Aula de PIV

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20/04/2016
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PRODUÇÃO IN VITRO DE 
EMBRIÕES
Profa. Joanna Maria Gonçalves de Souza-Fabjan
Plano de aula
• Introdução• Importância• PIVE – etapas:– Colheita de oócitos– Maturação in vitro (MIV)– Fecundação in vitro (FIV)– Desenvolvimento in vitro (DIV)• Qualidade embrionária• Considerações finais
Introdução
• Biotecnologia animal é um dos campos da ciência quegerou as descobertas mais espetaculares das últimasdécadas
• Produção in vitro de embriões
PIVE
• DEFINIÇÃO: É a produção de embriões a partir damanipulação de gametas fora do organismo materno, ouseja, em condições laboratoriais
• REPRESENTA o aproveitamento de milharesde oócitos que jamais seriam ovulados
• < Variabilidade em sua eficiência que MOTE
• < Falhas na superovulação, taxa de ovulação, fertilização,regressão CL
Estratégia para preservação de raças ou espécies ameaçadas 
PIVE
Confiabilidade
Reprodutibilidade
Fêmeas estimuladasou nãoPré-puberes, senis, gestantes ou post-mortem
Eleva eficiência reprodutiva e melhoramento genético
PIVE
Essencial para clonagem e transgênese
PIVE: histórico
• Primeiro animal nascido após FIV – coelho
• Primeiro ser humano – Louise Brown
• Primeiro bovino
• Primeiro caprino
(Steptoe; Edwards, 1978)
(Chang et al., 1959)
(Keskintepe et al., 1994)
(Brackett et al., 1982)
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Cenário da PIVE no Brasil
Figura 1: Transferências de embriões produzidos por superovulação convencional (TE) ou fertilização in vitro (FIV) no período 2000 - 2006 no Brasil. Fonte: Viana e 
Camargo, (2007).
0
50000
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250000
300000
2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006
Ano base
Em
briõ
es t
rans
feri
dos
FIV TE Total
O Brasil no mercado mundial de PIVE
Tabela 1: Participação do Brasil no total de embriões transferidos no mundo. 
Adaptado de Viana e Camargo, (2007).
Ano Brasil (no.) % da PIV mundial
2005 128.914 48,5%
2004 80.833 33,7%
2003 63.164 59,5%
2002 48.670 58,4%
Distribuição em agrupamentos raciais 
Tabela 2: Transferências de embriões produzidos por superovulação convencional (TE) ou produção in vitro (PIV) e realizadas no Brasil em 2006, estratificadas 
por grupamento racial.
Fonte: Viana e Camargo, (2007).
Grupamento racial TE PIV Total
Zebuínos leiteiros 6.037 13.182
Taurinos leiteiros 2.615 0
Subtotal 8.652 13.182 21.834 (8,2%)
Zebuínos de corte 59.568 183.481
Taurinos de corte 1.666 0
Subtotal 61.234 183.481 244.715 (91,8%)
Total 69.886 (26,2%) 196.663 (73,8%) 266.549
Como gerar embriões in vitro?
• Mimetizar em laboratório todas as condiçõesfisiológicas da fêmea durante a ovulação,fecundação e desenvolvimento embrionário
• O objetivo final na PIVE é o blastocisto quetem uma idade de 7 dias
Como criar condições fisiológicas ?
38,5°C - 5% CO2 em ar – UR 90
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Como criar condições fisiológicas ?
• ESTERILIZAÇÃO – Total
• TOXICIDADE – Nula
• NUTRIÇÃO – Gametas e embriões
• GAMETAS – Em boas condições biológicas
Meios de cultura
A composição dos meios decultura e o requerimento dosembriões mudam de acordo como estágio de desenvolvimento natuba e no útero
Equipamentos/Materiais - LABORATÓRIO PIVE
• Incubadora de CO2• Fluxo Laminar• Microscópio • Estereoscópio (Lupa)• Balança Analítica• PHmetro• Osmômetro• Centrífuga• Refrigerador• Congelador• Estufa de Esterilização• Sistema Ultra-Puro de água
• Vestiário• Sala de Esterilização• Sala de Meios• Sala de Cultivo
PIVE
• Introdução• PIVE – etapas:
– Colheita de oócitos– Maturação in vitro (MIV)– Fecundação in vitro (FIV)– Desenvolvimento in vitro (DIV)– Qualidade embrionária• Considerações finais
Como é realizada?
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• Em vacas, técnica de aspiração orientada por ultrassonografia
• Sistema de biópsia por agulha, pouco traumático
• Cabras e ovelhas?
Colheita de oócitos« OPU »
• Laparotomia abdominal – riscos de infecções ou aderências
• Atualmente:
• Ovários de abatedouro – pesquisa
• LOPU (laparoscopia)– cabras e ovelhas de alto mérito genético– É menos estressante, menos tempo, mais repetições quelaparotomia– 10 a 20 min / fêmea– 2 a 3 h = + de 100 oócitos Médias variáveisLOPU:Taxas de recup.: 40-90%N⁰oócitos/cab.: 4-16 
Colheita de oócitos
Colheita de oócitos: Tratamento hormonal?
Souza-Fabjan et al. R. Bras. Ci. Vet. 21, 3-11, 2014
Fig 1. Stimulation treatments proposedby different research groups using
A: no FSHB: five doses of FSHC: eCG associated to FSH, calledoneshot
A. P4 = CIDR, PGF2α = 125 μg cloprostenol,eCG = 1500 IU, hCG = 250 IU (Tan et al.,2011)B. P4 = 60 mg MAP, PGF2α = 50 μgcloprostenol, pFSH = 30/30/20/20/20 mg(Avelar et al., 2012)C. P4 = 60 mg MAP, PGF2α = 125 μgcloprostenol, eCG = 300 IU, pFSH = 80mg (Baldassarre and Karatzas, 2004)
Após a colheita…
• Líquido folicular estereomicroscópio
• CCOs placas com meio de maturação
Após a colheita, seleção dos oócitos
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• Introdução• PIVE – etapas:
– Colheita de oócitos– Maturação in vitro (MIV)– Fecundação in vitro (FIV)– Desenvolvimento in vitro (DIV)– Qualidade embrionária• Considerações finais
Refere-se a progressão da cromatina durante a meiose de VG a MII
Cultivo dos oócitos imaturos 
Metáfase II da meiose 
Prontos para a fecundação...
Heterogeneidade
Maturação in vitro (MIV)
• MIV é comumente realizada utilizando meio TCM 199,suplementado com hormônios (FSH, LH, E2), SFB/SCE, fatores decrescimento, cisteamina...
• Tendência mundial de utilizar meios mais definidos…
• CCOs em grupos com 500 μL de meio, em estufa de 5% CO2 em ar,a 38-39 °C por 22-27 h
Baixa reprodutibilidade, grandes variações químicas
Maturação in vitro (MIV)
O que deve ser considerado na escolha do meio?
Eficiência, simplicidade, reprodutibilidade, custo, …
Barreira em equinos
• Introdução• PIVE – etapas:
– Colheita de oócitos– Maturação in vitro (MIV)– Fecundação in vitro (FIV)– Desenvolvimento in vitro (DIV)– Qualidade embrionária• Considerações finais
• Sêmen fresco ou cong/descongelado
• Gradiente de Percoll ou Swim-up
• Cultivados em grandes grupos com 500 μL de meio (SOF/FertTALP), em estufa de 5% CO2 em ar, a 38-39 °C por 16-20 h
• [sptz] tem variado de 1 a 3,5 x 106
• Capacitação Temperatura ambiente por 1 a 3 h
Indutores de capacitação (heparina)
Fecundação in vitro (FIV) Sêmen sexado• Resultados variáveis:
– Ponchirolli et al, 2006 = 28,4%– Wilson et al., 2006 = 12,2% (vs 20,1% não sexado)– Produção de blastocitos: variação entre touros
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20
25
30
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A B C D E F
Não sexadoSexado
*
*
* * *
* Valores diferem entre sexado e não sexado (P<0,05). Avelino et al, 2007(SBTE 2007).
%
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• Introdução• PIVE – etapas:
– Colheita de oócitos– Maturação in vitro (MIV)– Fecundação in vitro (FIV)– Desenvolvimento in vitro (DIV)– Qualidade embrionária• Considerações finais
• Meios com componentes que permitam ao zigoto sofrer a transiçãomaterno-zigótica e desenvolver-se até o estádio de blastocisto
• Meio mais utilizado é o SOF, suplementado com fontes proteicas(SFB, BSA, fatores de crescimento)
• Normalmente em gotas, permitindo o confinamento embrionário.Incubação a 38-39 °C por 6-8 dias
Desenvolvimento in vitro (DIV)
Embriões
Qualidade
X
In vivo In vitro
X
Desenvolvimento in vitro (DIV)
• Introdução• PIVE – etapas:
– Colheita de oócitos– Maturação in vitro (MIV)– Fecundação in vitro (FIV)– Desenvolvimento in vitro (DIV)– Qualidade embrionária• Considerações finais
Melhor forma de assessar a qualidade embrionária
Indicadores confiáveis:• Avaliação do nível de expressão de genes específicos• Metabolismo embrionário• Cinética do desenvolvimento• Contagem de blastômeros• Resistência a criopreservação
Qualidade embrionária Desvantagens da PIVE
• Índices de prenhez abaixo dos 60%
• Distância entre o lab e o campo (TE fresco)
• Desbalance na proporçãode machos e fêmeas
• Embriões muito sensíveis ao congelamento
• Large Offspring Syndrome (LOS)
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Considerações finais
• PIVE consolidada em bovinos, uso restrito em outrasespécies, apesar do potencial para propagação eficiente defêmeas de elevado interesse
• Novos estudos utilizando meios mais definidos nasdiferentes etapas, além de investigar a qualidadeembrionária pós-transferência para receptoras
• Criopreservação dos embriões deve ser melhor estudada
OBRIGADA
joannavet@gmail.com 38