DNA. A montagem do DNA recém-duplicado em nucleossomos parece ocorrer logo atrás da forquilha de replicação de tal modo que, conforme esta avança a fibra nucleossômica vai sendo imediatamente reestruturada nas duas novas moléculas de DNA nascentes. Essa montagem é mediada por proteínas específicas que se ligam às histonas nucleossomicas e as transferem ao DNA, primeiramente, ocorrendo a associação dos tetrâmetros de histonas H3 e H4 seguida da associação de dímeros de H2A e H2B. Esses nucleossomos são formados tanto a partir de histonas recém-sintetizados em S como de histonas provenientes da desagregação de nucleossomos preexistentes, em uma combinação ao acaso.
CÉLULAS APRESENTAM MECANISMOS PARA MANTER INTEGRIDADE DO DNA
Apesar de complexa, a replicação do DNA é extremamente precisa, estimando-se que apenas um erro seja cometido na replicação de 108 bases. Essa precisão se dá principalmente a uma propriedade especial da DNA-polimerase: ela é capaz de conferir as bases, à medida que as adiciona ao novo filamento de DNA. Essa característica da enzima DNA-polimerase chama-se leitura de prova. A DNA-polimerase confere as bases adicionadas e remove imediatamente uma base errada, antes que a síntese do filamento de DNA continue. Seria como uma correção tipográfica em que a letra errado fosse corrigida antes de terminada a palavra inteira. No entanto, algumas bases incorretamente emparelhadas conseguem ainda assim, escapar dessa correlação de provas, e o DNA pode sair com defeitos dessa replicação, que não apresenta fidelidade absoluta.
Por outro lado, macromoléculas biológicas, são suscetíveis a alteração químicas que surgem de erros durante a síntese, ou mesmo de exposição a fatores deletérios do ambiente. O DNA sofre a ação de agentes físicos e de muitos agentes químicos, aguns produzidos normalmente na própria célula. Os raios cósmicos e outras radiações com muita energia podem causar lesões por atuação direta na DNA, como modificações nas bases ou ruptura da dupla cadeia. Também podem atuar indiretamente sobre o DNA, porque induzem o aparecimento de íons superóxido, quimicamente muito ativos. A radiação ultravioleta solar, embora tenha energia muito menor, também pode causar alterações como a formação de dímeros de timinas adjacentes na cadeia de DNA.
As células apresentam vários sistemas gerais para proteger seu DNA e outras moléculas. Os íons superóxido, por exemplo, são destruídos pela enzima superóxido-desmutase. Os íons H+ são neutralizados pelos sistemas reguladores do equilíbrio ácido-base e as oxidações intracelulares são reduzidas por diversos sistemas redutores, como o NADPH2 a glutationa e vitamina E.
Os danos causados ao DNA são particularmente graves porque o DNA constitui o material genético que contém todas as informações para a estrutura e para a atividades celulares. As alterações do DNA de uma célula somática são transmitidas às células filhas, podendo formar-se um clone de células modificadas. Quando as alterações do DNA ocorrem em uma célula germinativa (óvulo, espermatozoide out respectivos precursores) podem passar para as gerações futuras dos organismos atingidos, sendo seus efeitos ainda mais prejudiciais para a espécie. Em função dessa importância, além de ter alta fidelidade no processo de sua síntese o DNA é a única molécula que se danificada, pode ser reparada pela célula.
Os mecanismos de reparo são muito diversificados e, assim, a eficiência aumenta diante do tipo de lesão presente no DNA.
O reparo do DNA danificado é feito em duas fases: a primeira específica para cada tipo de defeito, e a segunda, de natureza geral, igual em todos os casos. A primeira fase é a identificação da alteração e a remoção das partes defeituosas da molécula. Essa fase vale-se de mecanismos diversos para identificar os diferentes defeitos e cortar, por meio de endonucleases (enzimas que cortam pedaços da parte central da molécula de DNA) o seguimento de DNA errôneo Na segunda fase, o segmento removido é substituído por um seguimento correto de DNA. De fato quando se colocam as células em presença de um precursor radioativo de DNA, com a timidina- H3, observa-se que ele é incorporado nas células interfásicas principalmente o período S, mas também, uma pequena incorporação é detectada ao longo de períodos não sintéticos, provavelmente relacionados com esses processos de reparo do DNA, que exigem determinado nível de síntese.
A importância biológica do reparo do DNA pode ser avaliada tanto pela quantidade de genes envolvidos no processo como pelas consequências em organismos que possuem células incapazes de reparar seu DNA. Exemplo do primeiro caso são as células da levedura que tem mais de 50 genes diferentes, cujos produtos participam do processo de reparo do DNA.
Fase G2
A fase G2 corresponde ao intervalo entre o fim da replicação do DNA (fase S) e o começo da mitose. A duração da fase G2 depende do tipo de célula, podendo durar entre 2 a 4 horas. Corresponde à fase mais curta em período de tempo dentre as demais fases da intérfase. Nesta fase continua a síntese de proteínas iniciada em G1 , de RNA, de proteínas não-histônicas que se associam ao cromossomo durante a condensação na mitose, de outras moléculas necessárias para que ocorra a mitose, bem como ocorre a duplicação dos centríolos e demais organelas constituintes do citoplasma. Todo esse processo resulta em aumento de volume e tamanho celular.
De acordo com estudos recentes, a fase G2 ganhou mais atenção por estar envolvida com o câncer e com os eventos bioquímicos que promovem a transcrição para a mitose. Essa transição que acontece durante a fase G2 até a mitose é a mudança fisiológica e morfológica, sendo controlada por proteínas quinases e fosfatases que vão estimular e/ou inibir o complexo Cdk1-ciclina B1, conhecido como fator promotor da mitose – MPF (Figura 1).
Dentre as várias funções da Cdk1, podemos citar sua capacidade de se ligar aos co-fatores ciclina e a moléculas inibitórias, além de inibir ou ativar por fosforilação mudanças na localização celular. As células também possuem ciclinas que são essenciais para desencadear a transição da fase G2 para a mitose. A ciclina B é sintetizada na fase S e acumula-se no citoplasma, que por meio da importina β é transportada para o núcleo.
O MPF é o regulador geral da transição da fase G2 para a mitose, além de ser o responsável por eventos típicos da mitose como a condensação cromossômica, a ruptura do envoltório nuclear, a montagem do fuso e a degradação da proteína ciclina.
A família de proteínas fosfatase Cdc25 é regulada por fosforilação estimulatória e inibitória, bem como alteração de sua localização subcelular.  A ativação de Cdc25B ativa a Cdk1-ciclina A, que inicia a prófase mitótica, iniciada com mudanças na dinâmica dos microtúbulos e na condensação dos cromossomos.
No núcleo, ocorrem dois eventos que preparam a célula para a mitose.  Um desses eventos é a fosforilação da Cdc25C pelas quinases, tornando-a ativa e impedindo sua saída do núcleo. O outro é a fosforilação da ciclina B por outras quinases, promovendo rápido acúmulo da Cdk1-ciclina B. A Cdc25C ativa o MPF por meio da desfosforilação de seus sítios inibitórios – T14 e Y15 (Figura 2).
 
Ao final de cada fase, as ciclinas específicas são marcadas pela proteína ubiquitina, sinalizando à célula para degradá-las por complexos protéicos (proteossomos).
 CHECKPOINT G2 (PONTO DE CHECAGEM)
Na fase G2, é necessário que a célula tome uma decisão importante: se é ou não seguro progredir para a mitose e separar as cromátides irmãs. A separação das cromátides irmãs constitui-se em um ponto de potencial de risco para uma célula. Se o DNA sofrer danos depois da replicação, a célula pode utilizar a informação presente na cromátides irmãs (que teriam uma das cópias boa e a outra ruim) para guiar o processode reparo. Entretanto, uma vez que as cromátides irmãs tenham se separado, um mecanismo de correção como este é impossível. Além disso, se uma célula progredir para a mitose antes de completar a replicação dos cromossomos, a tentativa de separar as cromátides irmãs resulta em extenso dano cromossômico. Para minimizar e até mesmo anular estes riscos, a célula utiliza um importante ponto de checagem na etapa final da fase G2, para cessar o ciclo se o DNA estiver danificado ou se a replicação do DNA tiver sido incompleta.
O ponto de checagem envolvem três tipos de componentes: os sensores, as quinases e os efetores. Quando ocorre dano no DNA, os sensores são ativados e detectam este dano; em resposta, ativam as proteínas quinases, que são especializadas em promover respostas e transmitir esta informação a uma série de moléculas efetoras. Os efetores então, bloqueiam de forma direta ou indireta a progressão do ciclo celular.
Determinadas situações como aumento ou diminuição de alguns sinalizadores de nutrientes informam à célula sobre as condições favoráveis ou não para a divisão celular. Por exemplo, o aumento da concentração de AMPK (adenosine monophosphate activated protein kinase) sinaliza à célula que há escassez de ATP, ou seja, não há condições favoráveis para prosseguir. Outra proteína não menos importante é a mTOR (mammalian target of rapamycin), proteína-chave na regulação da síntese de outras proteínas essenciais. A ativação da mTOR favorece a progressão do ciclo.
Não havendo dano no DNA após sua replicação ou qualquer outra condição que impeça a progressão do ciclo celular, e se a célula apresentar ambiente e tamanho favoráveis à sua divisão, então ela está preparada à seguir para a próxima fase, a mitose.
ONCOGENESE
As células que constituem os animais são formadas por três partes: a membrana celular, que é a parte mais externa; o citoplasma (o corpo da célula); e o núcleo, que contêm os cromossomas, que, por sua vez, são compostos de genes. Os genes são arquivos que guardam e fornecem instruções para a organização das estruturas, formas e atividades das células no organismo. Toda a informação genética encontra-se inscrita nos genes, numa "memória química" - o ácido desoxirribonucleico (DNA). É através do DNA que os cromossomas passam as informações para o funcionamento da célula. 
Uma célula normal pode sofrer alterações no DNA dos genes. É o que chamamos mutação genética. As células cujo material genético foi alterado passam a receber instruções erradas para as suas atividades. As alterações podem ocorrer em genes especiais, que quando ativados transformam-se em oncogenes, responsáveis pela malignização (cancerização) das células normais. Essas células diferentes são denominadas cancerosas. 
O que é oncogênese?
Oncogênese ou carcinogênese é o processo de formação de câncer, que em geral se dá lentamente, podendo levar vários anos para que uma célula cancerosa prolifere e dê origem a um tumor visível. Esse processo passa por vários estágios antes de chegar ao tumor. São eles: 
Estágio de iniciação
É o primeiro estágio da carcinogênese. Nele as células sofrem o efeito dos agentes cancerígenos que provocam modificações em alguns de seus genes. Nesta fase as células se encontram, geneticamente alteradas, porém ainda não é possível se detectar um tumor clinicamente. 
Estágio de promoção
É o segundo estágio da carcinogênese. Nele, as células geneticamente alteradas sofrem o efeito dos agentes cancerígenos. A célula é transformada em célula maligna, de forma lenta e gradual. Para que ocorra essa transformação, é necessário um longo e continuado contato com o agente cancerígeno promotor. A suspensão do contato com agentes promotores muitas vezes interrompe o processo nesse estágio. Alguns componentes da alimentação e a exposição excessiva e prolongada a hormônios são exemplos de fatores que promovem a transformação de células iniciadas em malignas. 
Estágio de progressão
É o terceiro e último estágio e se caracteriza pela multiplicação descontrolada e irreversível das células alteradas. Nesse estágio o câncer já está instalado, evoluindo até o surgimento das primeiras manifestações clínicas da doença. 
Defesa do organismo
No organismo existem mecanismos de defesa naturais que o protegem das agressões impostas por diferentes agentes que entram em contato com suas diferentes estruturas. Ao longo da vida, são produzidas células alteradas, mas esses mecanismos de defesa possibilitam a interrupção desse processo, com sua eliminação subseqüente. A integridade do sistema imunológico, a capacidade de reparo do DNA danificado por agentes cancerígenos e a ação de enzimas responsáveis pela transformação e eliminação de substâncias cancerígenas introduzidas no corpo são exemplos de mecanismos de defesa. Esses mecanismos, próprios do organismo, são na maioria das vezes geneticamente pré-determinados, e variam de um indivíduo para outro. 
Sem dúvida, o sistema imunológico desempenha um importante papel nesse mecanismo de defesa. Ele é constituído por um sistema de células distribuídas numa rede complexa de órgãos, como o fígado, o baço, os gânglios linfáticos, o timo e a medula óssea, e circulando na corrente sangüínea. Esses órgãos são denominados órgãos linfóides e estão relacionados com o crescimento, o desenvolvimento e a distribuição das células especializadas na defesa do corpo contra os ataques de "invasores estranhos". Dentre essas células, os linfócitos desempenham um papel muito importante nas atividades do sistema imune, relacionadas às defesas no processo de carcinogênese. 
Cabe aos linfócitos a atividade de atacar as células do corpo infectadas por vírus oncogênicos (capazes de causar câncer) ou as células em transformação maligna.