Aula de clonagem (1) (1)

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02/05/2016
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Clonagem animal e células-tronco
Profa. Joanna Maria Gonçalves de Souza-Fabjan
Histórico
 Mamíferos: camundongo - Illmensee & Hoppe (1981)
Wilmult et al. (1997): ovelha Dolly
 Rumpf et al. (2001): Vitória (Brasil/Embrapa)
Introdução e definição
• É um método clássico de reprodução assexuada (nãohá troca de gametas) de espécies de plantas ebactérias
• É um processo de reprodução assexuada que resultana obtenção de cópias geneticamente idênticas deum mesmo ser vivo – microorganismo, vegetal ouanimal
Clones naturais
Quem é? Qual sua importância?
Nasceu após 276 tentativas ..
O que são células-tronco?
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Células-tronco Pluripotentes
Pluripotentes
Totipotentes
Cienc. Cult. vol.66 no.1, 2014 Clonagem
• Sem uso transferência nuclear:
– Splitting
• Com transferência nuclear:
– Tradicional (TNCS)– Handmade cloning
Splitting
• Blastocisto (7 dias)
• Corte simétrico
• Transferência imediata
Gêmeos caprinos obtidos após bissecção do embrião
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TNCS Etapas da TNCS
• Seleção e preparo dos citoplastos receptores
• Seleção e cultivo de células doadoras de núcleo
• Reconstrução embrionária (fusão e ativação celular)
• Cultivo do embrião reconstruído
• TE para receptoras sincronizadas
Citoplastos receptores
• A fonte e a qualidade do citoplasma receptor (citoplasto) são fatores importantes para o sucesso
• Oócitos em metáfase II (MII) são mais adequados para suportar a reprogramação nuclear (maturados in vivo ou in vitro)
Citoplastos receptores
• Uso de oócitos de espécies diferentes
• Os citoplasmas obtidos de uma espéciepodem adquirir a competência necessáriapara atuarem como receptores de núcleosobtidos de uma espécie diferente
Enucleação do oócito, para utilizar oócitos como citoplastos receptores Aspiração da placa metafásica e CP
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Etapas da TNCS
• Seleção e preparo dos citoplastos receptores
• Seleção e cultivo de células doadoras de núcleo
• Reconstrução embrionária (fusão e ativação celular)
• Cultivo do embrião reconstruído
• TE para receptoras sincronizadas
Carioplasto (núcleo doador)
• Células somáticas de diferentes tecidos e idadespodem ser utilizadas com sucesso
• Modelo mais utilizado (fibroblasto pele ou músculo)
Etapas da TNCS
• Seleção e preparo dos citoplastos receptores
• Seleção e cultivo de células doadoras de núcleo
• Reconstrução embrionária (fusão e ativação celular)
• Cultivo do embrião reconstruído
• TE para receptoras sincronizadas
Reconstrução do embrião –transferência e fusão
• O carioplasto é transferido para o interior do citoplasto (espaço perivitelino)
• Eletrofusão: estimulação com um pulso elétrico (fusão das membranas adjacentes e liberação de calcio intracelular, iniciando a ativação) 
Reconstrução do embrião – ativação
• Ativação artificial
– Física (injeção de cálcio diretamente nocitoplasma)
– Química (ionomicina, ciclohexamida, 6-DMAP,...)
Efeito do intervalo entre a fusão e a ativação sobre o desenvolvimento embrionário...
Resultados conflitantes 
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Etapas da TNCS
• Seleção e preparo dos citoplastos receptores
• Seleção e cultivo de células doadoras de núcleo
• Reconstrução embrionária (fusão e ativação celular)
• Cultivo do embrião reconstruído
• TE para receptoras sincronizadas
Cultivo do embrião
• Transferência precoce para o oviduto• Cultivo in vitro até o estádio de blastocisto, como na PIVE
– Sistema de co-cultivo– Redução da tensão de oxigênio (estufa de trêsgases)
Etapas da TNCS
• Seleção e preparo dos citoplastos receptores
• Seleção e cultivo de células doadoras de núcleo
• Reconstrução embrionária (fusão e ativação celular)
• Cultivo do embrião reconstruído
• TE para receptoras sincronizadas
TE para receptoras
• Sincronismo da receptora com o estádioembrionário
• Procedimentos cirúrgicos, semicirúrgicos ou não cirúrgicos 
• Desde os estudos iniciais, a técnica não sofreugrandes transformações, especialmente em:
– Simplificar protocolos experimentais
– Redução de custos
– Melhoria da sobrevivência das crias nascidas
TNCS Handmade cloning (HMC)
• Em 2001, enucleação manual (semmicromanipulador)– Menor custo, mais simples e eficiênciasemelhante em comparação à TNCS• Princípio da técnica:– Digestão da ZP de oócitos maturados– Enucleação com microlâminas– Interação citoplasto e carioplasto (exposição afitohemaglutinina)
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Vajta et al.
• Handmade cloning (HMC)
– The HMC technique includes manual bisection ofzona-free oocytes, selection of cytoplasts bystaining, and the simultaneous fusion of thesomatic cell with two cytoplasts to produce acloned embryo.
Vajta et al., 2007
Brasileiros produzem primeira cabra clonada e transgênica da América Latina Baguisi et al., 1999
- Anti-trombina III humana
Keefer et al., 2004
- Teia de aranha (BioSteel)
a) Doadora de célula da granulosa. b) Clone de célula da granulosa da cabra doadora mostrada em a.c) Doadora de célula da granulosa. d) Clones de célula da granulosa (GC2.3, GC2.4, GC2.5 e GC 2.6)da doadora mostrada em c.
Fertilidade das receptoras
Evolução da gestação em receptoras bovinas após transferência de embriões
produzidos in vitro (G I), oriundos de células embrionárias (G II), células
somáticas fetais (G III) ou células somáticas adultas (G IV).
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Mortalidade embrionária
• Aparecimento de corrimento vaginal com sangue e/ou feto em diferentes estágios de putrefação• Desenvolvimento anormal da placenta• Falha no desenvolvimento de placentomas• Existência de genes imprinted• Hidroalantóide, placentomas maiores, aumento da espessura do cordão umbilical
Problemas de saúde neonatal
• Aumento de peso ao nascer (LOS)• Problemas na formação e funcionamento da gl.adrenal, baixos níveis de cortisol fetal, problemasrespiratórios• Infecções constantes: deficiência imunológica• Anomalias umbilicais• Pouca tolerância ao estresse• “Morte antes do nascimento” com edemageneralizado
Alguns assuntos polêmicos… 
Clonagem humana reprodutiva
• A simples possibilidade de clonar humanos tem suscitado discussões éticas, tais como:
– Por que clonar? – Quem deveria ser clonado? – Quem iria decidir? – Quem será o pai ou a mãe do clone? – O que fazer com os clones que nascerem defeituosos?
Por que a controvérsia sobre células-tronco?
Extrair as células-tronco interrompe odesenvolvimento doembrião.
CÉLULAS-TRONCO
Um embrião é uma pessoa?
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Quando inicia a vida?
É moralmente aceitável usar embriões para pesquisa?
Clonagem terapêutica
• Produzir e cultivar embriões TNCS, possibilidade de usar estascélulas - que na fase de blastocisto são pluripotentes - parafabricar diferentes tecidos• Perspectivas para futuros tratamentos, pois hoje só seconsegue cultivar células com as mesmas características dotecido do qual foram retiradas• Na clonagem para fins terapêuticos, serão gerados só tecidos,sem implantação no útero.• Vantagem: pode evitar rejeição (própria doadora)
Aprovada a utilização de células-tronco embrionárias em pesquisas
• O aprovou dia 29/05/2008 as pesquisas com células-tronco embrionárias no país. Segundo a norma, podem ser utilizados apenas os embriões que estejam congelados há três anos ou mais, mediante autorização do casal. O artigo também veta a comercialização do material biológico.
Considerações finais
• TNCS tem gerado um forte interesse dos setorescientíficos e produtivos
• Eficiência da técnica ainda é baixa
• Possibilidade de clones transgênicos
• Possibilidade de clonagem terapêutica
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Obrigada