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Universidade Estadual Paulista Instituto de Biociências Departamento de Botânica Caixa Postal 510 - 18618-000 - Botucatu, SP - Fone (014) 6802-6053 / 6802-6265 - Fax (014) 6821-3744 CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS ÁREA DE BOTÂNICA Disciplina de Princípios e Métodos em Anatomia de Plantas TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DE MATERIAL VEGETAL PARA ESTUDO ANATÔMICO Profa. Dra. Denise Maria Trombert de Oliveira Botucatu - SP 2002 2 OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de Biociências, 2001. 19p. (Apostila). 1. COLETA DE MATERIAL VEGETAL Devem ser tomados alguns cuidados no momento da coleta, visando à obtenção de bons resultados no processamento do material. O cuidado mais importante é evitar o murchamento do material. Caso o local de coleta seja próximo do local de processamento, não haverá problemas, especialmente se a coleta for realizada logo no início da manhã. Se o local de coleta é distante ou é necessário coletar nos períodos mais quentes do dia, deve-se levar um saco plástico borrifado com água fresca e colocar o material nele logo após coletar. O saco plástico forma uma câmara úmida que favorece a conservação do material. Se a coleta for feita durante viagens, o ideal é levar o fixador e fixar o material no campo, imediatamente após coletá-lo. 1.1. COLETA DE RAÍZES E OUTROS ÓRGÃOS SUBTERRÂNEOS: deve-se escavar em torno da planta e retirar a terra que envolve o material somente com água, de modo a não alterar sua estrutura. A PLANTA NUNCA DEVE SER ARRANCADA. 1.2. COLETA DE ÁPICE CAULINAR: por ser uma região de tecidos muito delicados, está mais sujeita a danos por murchamento e transporte. O melhor é coletar pela manhã e colocar rapidamente no fixador adequado. Deve-se observar bem o ápice antes da coleta, para evitar coletar material que não esteja intacto. 1.3. COLETA DE FOLHAS: as folhas carnosas e as coriáceas são mais resistentes que as folhas herbáceas e membranáceas. De qualquer modo, o melhor é coletar um pequeno ramo e não folhas isoladas, quando se precisa transportar o material. 1.4. COLETA DE FLORES: Deve-se coletar sempre verificando se a flor está completa; é comum haver a queda de certas partes (especialmente anteras), tanto por senescência quanto por acidente. Como o ápice caulinar, é um material muito delicado e deve ser fixado imediatamente. Também deve ser verificado o horário da antese: existem flores que só se abrem em determinados horários do dia, devendo ser coletadas nesse período. Botões florais podem ser coletados em qualquer horário, com os devidos cuidados contra murchamento; devem ser feitas pequenas aberturas ou fendas, para permitir a penetração do fixador e evitar que o material flutue na solução fixadora. 1.5. COLETA DE FRUTOS E SEMENTES: no caso de frutos maduros de pericarpo seco e sementes sem estruturas carnosas, a coleta pode ser feita em sacos plásticos ou de papel, com pequenos furos. Se forem frutos maduros de pericarpo carnoso, sementes com OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 3 porções carnosas, ou frutos e sementes imaturos, devem ser tomados os mesmos cuidados para a coleta de folhas. 2. FIXAÇÃO “The only reliable control upon „good‟ fixation is the normal structure of the living cell.” (I. W. Bailey, 1930) A fixação é etapa necessária na maioria dos trabalhos, especialmente quando o objeto de estudo encontra-se longe do laboratório. Essa etapa deve ser muito bem executada, pois um material mal fixado só será descoberto no final do processamento, ocasionando perda de material de consumo e de tempo. Para ajudar na penetração dos fixadores, este processo deve ser feito com passagem em bomba a vácuo. Dependendo do material, a substituição do fixador pelo etanol a 70% (solução de estocagem) também deve ser feita a vácuo. Existem vários fixadores, cada um indicado para um tipo de material e de estudo: 2.1. FAA (JOHANSEN, 1940): é o fixador mais utilizado para material vegetal. É uma mistura de etanol 50% ou 70% com ácido acético glacial e formalina (concentração final de formol = 2%). O material vegetal deve ser cortado em pequenos pedaços (de preferência com menos de 1 cm). O material deve permanecer no fixador por um período que varia de 18 (no mínimo) a 48 horas (no máximo), sendo depois desidratado e conservado em etanol 70%. Caso o material seja estocado no FAA, pode ocorrer plasmólise das células fixadas. (Observação: segundo JENSEN (1962), a fixação com FAA pode ser feita no período mínimo de 4 horas e o material pode ser estocado nesta mistura indefinidamente. A experiência tem mostrado, contudo, que não é aconselhável este procedimento, prevalecendo a indicação anterior). Preparo do FAA: para 100ml do fixador: 90ml de etanol a 50% (ou a 70%) 5ml de ácido acético glacial 5ml de formalina (formaldeído a 40%) OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 4 2.2. BOUIN (JOHANSEN, 1940): fixador tradicional para muitas técnicas zoológicas, é usado com eficiência para preservar materiais delicados, como ápices e peças florais. O material deve permanecer no fixador por 24 horas. Como o fixador é preparado em solução aquosa, antes do processo de desidratação deve-se proceder à lavagem do material em água destilada, que elimina resíduos do fixador. A desidratação pode começar com etanol a 50%; para materiais mais delicados, deve-se começar no etanol a 20%, já que a desidratação mais gradativa minimiza a alteração dessas estruturas. Para conservar, desidratar até etanol a 70% e estocar). Preparo do BOUIN: para 100ml do fixador: 75ml de solução aquosa saturada de ácido pícrico 25ml de formalina (formaldeído a 40%) 5ml de ácido acético glacial 2.3. MISTURA DE KARNOVSKY (KARNOVSKY, 1965): mistura à base de glutaraldeído e paraformaldeído em tampão fosfato, indicada para fixar material delicado, que exija preservação do conteúdo celular. O material deve ser cortado em fragmentos muito pequenos (cerca de 5mm, por causa da lentidão de penetração dessa mistura) e fixado por aproximadamente 24 horas, sendo depois conservado em etanol a 70%. Preparo da Mistura de Karnovsky: para 500ml de fixador (manter em geladeira; melhor misturar as soluções no momento de utilizar, mas a mistura se mantém estável por aproximadamente uma semana): 100ml de solução de paraformaldeído a 4% 150ml de tampão fosfato 0,2M (pH=7,2) 250ml de solução de glutaraldeído a 1% em tampão fosfato 0,1M (pH=7,2) 2.4. FIXADOR PARA TANINOS (JOHANSEN, 1940): na página 193, Johansen recomenda aplicar aos fragmentos que se deseja fixar uma solução aquosa contendo 3 a 5% de formalina e 10% de sulfato ferroso, mantendo por 24 a 48 horas. Após esse período, lavar com água destilada, desidratar e incluir em parafina. Seccionar os blocos, OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 5 distender os cortes, remover a parafina e montar em meio resinoso (Permount, por exemplo). O ferro presente na solução tanto fixa quanto cora os taninos de marrom. O mesmo Johansen, contudo, na página 107, recomenda preparar o fixador misturando-se 2g de sulfato ferroso + 10ml de formalina + 90ml de água destilada. Na prática, verifica-se que essas variações de proporção nãosão relevantes. Também deve ser acrescentado que o material fixado pode ser conservado em etanol a 70% por período indeterminado antes da inclusão, que pode ser feita tanto em parafina quanto em historresina. Em ambos os casos, não se faz nenhuma coloração antes da montagem, de modo que são observadas com a coloração marrom as células que contêm taninos e todo o restante fica descolorido. Existem muitas outras fórmulas fixadoras, usadas em casos mais específicos. Atualmente, no entanto, têm sido utilizados com maior freqüência a FAA e a mistura de Karnovsky. Maiores detalhes são apresentados nos livros básicos de microtécnica vegetal, citados ao final desta apostila. 3. TIPOS DE PREPARAÇÕES 3.1. PREPARAÇÕES TEMPORÁRIAS: montagens rápidas, de material fresco ou fixado, destinadas à análise imediata, pois não se conservam. * PROCEDIMENTO: faça os cortes a mão livre, com lâmina de barbear nova, utilizando ou não um suporte (medula de embaúba ou isopor, por exemplo). Coloque os cortes entre lâmina e lamínula, usando uma gota de água como meio de montagem. Observe. * TESTES HISTOQUÍMICOS: as preparações temporárias podem ser utilizadas para a realização de testes destinados à localização e detecção de várias substâncias. Os testes rotineiramente utilizados são qualitativos, importantes para a compreensão do material em estudo. Preferencialmente, os testes devem ser feitos em material fresco, mas bons resultados são obtidos também com material fixado em FAA ou na mistura de Karnovsky (o que pode ocorrer é que os componentes dos fixadores lavem os compostos das células rompidas – o que se resolve descartando os primeiros cortes - e diminuam o conteúdo de certas células, produzindo reações menos evidentes). A maior parte dos testes também produz bons OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 6 resultados em cortes preparados a partir de material incluído em historresina, lembrando contudo, que os cortes finos conterão pequenas quantidades dos compostos que se deseja detectar (testes com ácidos não funcionam nestes cortes). Podemos destacar os testes para: a) AMIDO (JOHANSEN, 1940): coloração azul escura a preta. - Tratar os cortes com Lugol. Observar imediatamente. Preparo do Lugol: dissolver 1,5g de iodeto de potássio em 100ml de água destilada. Dissolver 0,3g de iodo cristalino na solução resultante. - Observação: caso haja acúmulo de amilóides nas paredes celulares (em alguns cotilédones carnosos, por exemplo), estas aparecerão coradas de azul com a aplicação do Lugol. b) SUBSTÂNCIAS LIPÍDICAS (JOHANSEN, 1940): gotículas de óleo, cutícula, camadas de cera, paredes suberificadas: - Colocar os cortes em contato com solução de Sudan III ou IV (glicerinado ou não). Pode-se observar imediatamente, mas a reação se intensifica dentro de aproximadamente 20 minutos. A reação pode ser acelerada com rápido e cuidadoso aquecimento da lâmina. Preparo do Sudan IV: Preparar uma solução saturada de Sudan IV em 50ml de etanol 70%. Se desejar uma fórmula menos volátil, adicionar 50ml de glicerina. - Observação: Para melhor observação da reação, Johansen sugere que se mantenha os cortes no corante por 20 minutos, lave com etanol a 50% para remover o excesso do Sudan (rapidamente, pois o álcool é solvente de substância lipídicas e pode remover o conteúdo celular se ficar tempo maior que o necessário) e observe em glicerina. Melhora muito a qualidade da preparação, especialmente para fotomicrografias. c) ALEURONA (JOHANSEN, 1940): os cristalóides ficam amarelos, os globóides não se colorem e a massa fundamental fica vermelha. - Fazer os cortes e não colocá-los em água. Tratá-los com solução saturada de eosina (ou de nigrosina) e ácido pícrico em etanol absoluto. Observar imediatamente. d) CRISTAIS (JOHANSEN, 1940): verificação de sua composição química. OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 7 - Tratar os cortes com ácido acético concentrado. Se o cristal se dissolver, a composição é CARBONATO DE CÁLCIO. - Tratar outros cortes com ácido sulfúrico diluído (5 a 10%). Se o cristal se dissolver, a composição é OXALATO DE CÁLCIO. - Observação: Se houver grande quantidade de oxalato de cálcio, após a adição do ácido poderão formar-se novos cristais de sulfato de cálcio, semelhante a agulhas. e) TANINOS - COMPOSTOS FENÓLICOS (JOHANSEN, 1940): coloração azul esverdeada. - Tratar os cortes com solução aquosa de cloreto de ferro (III) a 10%, acrescida de uma pitada de carbonato de sódio. Observar em seguida. f) ANTOCIANINA - COMPOSTO FENÓLICO (GURR, 1956): em meio ácido, a antocianina é vermelha; em meio básico, varia de azul violeta a verde. - Observe os cortes ao microscópio e localize as células de conteúdo avermelhado. Continue observando e coloque uma gota de solução de amônia. Analise outra lâmina e coloque uma gota de ácido acético glacial. - Observação: Segundo JOHANSEN (1940), acrescentando-se ao corte do órgão com antocianina uma pequena gota de ácido acético glacial, a antocianina será extraída do tecido e evapora, formando vários tipos de cristais avermelhados. g) PAREDES LIGNIFICADAS (JOHANSEN, 1940): coloração vermelho forte. - Colocar os cortes em solução de floroglucina a 2% em etanol 95% e deixar evaporar um pouco. Acrescentar 2 a 3 gotas de ácido clorídrico concentrado. h) PAREDES CELULÓSICAS OU LIGNIFICADAS (JENSEN, 1962): paredes com grande quantidade de celulose ficam azuis, celulose com pectina fica arroxeada, celulose com lignina, cutina, suberina ficam amarelas ou alaranjadas. - Tratar os cortes com cloreto de zinco iodado. Preparo do Cloreto de zinco iodado: dissolver 50g de cloreto de zinco e 16g de iodeto de potássio em 17ml de água destilada. Acrescentar um excesso de iodo cristalino e OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 8 deixar em repouso por alguns dias. Recolher o sobrenadante em frascos âmbar e guardar em geladeira. - Observação: O’BRIEN e McCULLY (1981) chamam a atenção de que esta não é uma coloração específica: resultados positivos não necessariamente indicam celulose, assim como os negativos não atestam definitivamente sua ausência. i) SUBSTÂNCIAS PÉCTICAS (JOHANSEN, 1940; JENSEN, 1962): coloração rósea. - Tratar os cortes de material fresco ou fixado com solução aquosa de vermelho de rutênio (1:5000). Deixar os cortes em contato com a solução por alguns minutos. Alguns tipos de MUCILAGEM também apresentam resultado positivo com essa solução. - Observação: Johansen apresenta um procedimento para remoção de substâncias pécticas para se usar como controle deste teste (p.201). j) CALOSE (JENSEN, 1962): coloração azul. - Tratar os cortes com solução aquosa de azul de anilina por alguns minutos (o tempo de reação é variável), observando a seguir em água ou glicerina. Preparo da solução de azul de anilina: 0,5g de azul de anilina, dissolvidos em 50ml de água destilada. k) SAPONINAS (JOHANSEN, 1940): coloração final azul (muda ao longo do tempo). - Tratar os cortes com uma gota de ácido sulfúrico concentrado, observando imediatamente a seqüência de reação pelas cores: amarelo, imediatamente; vermelho em cerca de 30 minutos, passando a violeta ou azul-esverdeado em poucos instantes. 3.2. PREPARAÇÕES SEMI-PERMANENTES: são montagens de material fresco ou fixado, que podemser guardadas por curtos períodos de tempo (de alguns meses até cerca de 2 anos, em melhores condições; dependendo do meio de montagem e das condições de armazenamento das lâminas, mantêm-se úteis de 3 até 5 anos). * PROCEDIMENTO: Faça os cortes a mão livre, em micrótomo de Ranvier ou em micrótomo de congelação. A montagem é sempre feita entre lâmina e lamínula, usando-se glicerina pura ou gelatina glicerinada como meio de montagem (preferencialmente esta última, que permite OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 9 que as lâminas sejam guardadas verticalmente). Quando se pretende conservar a lâmina por um período maior de tempo, é recomendável lutar a lamínula com esmalte de unhas. Preparo da gelatina glicerinada: dissolver a quente 14g de gelatina em pó sem sabor em 70ml de água destilada, acrescentando 100ml de glicerina e, ao final, 5g de fenol em cristais. Filtrar ainda quente para tubos de ensaio com tampa de vidro esmerilhada e conservar, depois de frio, em geladeira. * MONTAGEM SEM COLORAÇÃO: Produza cortes finos e bem orientados e monte entre lâmina e lamínula sem nenhum processamento. Esta preparação preserva, por poucos dias, a coloração original do material. * MONTAGENS COM COLORAÇÃO: podem ser usadas várias associações duplas de corantes, como safranina e verde firme, azul de astra e fucsina, safranina e azul de astra, vermelho congo e verde iodo, etc. * Método do vermelho congo e verde iodo (DOP & GAUTIÉ, 1928): - Selecione os cortes; - Clareie em solução de hipoclorito de sódio a 20% da solução comercial - 20 min. - Lave com água acética a 1% - 3 vezes. - Lave com água destilada - 1 vez. - Coloque a solução aquosa de Verde-iodo 1% - de 1 a 3 min. - Lave em água destilada - 2 vezes. - Coloque a solução aquosa de Vermelho-congo 1% - de 5 a 10 min. - Lave com água destilada - até sair o excesso de corante. - Proceda à montagem. Observação: para se preparar os dois corantes, usar água aquecida (50ºC) e filtrar em lã de vidro. Resultado: paredes celulósicas coram-se de vermelho e paredes lignificadas coram-se de verde. Com o tempo, tende a diminuir o contraste da coloração. OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 10 * Coloração pelo método da Safranina e Azul de Astra - Safrablau (BUKATSCH, 1972; BURGER & RICHTER, 1991): - Selecione os cortes. - Clareie com Hipoclorito de sódio a 20% da solução comercial - 20 min. - Lave com água acética - 3 vezes. - Lave com água destilada - 1 vez. - Coloque a solução de Safrablau – 1 a 3 min. - Lave com água destilada - até eliminar todo o excesso de corante. Resultado: paredes celulósicas coram-se de azul pelo Azul de Astra e paredes lignificadas coram-se de vermelho pela Safranina. Preparo do Safrablau: Solução A: 1g de safranina dissolvida em 100ml de água destilada aquecida a 50ºC e filtrada em lã de vidro. Solução B: 1g de azul de astra dissolvido em 100ml de água destilada e filtrado em lã de vidro. Agitar cada solução por 5 a 7 minutos. Juntar 10ml da solução A a 90ml da solução B, acrescentando 2 gotas de ácido acético à mistura. 3.3. PREPARAÇÕES PERMANENTES: São preparações de material fresco ou fixado, devidamente desidratado e corado, montado em resina sintética, que lhe confere resistência e durabilidade por tempo indeterminado. Também são consideradas permanentes, as lâminas preparadas com impressão em cola. 3.3.1. PREPARAÇÕES PERMANENTES UTILIZANDO IMPRESSÕES: Os estudos da epiderme dos diversos órgãos exigem, além dos tradicionais cortes transversais e longitudinais, os cortes paradérmicos. Dependendo do objetivo do trabalho, estes últimos cortes podem ser substituídos por impressões das epidermes realizadas com cola, produzindo réplicas da estrutura. Este tipo de preparação presta-se muito bem aos estudos morfométricos de células epidérmicas, bem como às contagens, por exemplo para determinação de índice estomático. a) Cola do tipo "Super Bonder": Em uma lâmina limpa e seca, coloque uma pequena gota da cola. Pegue a folha, também lavada e seca, e pressione-a sobre a gotinha de cola. O tempo OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 11 vai depender da quantidade de cola colocada, devendo ser a folha retirada antes que fique aderida à lâmina. b) Cola para Aeromodelismo: Prepare a lâmina, colocando sobre ela uma gota de água destilada. Pegue a folha, limpa e seca, e espalhe uma camada homogênea da cola sobre uma pequena superfície (uma gotinha da cola). Espere secar e, com auxílio de uma pinça, retire a película formada pela cola. Vire-a e distenda sobre a lâmina, de modo que a superfície da película que estava em contato com a folha fique voltada para cima. Com papel de filtro, retire o excesso de água. 3.3.2. PREPARAÇÕES PERMANENTES UTILIZANDO CORTES A MÃO LIVRE, EM MICRÓTOMO DE RANVIER OU EM MICRÓTOMO DE CONGELAÇÃO: faça vários cortes e selecione os melhores, colocando-os em uma placa de petri pequena. Pode ser utilizado material fresco ou fixado; se fixado, deve-se verificar a graduação alcoólica do fixador e reidratar a material, através de passagem por série alcoólica decrescente, antes de seguir. Siga os seguintes itens: a) Coloque em solução de hipoclorito de sódio a 20% da solução comercial - 20 min. (ou o tempo e a concentração necessários para clarificar os cortes). b) Lave com água acética – 3 vezes. c) Lave com água destilada - até desaparecer todo o cheiro. d) Coloração e montagem: podem ser usados diversas associações de corantes, como: * COLORAÇÃO PELO MÉTODO DO VERDE-RÁPIDO E SAFRANINA (SASS, 1951): - Coloque os cortes lavados em solução aquosa de safranina - de 1 a 12 horas, dependendo do material (se tem muitos elementos lignificados, 1 hora é suficiente). - Lave com água destilada - até sair o excesso de corante. - etanol 30% - 5 min. - etanol 50% - 5 a 10 min. - etanol 70% - 5 a 10 min. - etanol 95% - 5 a 10 min. - Solução de Verde-rápido em etanol 95% - 5 a 30 seg. - etanol 100% - 5 a 10 min. (repetir 3 vezes este item). - óleo de cravo - 5 a 10 min. OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 12 - Xilol - etanol (1:3) - 5 min. - Xilol - etanol (1:1) - 5 min. - Xilol - etanol (3:1) - 5 min. - Xilol puro - 5 min. (duas vezes). - Proceda à montagem usando Bálsamo do Canadá, Permount ou Entelan. Após a secagem, as lâminas podem ser guardadas pelo tempo que se desejar. Resultado: paredes celulósicas coram-se de verde e paredes lignificadas coram-se de vermelho. Formando-se na lâmina uma mancha fosca em torno do corte, é sinal de que a desidratação (passagem pela série alcoólica) não foi bem feita. Neste caso, deve repetir toda a montagem, deixando mais tempo em cada etanol. * COLORAÇÃO PELO MÉTODO DO AZUL DE ASTRA E FUCSINA (ROESER, 1972): - Coloque os cortes lavados em solução aquosa de azul de astra - 5 min. - Lave com água destilada - até sair o excesso de corante. - Coloque em solução de fucsina básica em etanol 50% - 15 a 30 min. - Lavar em água destilada - até lavar o excesso do corante. - Imergir em solução saturada de ácido pícrico - colocar na solução e verter imediatamente. - etanol 70% - lavar rapidamente. - etanol 100% - 3 min. (repetir 3 vezes este item). - Xilol - etanol(1:3) - 5 min. - Xilol - etanol (1:1) - 5 min. - Xilol - etanol (3:1) - 5 min. - Xilol puro - 5 min. (duas vezes). - Proceda à montagem usando Bálsamo do Canadá, Permount ou Entelan. Após a secagem, as lâminas podem ser guardadas pelo tempo que se desejar. Resultado: paredes celulósicas coram-se de azul e paredes lignificadas coram-se de roxo. Preparo do Azul de Astra: dissolver 0,5g de azul de astra em 30ml de água destilada a 50ºC e 2,0g de ácido tartárico em outros 30ml. Juntar as soluções, completando o volume para 100ml com água destilada. Preparo da Fucsina Básica: dissolver 0,5g de fucsina básica em 100ml de etanol 50%. Filtrar em lã de vidro. OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 13 3.3.3. PREPARAÇÕES PERMANENTES UTILIZANDO CORTES EM MICRÓTOMO ROTATÓRIO: para esse tipo de montagem, deve-se usar material fixado. Resumidamente, a técnica consiste em desidratar o material fixado (utilizando-se série alcoólica crescente), substituir gradualmente o álcool por um ou mais solventes do meio de inclusão (xilol e clorofórmio são os mais utilizados para inclusão em parafina; para incluir em historresina, o solvente é o próprio álcool), infiltrar no meio de inclusão, incluir e cortar ao micrótomo rotatório. São assim obtidos cortes mais finos do material. A seguir, estes devem ser distendidos sobre lâmina limpa, a qual, após a secagem, será devidamente corada e montada (Permount, Entelan, Bálsamo do Canadá). Atualmente, o meio mais utilizado para inclusão de material vegetal é a historresina, pela facilidade com que se obtém cortes mais finos e pela maior rapidez de elaboração do laminário. A) PROCESSO DE DESIDRATAÇÃO E INCLUSÃO EM HISTORRESINA: Para se proceder à inclusão em historresina, deve-se seguir as orientações do fabricante do kit que estiver utilizando (cada kit contém um frasco de resina, um catalisador e um endurecedor). * DESIDRATAÇÃO: - Etanol 70% - 2 horas (Se estiver armazenado neste álcool, iniciar pelo seguinte) - Etanol 90% - 2 horas - Etanol 100% - 2 horas - Etanol 100% + resina líquida (1:1) - 2 horas - Resina ativada = solução de infiltração (resina + pó ativador, na proporção indicada pelo fabricante. Se for o kit JB-4 da Polysciences, para cada 100ml da resina líquida, acrescentar 0,9g do pó ativador) - até o dia seguinte (mínimo = 12 horas, mas há materiais que precisam de dias infiltrando – quanto maior a peça, maior o tempo necessário para a infiltração se proceder), em temperatura ambiente. Se a temperatura ambiente for elevada, infiltrar em geladeira. - No dia seguinte: preparar a solução de inclusão, juntando o endurecedor à resina de infiltração ou resina ativada (Se for o kit JB-4 da Polysciences, para cada 25ml da resina ativada, acrescentar 1ml do endurecedor). Colocar os fragmentos vegetais infiltrados em OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 14 histomoldes (formas plásticas, próprias para inclusão, ou formas de gelo. Peças maiores devem polimerizar recobertas por filme plástico), orientando-os adequadamente. Deixar polimerizar em temperatura ambiente ou em estufa a 37ºC. * MICROTOMIA: incluído o material, deve-se proceder à microtomia. Utiliza-se um micrótomo rotatório, definindo-se a espessura de corte desejada. A espessura ideal varia com o tipo de material vegetal e o objetivo do trabalho (normalmente entre 8 e 12 m). Fazem-se os cortes, que devem ser distendidos sobre a lâmina que contenha uma gota de água. Depois de secas em temperatura ambiente, as lâminas estão prontas para ser coradas. * COLORAÇÃO PELO MÉTODO DO AZUL DE TOLUIDINA (O’BRIEN et al., 1964, modificado): Colocar as lâminas com cortes distendidos em uma cubeta de vidro, própria para coloração de lâminas. Adicionar o corante preparado em tampão acetato (pH=4,7), aguardar entre 1 e 3 minutos, lavando-se em água corrente por mais 5 minutos. Secar em temperatura ambiente. No trabalho de O’BRIEN et al., o corante é preparado em tampão fosfato 0,1M pH6,8 e os autores indicam que pode ser necessário um ajuste no pH para obter coloração com contraste. O mesmo vale para o tampão acetato (pode-se variar o pH, p.ex., para 3,5, desde que reaja melhor com o material que está sendo estudado). - Montagem em Permount ou outro meio de montagem resinoso. Resultado: paredes celulósicas coram-se de arroxeado e paredes lignificadas coram-se de azul-esverdeado; compostos fenólicos como os taninos adquirem coloração verde escura intensa. Preparo do Azul de Toluidina: preparar o tampão acetato 0,1M pH4,7, da seguinte maneira: juntar 2,9ml de ácido acético concentrado (CH3COOH – 17,5mol/L) com 4,1g de acetato de sódio anidro (CH3COONa) ou 6,8g de acetato de sódio triidratado (CH3COONa.3H2O) e completar o volume para 500ml com água destilada. Para cada 1000ml do tampão, acrescentar 0,50g de Azul de Toluidina. Se o pH estiver alto, corrigir com ácido acético; se estiver baixo, acertar com acetato de sódio. OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 15 B) PROCESSO DE DESIDRATAÇÃO E INCLUSÃO EM PARAFINA: - Etanol 20% - 1 hora - Etanol 30% - 1 hora - Etanol 40% - 1 hora - Etanol 50% - 1 hora - Etanol 60% - 1 hora - Etanol 70% - 1 hora (pode estar armazenado) - Etanol 80% - 1 hora - Etanol 90% - 1 hora - Etanol 100% - de 30 minutos a 1 hora - Etanol 100% + eritrosina (se o material for transparente) – de 30 minutos a 1 hora - Etanol-Xilol (3:1) - 30 minutos - Etanol-Xilol (1:1) - 30 minutos - Etanol-Xilol (1:3) - 30 minutos - Xilol puro I - 30 minutos - Xilol puro II - 30 minutos - Xilol-Parafina (solução saturada) - até o dia seguinte (mínimo = 12 horas), em temperatura ambiente ou estufa a 37ºC, tampados (melhor usar rolhas de borracha) - No dia seguinte: colocar na estufa e deixar o xilol-parafina derreter - Parafina I - 1 hora - Parafina II - 1 hora - Parafina (92%) + cera de abelha (8%) - 1 hora - INCLUSÃO: na solução acima, em caixinhas de papel. * Se desejar um processo mais rápido: - Xilol-Parafina (solução saturada) - 1 hora a 60ºC, após derretido - Verter metade da solução e acrescentar Parafina pura I - 30 minutos - Verter metade da solução e acrescentar Parafina pura II - 30 minutos - Verter toda a solução e colocar a solução de inclusão - 30 minutos - INCLUSÃO: na solução acima, em caixinhas de papel. OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 16 * MICROTOMIA: cortes em parafina podem ser feitos com espessuras bem variáveis (entre 8 e 30m). Cortes entre 12 e 15m são os que normalmente mostram melhor qualidade. Proceder aos cortes em micrótomo, retirar as fitas de cortes e colocar em lâmina com um adesivo já aplicado e seco, acrescido de líquido. Se utilizar o adesivo de Haupt (mais indicado), o líquido para distensão dos corte é a formalina 4%. Se usar adesivo de Mayer, acrescentar água destilada para distender. Em ambos os casos, a distensão ocorre na faixa de 37 a 45ºC, sobre placa aquecedora (Haupt ou Mayer) ou em banho-maria (Mayer). Preparo do Adesivo de Haupt: 1g de gelatina incolor + 2g fenol (cristais) + 15ml glicerina. Completar o volume para 100ml com água destilada. Aplicar fina camada sobre a lâmina e deixar secar em temperatura ambiente. Preparo do Adesivo deMayer: 1 clara de ovo + igual volume de glicerina + 1g ácido fênico ou salicílico. Agitar bem e filtrar em algodão. Aplicar camada bem fina na lâmina, porque este adesivo se cora facilmente, dificultando as preparações. Deixar o adesivo secar em temperatura ambiente antes de colocar os cortes. * COLORAÇÃO PELO MÉTODO DO AZUL DE ASTRA E FUCSINA (ROESER, 1972): - Xilol I – 30 minutos - Xilol II – 30 minutos - Xilol-etanol (3:1) – 5 minutos - Xilol-etanol (1:1) – 5 minutos - Xilol-etanol (1:3) – 5 minutos - Etanol 100% - 5 minutos - Etanol 90% - 5 minutos - Etanol 70% - 5 minutos - Etanol 50% - 5 minutos - Etanol 30% - 5 minutos - Lavar em água destilada - Azul de astra – 5 minutos - Lavar em água destilada OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 17 - Fucsina básica – 15 minutos - Lavar em água destilada - Ácido pícrico saturado – 10 segundos - Etanol 30% - 5 minutos -Etanol 50% - 5 minutos -Etanol 70% - 5 minutos -Etanol 90% - 5 minutos -Etanol 100% - 5 minutos - Xilol-etanol (1:3) – 5 minutos - Xilol-etanol (1:1) – 5 minutos - Xilol-etanol (3:1) – 5 minutos - Xilol puro I – 5 minutos - Xilol puro II – 5 minutos - Montagem em Permount ou outro meio de montagem resinoso. Resultado: paredes celulósicas coram-se de azul e paredes lignificadas coram-se de roxo. * COLORAÇÃO PELO MÉTODO DO AZUL DE ASTRA E SAFRANINA (GERLACH, 1984): - Xilol I – 30 minutos - Xilol II – 30 minutos - Xilol-etanol (3:1) – 5 minutos - Xilol-etanol (1:1) – 5 minutos - Xilol-etanol (1:3) – 5 minutos - Etanol 100% - 5 minutos - Etanol 90% - 5 minutos - Etanol 70% - 5 minutos - Etanol 50% - 5 minutos - Etanol 30% - 5 minutos - Etanol 10% - 5 minutos - Azul de astra 0,5% em ácido tartárico 2% (p.12) – 5 minutos - Lavar em água destilada – 1 minuto - Safranina 1% – 5 minutos OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 18 - Etanol 70% - 5 minutos - Etanol 70% acidificado (diferenciador) – usar 1 gota de ácido clorídrico 37% para 100ml de etanol 70% - Etanol 70% - 5 minutos - Etanol 90% - 5 minutos -Etanol 100% - 5 minutos - Xilol-etanol (1:3) – 5 minutos - Xilol-etanol (1:1) – 5 minutos - Xilol-etanol (3:1) – 5 minutos - Xilol puro I – 5 minutos - Xilol puro II – 5 minutos - Montagem em Permount ou outro meio de montagem resinoso. Resultado: paredes celulósicas coram-se de azul e paredes lignificadas coram-se de vermelho. 4. DIAFANIZAÇÃO DE ÓRGÃOS VEGETAIS A técnica da diafanização ou clareamento de órgãos é utilizada para se estudar a sua venação. Existem vários métodos, porém o que parece mais eficiente é o de FUCHS (1963): - Colocar o material (folha, por exemplo) em etanol 95% por alguns dias (aproximadamente 1 semana). - Corar por 24 horas em uma solução 1% de Fucsina básica em etanol 95%. - Lavar em água da torneira até completamente reidratado e não se observar mais desprendimento de corante. - Colocar em solução de Hidróxido de sódio a 5% em estufa a 60º C até clarificar completamente (o material torna-se amarelado e pálido), renovando o NaOH a cada 24 horas). Cerca de 3 dias são suficientes, mas varia em função do material vegetal. - Lavar por 12 horas em água, que deve ser trocada várias vezes. - Desidratar por passagens através dos álcoois 30, 50, 70 e 95%. Só se pode substituir um etanol por outro de grau mais elevado quando o material não soltar mais corante. Esta operação deve ser lenta, levando cerca de 12 horas. OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 19 - Montar entre placas de vidro de pequena espessura, utilizando gelatina glicerinada como meio de montagem. Depois de solidificada a gelatina, limpar a superfície com etanol e lutar com esmalte de unhas. 5. MACERAÇÃO A maceração é uma técnica pela qual, através de certas substâncias químicas, dissolve-se a lamela média (região da parede celular que interliga duas células). Desta forma, podem ser observadas as células isoladamente, de modo que se tem uma visão tridimensional da célula. O método mais tradicional de maceração é o Método de Jeffrey, que macera à base de ácidos crômico e nítrico. Hoje em dia, tem sido mais utilizado o Método de Franklin (Franklin, 1945) modificado, processado da seguinte forma: - Coloque pequenos pedaços do material vegetal (fragmentar respeitando a orientação das células que pretende avaliar) em tubo de ensaio contendo água oxigenada 30 volumes e ácido acético glacial (1:1). Tampar com tampa de vidro esmerilhado e fixar a tampa com esparadrapo, mantendo o material em estufa a 60º C por cerca de 24 horas (o tempo varia de material para material). Para materiais mais rígidos, pode-se usar água oxigenada até 120 volumes, mas a ampliação do tempo dá resultado com 30 volumes apenas. - Abrir com cuidado e lavar o material com água corrente (de cinco a dez vezes), agitando bastante o vidro para ajudar na dissociação do material (a lavagem deve ser feita com alguns pedaços de meia de seda na boca do vidro, para reter o material). - Lavar com etanol 50%. - Corar com 3 a 4 gotas de solução aquosa de Hematoxilina e Safranina (1:1) ou apenas com Safranina 1% em etanol 50%. Pode-se guardar o material nesta solução ou lavar 3 vezes em etanol 30% e armazenar. - Colocar pequena quantidade do material na lâmina sobre uma gota de água, glicerina ou gelatina glicerinada, espalhando o macerado com um estilete. Coloque a lamínula e observe. 6. MORFOMETRIA Em anatomia vegetal, é comum o emprego de RÉGUA e RETÍCULO MICROMÉTRICO respectivamente para a realização de medidas e contagens do número de células e/ou estruturas. OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 20 6.1. MEDIÇÕES de comprimento e diâmetro de células podem ser feitas em seções ou em material dissociado. Para isso, utiliza-se uma lente ocular micrometrada, a qual é inserida no canhão do microscópio, abaixo da ocular. Nesta lente, existe uma escala com n divisões (em geral, 1mm dividido em 100 partes, ou seja, cada divisão corresponde a 0,01mm = 10m) e o resultado obtido é multiplicado pelo fator de correção correspondente ao aumento utilizado. Para se obter o fator de correção para cada aumento específico, determina-se o número de traços da ocular micrométrica que corresponde a um determinado comprimento da escala existente na lâmina micrométrica colocada sobre a platina do microscópio. Através de regra de três, obtém-se o valor de cada traço em micrômetros. Pode-se usar uma lente ocular com retículo, calculando-se o valor de cada quadrícula com a lâmina micrométrica. 6.2. CONTAGENS do número de células (freqüência) devem ser feitas em seções ou impressões do material vegetal. Utiliza-se uma lente ocular reticulada (inserida no canhão do microscópio) ou um microscópio adaptado para projeção. Na ocular, delimita-se uma área e calcula-se o seu valor em milímetros. A seguir, anota-se o número de células encontradas dentro da área delimitada. O valor final é geralmente fornecido em n o /mm 2 . No microscópio adaptado para projeção, pode existir um acessório onde existe uma área delimitada, de dimensões conhecidas, em mm 2 . No entanto, pode-se colocar uma quadrícula em papel com área equivalente a1mm 2 na lente de projeção e, para cada aumento considerado, efetuar-se as contagens necessárias. 7. ILUSTRAÇÃO CIENTÍFICA A ilustração é uma das fases mais cruciais do trabalho de um anatomista vegetal. Se ela não é de boa qualidade, desmerece todo o trabalho desenvolvido pelo pesquisador. Deve-se, portanto, tomar um extremo cuidado na confecção das pranchas de um trabalho. Alguns materiais e preparações prestam-se muito bem ao registro fotográfico. Preparam-se as fotomicrografias em um fotomicroscópio, dispondo-as posteriormente em montagens que variam no número de fotos. OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 21 Há outros materiais e especialmente preparações que não apresentam um contraste muito evidente que não produzem bons resultados fotográficos. Nestes casos, recorre-se aos diagramas e desenhos em detalhe, utilizando-se câmaras claras adaptadas a estereomicroscópios ou a microscópios comuns. Podendo ser encontradas em vários modelos, as câmaras claras projetam o material sobre uma folha de papel branco, na qual se desenha o contorno projetado. Microscópios de projeção também funcionam para o desenho de aspectos gerais de órgãos, embora às vezes não forneçam a precisão necessária ao desenho de alguns detalhes estruturais. Em todos os casos, é fundamental que as ilustrações venham acompanhadas de uma escala precisa. Quando se está utilizando fotomicroscópio, deve-se fotografar a lâmina contendo régua micrométrica nos mesmos aumentos utilizados para o material; é importante que o filme seja copiado todo ele com a mesma ampliação, para que as escalas não percam seu valor. Quando se preparam desenhos, projeta-se a régua nas condições adequadas, assinalando-se a escala de cada desenho. 8. 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