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Universidade Estadual Paulista 
Instituto de Biociências 
Departamento de Botânica 
 
Caixa Postal 510 - 18618-000 - Botucatu, SP - Fone (014) 6802-6053 / 6802-6265 - Fax (014) 6821-3744 
 
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS 
ÁREA DE BOTÂNICA 
Disciplina de Princípios e Métodos em Anatomia de Plantas 
 
 
 
 
TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DE MATERIAL VEGETAL 
PARA ESTUDO ANATÔMICO 
 
 
 
 
Profa. Dra. Denise Maria Trombert de Oliveira 
 
 
 
 
 
 
 
 
Botucatu - SP 
2002 
 
2 
OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de 
Biociências, 2001. 19p. (Apostila). 
 
 
1. COLETA DE MATERIAL VEGETAL 
Devem ser tomados alguns cuidados no momento da coleta, visando à obtenção de 
bons resultados no processamento do material. 
O cuidado mais importante é evitar o murchamento do material. Caso o local de 
coleta seja próximo do local de processamento, não haverá problemas, especialmente se a 
coleta for realizada logo no início da manhã. Se o local de coleta é distante ou é necessário 
coletar nos períodos mais quentes do dia, deve-se levar um saco plástico borrifado com água 
fresca e colocar o material nele logo após coletar. O saco plástico forma uma câmara úmida 
que favorece a conservação do material. Se a coleta for feita durante viagens, o ideal é levar o 
fixador e fixar o material no campo, imediatamente após coletá-lo. 
1.1. COLETA DE RAÍZES E OUTROS ÓRGÃOS SUBTERRÂNEOS: deve-se escavar em 
torno da planta e retirar a terra que envolve o material somente com água, de modo a não 
alterar sua estrutura. A PLANTA NUNCA DEVE SER ARRANCADA. 
1.2. COLETA DE ÁPICE CAULINAR: por ser uma região de tecidos muito delicados, está 
mais sujeita a danos por murchamento e transporte. O melhor é coletar pela manhã e 
colocar rapidamente no fixador adequado. Deve-se observar bem o ápice antes da coleta, 
para evitar coletar material que não esteja intacto. 
1.3. COLETA DE FOLHAS: as folhas carnosas e as coriáceas são mais resistentes que as 
folhas herbáceas e membranáceas. De qualquer modo, o melhor é coletar um pequeno 
ramo e não folhas isoladas, quando se precisa transportar o material. 
1.4. COLETA DE FLORES: Deve-se coletar sempre verificando se a flor está completa; é 
comum haver a queda de certas partes (especialmente anteras), tanto por senescência 
quanto por acidente. Como o ápice caulinar, é um material muito delicado e deve ser 
fixado imediatamente. Também deve ser verificado o horário da antese: existem flores 
que só se abrem em determinados horários do dia, devendo ser coletadas nesse período. 
Botões florais podem ser coletados em qualquer horário, com os devidos cuidados contra 
murchamento; devem ser feitas pequenas aberturas ou fendas, para permitir a penetração 
do fixador e evitar que o material flutue na solução fixadora. 
1.5. COLETA DE FRUTOS E SEMENTES: no caso de frutos maduros de pericarpo seco e 
sementes sem estruturas carnosas, a coleta pode ser feita em sacos plásticos ou de papel, 
com pequenos furos. Se forem frutos maduros de pericarpo carnoso, sementes com 
 
OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de 
Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 
3 
porções carnosas, ou frutos e sementes imaturos, devem ser tomados os mesmos cuidados 
para a coleta de folhas. 
 
2. FIXAÇÃO 
“The only reliable control upon „good‟ fixation 
is the normal structure of the living cell.” 
(I. W. Bailey, 1930) 
 
A fixação é etapa necessária na maioria dos trabalhos, especialmente quando o 
objeto de estudo encontra-se longe do laboratório. Essa etapa deve ser muito bem executada, 
pois um material mal fixado só será descoberto no final do processamento, ocasionando perda 
de material de consumo e de tempo. Para ajudar na penetração dos fixadores, este processo 
deve ser feito com passagem em bomba a vácuo. Dependendo do material, a substituição do 
fixador pelo etanol a 70% (solução de estocagem) também deve ser feita a vácuo. 
Existem vários fixadores, cada um indicado para um tipo de material e de estudo: 
 
2.1. FAA (JOHANSEN, 1940): é o fixador mais utilizado para material vegetal. É uma 
mistura de etanol 50% ou 70% com ácido acético glacial e formalina (concentração final 
de formol = 2%). O material vegetal deve ser cortado em pequenos pedaços (de 
preferência com menos de 1 cm). O material deve permanecer no fixador por um período 
que varia de 18 (no mínimo) a 48 horas (no máximo), sendo depois desidratado e 
conservado em etanol 70%. Caso o material seja estocado no FAA, pode ocorrer 
plasmólise das células fixadas. (Observação: segundo JENSEN (1962), a fixação com 
FAA pode ser feita no período mínimo de 4 horas e o material pode ser estocado nesta 
mistura indefinidamente. A experiência tem mostrado, contudo, que não é aconselhável 
este procedimento, prevalecendo a indicação anterior). 
Preparo do FAA: para 100ml do fixador: 
90ml de etanol a 50% (ou a 70%) 
5ml de ácido acético glacial 
5ml de formalina (formaldeído a 40%) 
 
 
OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de 
Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 
4 
2.2. BOUIN (JOHANSEN, 1940): fixador tradicional para muitas técnicas zoológicas, é 
usado com eficiência para preservar materiais delicados, como ápices e peças florais. O 
material deve permanecer no fixador por 24 horas. Como o fixador é preparado em 
solução aquosa, antes do processo de desidratação deve-se proceder à lavagem do 
material em água destilada, que elimina resíduos do fixador. A desidratação pode 
começar com etanol a 50%; para materiais mais delicados, deve-se começar no etanol a 
20%, já que a desidratação mais gradativa minimiza a alteração dessas estruturas. Para 
conservar, desidratar até etanol a 70% e estocar). 
Preparo do BOUIN: para 100ml do fixador: 
75ml de solução aquosa saturada de ácido pícrico 
25ml de formalina (formaldeído a 40%) 
5ml de ácido acético glacial 
 
2.3. MISTURA DE KARNOVSKY (KARNOVSKY, 1965): mistura à base de glutaraldeído 
e paraformaldeído em tampão fosfato, indicada para fixar material delicado, que exija 
preservação do conteúdo celular. O material deve ser cortado em fragmentos muito 
pequenos (cerca de 5mm, por causa da lentidão de penetração dessa mistura) e fixado por 
aproximadamente 24 horas, sendo depois conservado em etanol a 70%. 
Preparo da Mistura de Karnovsky: para 500ml de fixador (manter 
em geladeira; melhor misturar as soluções no momento de utilizar, 
mas a mistura se mantém estável por aproximadamente uma 
semana): 
100ml de solução de paraformaldeído a 4% 
150ml de tampão fosfato 0,2M (pH=7,2) 
250ml de solução de glutaraldeído a 1% em tampão 
fosfato 0,1M (pH=7,2) 
 
2.4. FIXADOR PARA TANINOS (JOHANSEN, 1940): na página 193, Johansen recomenda 
aplicar aos fragmentos que se deseja fixar uma solução aquosa contendo 3 a 5% 
de formalina e 10% de sulfato ferroso, mantendo por 24 a 48 horas. Após esse 
período, lavar com água destilada, desidratar e incluir em parafina. Seccionar os blocos, 
 
OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de 
Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 
5 
distender os cortes, remover a parafina e montar em meio resinoso (Permount, por 
exemplo). O ferro presente na solução tanto fixa quanto cora os taninos de marrom. O 
mesmo Johansen, contudo, na página 107, recomenda preparar o fixador misturando-se 
2g de sulfato ferroso + 10ml de formalina + 90ml de água destilada. Na 
prática, verifica-se que essas variações de proporção nãosão relevantes. Também deve 
ser acrescentado que o material fixado pode ser conservado em etanol a 70% por período 
indeterminado antes da inclusão, que pode ser feita tanto em parafina quanto em 
historresina. Em ambos os casos, não se faz nenhuma coloração antes da montagem, de 
modo que são observadas com a coloração marrom as células que contêm taninos e todo o 
restante fica descolorido. 
 
Existem muitas outras fórmulas fixadoras, usadas em casos mais específicos. 
Atualmente, no entanto, têm sido utilizados com maior freqüência a FAA e a mistura de 
Karnovsky. Maiores detalhes são apresentados nos livros básicos de microtécnica vegetal, 
citados ao final desta apostila. 
 
3. TIPOS DE PREPARAÇÕES 
3.1. PREPARAÇÕES TEMPORÁRIAS: montagens rápidas, de material fresco ou fixado, 
destinadas à análise imediata, pois não se conservam. 
 
* PROCEDIMENTO: faça os cortes a mão livre, com lâmina de barbear nova, utilizando ou 
não um suporte (medula de embaúba ou isopor, por exemplo). Coloque os cortes entre lâmina 
e lamínula, usando uma gota de água como meio de montagem. Observe. 
 
* TESTES HISTOQUÍMICOS: as preparações temporárias podem ser utilizadas para a 
realização de testes destinados à localização e detecção de várias substâncias. Os testes 
rotineiramente utilizados são qualitativos, importantes para a compreensão do material em 
estudo. Preferencialmente, os testes devem ser feitos em material fresco, mas bons resultados 
são obtidos também com material fixado em FAA ou na mistura de Karnovsky (o que pode 
ocorrer é que os componentes dos fixadores lavem os compostos das células rompidas – o que 
se resolve descartando os primeiros cortes - e diminuam o conteúdo de certas células, 
produzindo reações menos evidentes). A maior parte dos testes também produz bons 
 
OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de 
Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 
6 
resultados em cortes preparados a partir de material incluído em historresina, lembrando 
contudo, que os cortes finos conterão pequenas quantidades dos compostos que se deseja 
detectar (testes com ácidos não funcionam nestes cortes). Podemos destacar os testes para: 
 
a) AMIDO (JOHANSEN, 1940): coloração azul escura a preta. 
- Tratar os cortes com Lugol. Observar imediatamente. 
Preparo do Lugol: dissolver 1,5g de iodeto de potássio em 100ml 
de água destilada. Dissolver 0,3g de iodo cristalino na 
solução resultante. 
- Observação: caso haja acúmulo de amilóides nas paredes celulares (em alguns cotilédones 
carnosos, por exemplo), estas aparecerão coradas de azul com a aplicação do Lugol. 
 
 b) SUBSTÂNCIAS LIPÍDICAS (JOHANSEN, 1940): gotículas de óleo, cutícula, camadas 
de cera, paredes suberificadas: 
- Colocar os cortes em contato com solução de Sudan III ou IV (glicerinado ou não). Pode-se 
observar imediatamente, mas a reação se intensifica dentro de aproximadamente 20 minutos. 
A reação pode ser acelerada com rápido e cuidadoso aquecimento da lâmina. 
Preparo do Sudan IV: Preparar uma solução saturada de Sudan 
IV em 50ml de etanol 70%. Se desejar uma fórmula 
menos volátil, adicionar 50ml de glicerina. 
- Observação: Para melhor observação da reação, Johansen sugere que se mantenha os cortes 
no corante por 20 minutos, lave com etanol a 50% para remover o excesso do Sudan 
(rapidamente, pois o álcool é solvente de substância lipídicas e pode remover o conteúdo 
celular se ficar tempo maior que o necessário) e observe em glicerina. Melhora muito a 
qualidade da preparação, especialmente para fotomicrografias. 
 
c) ALEURONA (JOHANSEN, 1940): os cristalóides ficam amarelos, os globóides não se 
colorem e a massa fundamental fica vermelha. 
- Fazer os cortes e não colocá-los em água. Tratá-los com solução saturada de eosina 
(ou de nigrosina) e ácido pícrico em etanol absoluto. Observar imediatamente. 
 
 d) CRISTAIS (JOHANSEN, 1940): verificação de sua composição química. 
 
OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de 
Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 
7 
- Tratar os cortes com ácido acético concentrado. Se o cristal se dissolver, a composição 
é CARBONATO DE CÁLCIO. 
- Tratar outros cortes com ácido sulfúrico diluído (5 a 10%). Se o cristal se dissolver, a 
composição é OXALATO DE CÁLCIO. 
- Observação: Se houver grande quantidade de oxalato de cálcio, após a adição do ácido 
poderão formar-se novos cristais de sulfato de cálcio, semelhante a agulhas. 
 
e) TANINOS - COMPOSTOS FENÓLICOS (JOHANSEN, 1940): coloração azul 
esverdeada. 
- Tratar os cortes com solução aquosa de cloreto de ferro (III) a 10%, acrescida de 
uma pitada de carbonato de sódio. Observar em seguida. 
 
f) ANTOCIANINA - COMPOSTO FENÓLICO (GURR, 1956): em meio ácido, a 
antocianina é vermelha; em meio básico, varia de azul violeta a verde. 
- Observe os cortes ao microscópio e localize as células de conteúdo avermelhado. Continue 
observando e coloque uma gota de solução de amônia. Analise outra lâmina e coloque 
uma gota de ácido acético glacial. 
- Observação: Segundo JOHANSEN (1940), acrescentando-se ao corte do órgão com 
antocianina uma pequena gota de ácido acético glacial, a antocianina será extraída do tecido e 
evapora, formando vários tipos de cristais avermelhados. 
 
g) PAREDES LIGNIFICADAS (JOHANSEN, 1940): coloração vermelho forte. 
- Colocar os cortes em solução de floroglucina a 2% em etanol 95% e deixar 
evaporar um pouco. Acrescentar 2 a 3 gotas de ácido clorídrico concentrado. 
 
h) PAREDES CELULÓSICAS OU LIGNIFICADAS (JENSEN, 1962): paredes com 
grande quantidade de celulose ficam azuis, celulose com pectina fica arroxeada, celulose com 
lignina, cutina, suberina ficam amarelas ou alaranjadas. 
- Tratar os cortes com cloreto de zinco iodado. 
Preparo do Cloreto de zinco iodado: dissolver 50g de cloreto de 
zinco e 16g de iodeto de potássio em 17ml de água 
destilada. Acrescentar um excesso de iodo cristalino e 
 
OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de 
Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 
8 
deixar em repouso por alguns dias. Recolher o 
sobrenadante em frascos âmbar e guardar em 
geladeira. 
- Observação: O’BRIEN e McCULLY (1981) chamam a atenção de que esta não é uma 
coloração específica: resultados positivos não necessariamente indicam celulose, assim como 
os negativos não atestam definitivamente sua ausência. 
 
i) SUBSTÂNCIAS PÉCTICAS (JOHANSEN, 1940; JENSEN, 1962): coloração rósea. 
- Tratar os cortes de material fresco ou fixado com solução aquosa de vermelho de 
rutênio (1:5000). Deixar os cortes em contato com a solução por alguns minutos. Alguns 
tipos de MUCILAGEM também apresentam resultado positivo com essa solução. 
- Observação: Johansen apresenta um procedimento para remoção de substâncias pécticas 
para se usar como controle deste teste (p.201). 
 
j) CALOSE (JENSEN, 1962): coloração azul. 
- Tratar os cortes com solução aquosa de azul de anilina por alguns minutos (o tempo 
de reação é variável), observando a seguir em água ou glicerina. 
Preparo da solução de azul de anilina: 0,5g de azul de anilina, 
dissolvidos em 50ml de água destilada. 
k) SAPONINAS (JOHANSEN, 1940): coloração final azul (muda ao longo do tempo). 
- Tratar os cortes com uma gota de ácido sulfúrico concentrado, observando 
imediatamente a seqüência de reação pelas cores: amarelo, imediatamente; vermelho em cerca 
de 30 minutos, passando a violeta ou azul-esverdeado em poucos instantes. 
 
3.2. PREPARAÇÕES SEMI-PERMANENTES: são montagens de material fresco ou fixado, 
que podemser guardadas por curtos períodos de tempo (de alguns meses até cerca de 2 
anos, em melhores condições; dependendo do meio de montagem e das condições de 
armazenamento das lâminas, mantêm-se úteis de 3 até 5 anos). 
* PROCEDIMENTO: Faça os cortes a mão livre, em micrótomo de Ranvier ou em micrótomo 
de congelação. A montagem é sempre feita entre lâmina e lamínula, usando-se glicerina pura 
ou gelatina glicerinada como meio de montagem (preferencialmente esta última, que permite 
 
OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de 
Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 
9 
que as lâminas sejam guardadas verticalmente). Quando se pretende conservar a lâmina por 
um período maior de tempo, é recomendável lutar a lamínula com esmalte de unhas. 
Preparo da gelatina glicerinada: dissolver a quente 14g de 
gelatina em pó sem sabor em 70ml de água destilada, 
acrescentando 100ml de glicerina e, ao final, 5g de 
fenol em cristais. Filtrar ainda quente para tubos de 
ensaio com tampa de vidro esmerilhada e conservar, 
depois de frio, em geladeira. 
 
* MONTAGEM SEM COLORAÇÃO: Produza cortes finos e bem orientados e monte entre 
lâmina e lamínula sem nenhum processamento. Esta preparação preserva, por poucos dias, a 
coloração original do material. 
 
* MONTAGENS COM COLORAÇÃO: podem ser usadas várias associações duplas de 
corantes, como safranina e verde firme, azul de astra e fucsina, safranina e azul de astra, 
vermelho congo e verde iodo, etc. 
 
* Método do vermelho congo e verde iodo (DOP & GAUTIÉ, 1928): 
- Selecione os cortes; 
- Clareie em solução de hipoclorito de sódio a 20% da solução comercial - 20 min. 
- Lave com água acética a 1% - 3 vezes. 
- Lave com água destilada - 1 vez. 
- Coloque a solução aquosa de Verde-iodo 1% - de 1 a 3 min. 
- Lave em água destilada - 2 vezes. 
- Coloque a solução aquosa de Vermelho-congo 1% - de 5 a 10 min. 
- Lave com água destilada - até sair o excesso de corante. 
- Proceda à montagem. 
Observação: para se preparar os dois corantes, usar água aquecida (50ºC) e filtrar em lã de 
vidro. 
Resultado: paredes celulósicas coram-se de vermelho e paredes lignificadas coram-se de 
verde. Com o tempo, tende a diminuir o contraste da coloração. 
 
 
OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de 
Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 
10 
* Coloração pelo método da Safranina e Azul de Astra - Safrablau (BUKATSCH, 1972; 
BURGER & RICHTER, 1991): 
- Selecione os cortes. 
- Clareie com Hipoclorito de sódio a 20% da solução comercial - 20 min. 
- Lave com água acética - 3 vezes. 
- Lave com água destilada - 1 vez. 
- Coloque a solução de Safrablau – 1 a 3 min. 
- Lave com água destilada - até eliminar todo o excesso de corante. 
Resultado: paredes celulósicas coram-se de azul pelo Azul de Astra e paredes lignificadas 
coram-se de vermelho pela Safranina. 
Preparo do Safrablau: Solução A: 1g de safranina dissolvida em 
100ml de água destilada aquecida a 50ºC e filtrada em 
lã de vidro. Solução B: 1g de azul de astra dissolvido 
em 100ml de água destilada e filtrado em lã de vidro. 
Agitar cada solução por 5 a 7 minutos. Juntar 10ml da 
solução A a 90ml da solução B, acrescentando 2 gotas 
de ácido acético à mistura. 
 
3.3. PREPARAÇÕES PERMANENTES: São preparações de material fresco ou fixado, 
devidamente desidratado e corado, montado em resina sintética, que lhe confere 
resistência e durabilidade por tempo indeterminado. Também são consideradas 
permanentes, as lâminas preparadas com impressão em cola. 
 
3.3.1. PREPARAÇÕES PERMANENTES UTILIZANDO IMPRESSÕES: Os estudos da 
epiderme dos diversos órgãos exigem, além dos tradicionais cortes transversais e 
longitudinais, os cortes paradérmicos. Dependendo do objetivo do trabalho, estes 
últimos cortes podem ser substituídos por impressões das epidermes realizadas com 
cola, produzindo réplicas da estrutura. Este tipo de preparação presta-se muito bem 
aos estudos morfométricos de células epidérmicas, bem como às contagens, por 
exemplo para determinação de índice estomático. 
 a) Cola do tipo "Super Bonder": Em uma lâmina limpa e seca, coloque uma pequena gota da 
cola. Pegue a folha, também lavada e seca, e pressione-a sobre a gotinha de cola. O tempo 
 
OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de 
Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 
11 
vai depender da quantidade de cola colocada, devendo ser a folha retirada antes que fique 
aderida à lâmina. 
b) Cola para Aeromodelismo: Prepare a lâmina, colocando sobre ela uma gota de água 
destilada. Pegue a folha, limpa e seca, e espalhe uma camada homogênea da cola sobre 
uma pequena superfície (uma gotinha da cola). Espere secar e, com auxílio de uma pinça, 
retire a película formada pela cola. Vire-a e distenda sobre a lâmina, de modo que a 
superfície da película que estava em contato com a folha fique voltada para cima. Com 
papel de filtro, retire o excesso de água. 
 
3.3.2. PREPARAÇÕES PERMANENTES UTILIZANDO CORTES A MÃO LIVRE, 
EM MICRÓTOMO DE RANVIER OU EM MICRÓTOMO DE CONGELAÇÃO: 
faça vários cortes e selecione os melhores, colocando-os em uma placa de petri 
pequena. Pode ser utilizado material fresco ou fixado; se fixado, deve-se verificar a 
graduação alcoólica do fixador e reidratar a material, através de passagem por série 
alcoólica decrescente, antes de seguir. Siga os seguintes itens: 
a) Coloque em solução de hipoclorito de sódio a 20% da solução comercial - 20 min. (ou o 
tempo e a concentração necessários para clarificar os cortes). 
b) Lave com água acética – 3 vezes. 
c) Lave com água destilada - até desaparecer todo o cheiro. 
d) Coloração e montagem: podem ser usados diversas associações de corantes, como: 
 
* COLORAÇÃO PELO MÉTODO DO VERDE-RÁPIDO E SAFRANINA (SASS, 1951): 
- Coloque os cortes lavados em solução aquosa de safranina - de 1 a 12 horas, dependendo do 
material (se tem muitos elementos lignificados, 1 hora é suficiente). 
- Lave com água destilada - até sair o excesso de corante. 
- etanol 30% - 5 min. 
- etanol 50% - 5 a 10 min. 
- etanol 70% - 5 a 10 min. 
- etanol 95% - 5 a 10 min. 
- Solução de Verde-rápido em etanol 95% - 5 a 30 seg. 
- etanol 100% - 5 a 10 min. (repetir 3 vezes este item). 
- óleo de cravo - 5 a 10 min. 
 
OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de 
Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 
12 
- Xilol - etanol (1:3) - 5 min. 
- Xilol - etanol (1:1) - 5 min. 
- Xilol - etanol (3:1) - 5 min. 
- Xilol puro - 5 min. (duas vezes). 
- Proceda à montagem usando Bálsamo do Canadá, Permount ou Entelan. Após a secagem, as 
lâminas podem ser guardadas pelo tempo que se desejar. 
Resultado: paredes celulósicas coram-se de verde e paredes lignificadas coram-se de 
vermelho. Formando-se na lâmina uma mancha fosca em torno do corte, é sinal de que a 
desidratação (passagem pela série alcoólica) não foi bem feita. Neste caso, deve repetir toda a 
montagem, deixando mais tempo em cada etanol. 
 
* COLORAÇÃO PELO MÉTODO DO AZUL DE ASTRA E FUCSINA (ROESER, 1972): 
- Coloque os cortes lavados em solução aquosa de azul de astra - 5 min. 
- Lave com água destilada - até sair o excesso de corante. 
- Coloque em solução de fucsina básica em etanol 50% - 15 a 30 min. 
- Lavar em água destilada - até lavar o excesso do corante. 
- Imergir em solução saturada de ácido pícrico - colocar na solução e verter imediatamente. 
- etanol 70% - lavar rapidamente. 
- etanol 100% - 3 min. (repetir 3 vezes este item). 
- Xilol - etanol(1:3) - 5 min. 
- Xilol - etanol (1:1) - 5 min. 
- Xilol - etanol (3:1) - 5 min. 
- Xilol puro - 5 min. (duas vezes). 
- Proceda à montagem usando Bálsamo do Canadá, Permount ou Entelan. Após a secagem, as 
lâminas podem ser guardadas pelo tempo que se desejar. 
Resultado: paredes celulósicas coram-se de azul e paredes lignificadas coram-se de roxo. 
Preparo do Azul de Astra: dissolver 0,5g de azul de astra em 30ml 
de água destilada a 50ºC e 2,0g de ácido tartárico em 
outros 30ml. Juntar as soluções, completando o 
volume para 100ml com água destilada. 
Preparo da Fucsina Básica: dissolver 0,5g de fucsina básica em 
100ml de etanol 50%. Filtrar em lã de vidro. 
 
OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de 
Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 
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3.3.3. PREPARAÇÕES PERMANENTES UTILIZANDO CORTES EM MICRÓTOMO 
ROTATÓRIO: para esse tipo de montagem, deve-se usar material fixado. 
Resumidamente, a técnica consiste em desidratar o material fixado (utilizando-se 
série alcoólica crescente), substituir gradualmente o álcool por um ou mais 
solventes do meio de inclusão (xilol e clorofórmio são os mais utilizados para 
inclusão em parafina; para incluir em historresina, o solvente é o próprio álcool), 
infiltrar no meio de inclusão, incluir e cortar ao micrótomo rotatório. São assim 
obtidos cortes mais finos do material. A seguir, estes devem ser distendidos sobre 
lâmina limpa, a qual, após a secagem, será devidamente corada e montada 
(Permount, Entelan, Bálsamo do Canadá). Atualmente, o meio mais utilizado para 
inclusão de material vegetal é a historresina, pela facilidade com que se obtém 
cortes mais finos e pela maior rapidez de elaboração do laminário. 
 
A) PROCESSO DE DESIDRATAÇÃO E INCLUSÃO EM HISTORRESINA: Para se 
proceder à inclusão em historresina, deve-se seguir as orientações do fabricante do kit que 
estiver utilizando (cada kit contém um frasco de resina, um catalisador e um endurecedor). 
 
* DESIDRATAÇÃO: 
- Etanol 70% - 2 horas (Se estiver armazenado neste álcool, iniciar pelo seguinte) 
- Etanol 90% - 2 horas 
- Etanol 100% - 2 horas 
- Etanol 100% + resina líquida (1:1) - 2 horas 
- Resina ativada = solução de infiltração (resina + pó ativador, na proporção indicada pelo 
fabricante. Se for o kit JB-4 da Polysciences, para cada 100ml da resina líquida, acrescentar 
0,9g do pó ativador) - até o dia seguinte (mínimo = 12 horas, mas há materiais que precisam 
de dias infiltrando – quanto maior a peça, maior o tempo necessário para a infiltração se 
proceder), em temperatura ambiente. Se a temperatura ambiente for elevada, infiltrar em 
geladeira. 
- No dia seguinte: preparar a solução de inclusão, juntando o endurecedor à resina de 
infiltração ou resina ativada (Se for o kit JB-4 da Polysciences, para cada 25ml da resina 
ativada, acrescentar 1ml do endurecedor). Colocar os fragmentos vegetais infiltrados em 
 
OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de 
Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 
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histomoldes (formas plásticas, próprias para inclusão, ou formas de gelo. Peças maiores 
devem polimerizar recobertas por filme plástico), orientando-os adequadamente. Deixar 
polimerizar em temperatura ambiente ou em estufa a 37ºC. 
 
* MICROTOMIA: incluído o material, deve-se proceder à microtomia. Utiliza-se um 
micrótomo rotatório, definindo-se a espessura de corte desejada. A espessura ideal varia com 
o tipo de material vegetal e o objetivo do trabalho (normalmente entre 8 e 12 m). Fazem-se 
os cortes, que devem ser distendidos sobre a lâmina que contenha uma gota de água. Depois 
de secas em temperatura ambiente, as lâminas estão prontas para ser coradas. 
 
* COLORAÇÃO PELO MÉTODO DO AZUL DE TOLUIDINA (O’BRIEN et al., 1964, 
modificado): Colocar as lâminas com cortes distendidos em uma cubeta de vidro, própria para 
coloração de lâminas. Adicionar o corante preparado em tampão acetato (pH=4,7), aguardar 
entre 1 e 3 minutos, lavando-se em água corrente por mais 5 minutos. Secar em temperatura 
ambiente. No trabalho de O’BRIEN et al., o corante é preparado em tampão fosfato 0,1M 
pH6,8 e os autores indicam que pode ser necessário um ajuste no pH para obter coloração com 
contraste. O mesmo vale para o tampão acetato (pode-se variar o pH, p.ex., para 3,5, desde 
que reaja melhor com o material que está sendo estudado). 
- Montagem em Permount ou outro meio de montagem resinoso. 
Resultado: paredes celulósicas coram-se de arroxeado e paredes lignificadas coram-se de 
azul-esverdeado; compostos fenólicos como os taninos adquirem coloração verde escura 
intensa. 
Preparo do Azul de Toluidina: preparar o tampão acetato 0,1M 
pH4,7, da seguinte maneira: juntar 2,9ml de ácido 
acético concentrado (CH3COOH – 17,5mol/L) com 4,1g 
de acetato de sódio anidro (CH3COONa) ou 6,8g de 
acetato de sódio triidratado (CH3COONa.3H2O) e 
completar o volume para 500ml com água destilada. 
Para cada 1000ml do tampão, acrescentar 0,50g de 
Azul de Toluidina. Se o pH estiver alto, corrigir com 
ácido acético; se estiver baixo, acertar com acetato de 
sódio. 
 
OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de 
Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 
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B) PROCESSO DE DESIDRATAÇÃO E INCLUSÃO EM PARAFINA: 
- Etanol 20% - 1 hora 
- Etanol 30% - 1 hora 
- Etanol 40% - 1 hora 
- Etanol 50% - 1 hora 
- Etanol 60% - 1 hora 
- Etanol 70% - 1 hora (pode estar armazenado) 
- Etanol 80% - 1 hora 
- Etanol 90% - 1 hora 
- Etanol 100% - de 30 minutos a 1 hora 
- Etanol 100% + eritrosina (se o material for transparente) – de 30 minutos a 1 hora 
- Etanol-Xilol (3:1) - 30 minutos 
- Etanol-Xilol (1:1) - 30 minutos 
- Etanol-Xilol (1:3) - 30 minutos 
- Xilol puro I - 30 minutos 
- Xilol puro II - 30 minutos 
- Xilol-Parafina (solução saturada) - até o dia seguinte (mínimo = 12 horas), em temperatura 
ambiente ou estufa a 37ºC, tampados (melhor usar rolhas de borracha) 
- No dia seguinte: colocar na estufa e deixar o xilol-parafina derreter 
- Parafina I - 1 hora 
- Parafina II - 1 hora 
- Parafina (92%) + cera de abelha (8%) - 1 hora 
- INCLUSÃO: na solução acima, em caixinhas de papel. 
 
* Se desejar um processo mais rápido: 
- Xilol-Parafina (solução saturada) - 1 hora a 60ºC, após derretido 
- Verter metade da solução e acrescentar Parafina pura I - 30 minutos 
- Verter metade da solução e acrescentar Parafina pura II - 30 minutos 
- Verter toda a solução e colocar a solução de inclusão - 30 minutos 
- INCLUSÃO: na solução acima, em caixinhas de papel. 
 
 
OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de 
Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 
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* MICROTOMIA: cortes em parafina podem ser feitos com espessuras bem variáveis (entre 8 
e 30m). Cortes entre 12 e 15m são os que normalmente mostram melhor qualidade. 
Proceder aos cortes em micrótomo, retirar as fitas de cortes e colocar em lâmina com um 
adesivo já aplicado e seco, acrescido de líquido. Se utilizar o adesivo de Haupt (mais 
indicado), o líquido para distensão dos corte é a formalina 4%. Se usar adesivo de Mayer, 
acrescentar água destilada para distender. Em ambos os casos, a distensão ocorre na faixa de 
37 a 45ºC, sobre placa aquecedora (Haupt ou Mayer) ou em banho-maria (Mayer). 
Preparo do Adesivo de Haupt: 1g de gelatina incolor + 2g fenol 
(cristais) + 15ml glicerina. Completar o volume para 
100ml com água destilada. Aplicar fina camada sobre a 
lâmina e deixar secar em temperatura ambiente. 
Preparo do Adesivo deMayer: 1 clara de ovo + igual volume de 
glicerina + 1g ácido fênico ou salicílico. Agitar bem e 
filtrar em algodão. Aplicar camada bem fina na lâmina, 
porque este adesivo se cora facilmente, dificultando as 
preparações. Deixar o adesivo secar em temperatura 
ambiente antes de colocar os cortes. 
 
* COLORAÇÃO PELO MÉTODO DO AZUL DE ASTRA E FUCSINA (ROESER, 1972): 
- Xilol I – 30 minutos 
- Xilol II – 30 minutos 
- Xilol-etanol (3:1) – 5 minutos 
- Xilol-etanol (1:1) – 5 minutos 
- Xilol-etanol (1:3) – 5 minutos 
- Etanol 100% - 5 minutos 
- Etanol 90% - 5 minutos 
- Etanol 70% - 5 minutos 
- Etanol 50% - 5 minutos 
- Etanol 30% - 5 minutos 
- Lavar em água destilada 
- Azul de astra – 5 minutos 
- Lavar em água destilada 
 
OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de 
Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 
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- Fucsina básica – 15 minutos 
- Lavar em água destilada 
- Ácido pícrico saturado – 10 segundos 
- Etanol 30% - 5 minutos 
-Etanol 50% - 5 minutos 
-Etanol 70% - 5 minutos 
-Etanol 90% - 5 minutos 
-Etanol 100% - 5 minutos 
- Xilol-etanol (1:3) – 5 minutos 
- Xilol-etanol (1:1) – 5 minutos 
- Xilol-etanol (3:1) – 5 minutos 
- Xilol puro I – 5 minutos 
- Xilol puro II – 5 minutos 
- Montagem em Permount ou outro meio de montagem resinoso. 
Resultado: paredes celulósicas coram-se de azul e paredes lignificadas coram-se de roxo. 
 
* COLORAÇÃO PELO MÉTODO DO AZUL DE ASTRA E SAFRANINA (GERLACH, 
1984): 
- Xilol I – 30 minutos 
- Xilol II – 30 minutos 
- Xilol-etanol (3:1) – 5 minutos 
- Xilol-etanol (1:1) – 5 minutos 
- Xilol-etanol (1:3) – 5 minutos 
- Etanol 100% - 5 minutos 
- Etanol 90% - 5 minutos 
- Etanol 70% - 5 minutos 
- Etanol 50% - 5 minutos 
- Etanol 30% - 5 minutos 
- Etanol 10% - 5 minutos 
- Azul de astra 0,5% em ácido tartárico 2% (p.12) – 5 minutos 
- Lavar em água destilada – 1 minuto 
- Safranina 1% – 5 minutos 
 
OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de 
Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 
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- Etanol 70% - 5 minutos 
- Etanol 70% acidificado (diferenciador) – usar 1 gota de ácido clorídrico 37% para 100ml de 
etanol 70% 
- Etanol 70% - 5 minutos 
- Etanol 90% - 5 minutos 
-Etanol 100% - 5 minutos 
- Xilol-etanol (1:3) – 5 minutos 
- Xilol-etanol (1:1) – 5 minutos 
- Xilol-etanol (3:1) – 5 minutos 
- Xilol puro I – 5 minutos 
- Xilol puro II – 5 minutos 
- Montagem em Permount ou outro meio de montagem resinoso. 
Resultado: paredes celulósicas coram-se de azul e paredes lignificadas coram-se de vermelho. 
 
4. DIAFANIZAÇÃO DE ÓRGÃOS VEGETAIS 
A técnica da diafanização ou clareamento de órgãos é utilizada para se estudar a 
sua venação. Existem vários métodos, porém o que parece mais eficiente é o de FUCHS 
(1963): 
- Colocar o material (folha, por exemplo) em etanol 95% por alguns dias (aproximadamente 1 
semana). 
- Corar por 24 horas em uma solução 1% de Fucsina básica em etanol 95%. 
- Lavar em água da torneira até completamente reidratado e não se observar mais 
desprendimento de corante. 
- Colocar em solução de Hidróxido de sódio a 5% em estufa a 60º C até clarificar 
completamente (o material torna-se amarelado e pálido), renovando o NaOH a cada 24 horas). 
Cerca de 3 dias são suficientes, mas varia em função do material vegetal. 
- Lavar por 12 horas em água, que deve ser trocada várias vezes. 
- Desidratar por passagens através dos álcoois 30, 50, 70 e 95%. Só se pode substituir um 
etanol por outro de grau mais elevado quando o material não soltar mais corante. Esta 
operação deve ser lenta, levando cerca de 12 horas. 
 
OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de 
Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 
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- Montar entre placas de vidro de pequena espessura, utilizando gelatina glicerinada como 
meio de montagem. Depois de solidificada a gelatina, limpar a superfície com etanol e lutar 
com esmalte de unhas. 
 
5. MACERAÇÃO 
A maceração é uma técnica pela qual, através de certas substâncias químicas, 
dissolve-se a lamela média (região da parede celular que interliga duas células). Desta forma, 
podem ser observadas as células isoladamente, de modo que se tem uma visão tridimensional 
da célula. O método mais tradicional de maceração é o Método de Jeffrey, que macera à base 
de ácidos crômico e nítrico. Hoje em dia, tem sido mais utilizado o Método de Franklin 
(Franklin, 1945) modificado, processado da seguinte forma: 
- Coloque pequenos pedaços do material vegetal (fragmentar respeitando a orientação das 
células que pretende avaliar) em tubo de ensaio contendo água oxigenada 30 volumes e ácido 
acético glacial (1:1). Tampar com tampa de vidro esmerilhado e fixar a tampa com 
esparadrapo, mantendo o material em estufa a 60º C por cerca de 24 horas (o tempo varia de 
material para material). Para materiais mais rígidos, pode-se usar água oxigenada até 120 
volumes, mas a ampliação do tempo dá resultado com 30 volumes apenas. 
- Abrir com cuidado e lavar o material com água corrente (de cinco a dez vezes), agitando 
bastante o vidro para ajudar na dissociação do material (a lavagem deve ser feita com alguns 
pedaços de meia de seda na boca do vidro, para reter o material). 
- Lavar com etanol 50%. 
- Corar com 3 a 4 gotas de solução aquosa de Hematoxilina e Safranina (1:1) ou apenas com 
Safranina 1% em etanol 50%. Pode-se guardar o material nesta solução ou lavar 3 vezes em 
etanol 30% e armazenar. 
- Colocar pequena quantidade do material na lâmina sobre uma gota de água, glicerina ou 
gelatina glicerinada, espalhando o macerado com um estilete. Coloque a lamínula e observe. 
 
6. MORFOMETRIA 
Em anatomia vegetal, é comum o emprego de RÉGUA e RETÍCULO 
MICROMÉTRICO respectivamente para a realização de medidas e contagens do número de 
células e/ou estruturas. 
 
OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de 
Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 
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6.1. MEDIÇÕES de comprimento e diâmetro de células podem ser feitas em seções ou em 
material dissociado. Para isso, utiliza-se uma lente ocular micrometrada, a qual é inserida 
no canhão do microscópio, abaixo da ocular. Nesta lente, existe uma escala com n 
divisões (em geral, 1mm dividido em 100 partes, ou seja, cada divisão corresponde a 
0,01mm = 10m) e o resultado obtido é multiplicado pelo fator de correção 
correspondente ao aumento utilizado. 
Para se obter o fator de correção para cada aumento específico, determina-se o 
número de traços da ocular micrométrica que corresponde a um determinado 
comprimento da escala existente na lâmina micrométrica colocada sobre a platina do 
microscópio. Através de regra de três, obtém-se o valor de cada traço em micrômetros. 
Pode-se usar uma lente ocular com retículo, calculando-se o valor de cada 
quadrícula com a lâmina micrométrica. 
 
6.2. CONTAGENS do número de células (freqüência) devem ser feitas em seções ou 
impressões do material vegetal. Utiliza-se uma lente ocular reticulada (inserida no canhão 
do microscópio) ou um microscópio adaptado para projeção. 
Na ocular, delimita-se uma área e calcula-se o seu valor em milímetros. A seguir, 
anota-se o número de células encontradas dentro da área delimitada. O valor final é 
geralmente fornecido em n
o
/mm
2
. 
No microscópio adaptado para projeção, pode existir um acessório onde existe 
uma área delimitada, de dimensões conhecidas, em mm
2
. No entanto, pode-se colocar 
uma quadrícula em papel com área equivalente a1mm
2
 na lente de projeção e, para cada 
aumento considerado, efetuar-se as contagens necessárias. 
 
7. ILUSTRAÇÃO CIENTÍFICA 
A ilustração é uma das fases mais cruciais do trabalho de um anatomista vegetal. 
Se ela não é de boa qualidade, desmerece todo o trabalho desenvolvido pelo pesquisador. 
Deve-se, portanto, tomar um extremo cuidado na confecção das pranchas de um trabalho. 
Alguns materiais e preparações prestam-se muito bem ao registro fotográfico. 
Preparam-se as fotomicrografias em um fotomicroscópio, dispondo-as posteriormente em 
montagens que variam no número de fotos. 
 
OLIVEIRA, D.M.T. Técnicas de preparação de material vegetal para estudo anatômico. UNESP: Instituto de 
Biociências, 2002. 22p. (Apostila). 
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Há outros materiais e especialmente preparações que não apresentam um contraste 
muito evidente que não produzem bons resultados fotográficos. Nestes casos, recorre-se aos 
diagramas e desenhos em detalhe, utilizando-se câmaras claras adaptadas a 
estereomicroscópios ou a microscópios comuns. Podendo ser encontradas em vários modelos, 
as câmaras claras projetam o material sobre uma folha de papel branco, na qual se desenha o 
contorno projetado. Microscópios de projeção também funcionam para o desenho de aspectos 
gerais de órgãos, embora às vezes não forneçam a precisão necessária ao desenho de alguns 
detalhes estruturais. 
Em todos os casos, é fundamental que as ilustrações venham acompanhadas de 
uma escala precisa. Quando se está utilizando fotomicroscópio, deve-se fotografar a lâmina 
contendo régua micrométrica nos mesmos aumentos utilizados para o material; é importante 
que o filme seja copiado todo ele com a mesma ampliação, para que as escalas não percam seu 
valor. Quando se preparam desenhos, projeta-se a régua nas condições adequadas, 
assinalando-se a escala de cada desenho. 
 
8. BIBLIOGRAFIA BÁSICA 
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BURGER, L.M., RICHTER, H.G. Anatomia da Madeira. São Paulo: Nobel, 1991. 160p. 
DOP, P., GAUTIÉ, A. Manuel de technique botanique. Paris: J. Lamane, 1928. 534p. 
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Freeman, 1962. 408p. 
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Outros materiais